Микробиологическая лаборатория должна включать следующие помещения:
лабораторные комнаты для проведения исследований;
застекленный бокс для выполнения работ, требующих соблюдения повышенной стерильности;
моечную, оборудованную для мытья посуды;
препараторскую, приспособленную для приготовления питательных сред, подготовки посуды для стерилизации, приготовления реактивов;
отделение для стерилизации, в котором установлены автоклавы.
Все помещения лаборатории должны иметь хорошее естественное и искусственное освещение. Поверхность столов и полы покрывают легко моющимся материалом (пластик, линолеум); в боксе, автоклавной и моечной стены и полы покрывают плиткой. Для стерилизации воздуха в помещениях лаборатории устанавливают бактерицидные лампы (БУВ-15, БУВ-30 и др.).
Оборудование: автоклавы, термостаты, шкафы сухожаровые, микроскопы, холодильники, весы технические, аппарат для микробиологического анализа воздуха помещений, прибор для подсчета колоний микроорганизмов, анаэростат для культивирования анэробных бактерий, рН-метр.
Посуда и инвентарь: петли и иглы бактериологические, шпатели Дригальского, ножницы, пинцеты, штативы, посуда лабораторная (чашки Петри, пробирки, пипетки – чаще всего на 1,0 и 0,1 см3, предметные и покровные стекла, флаконы для красок и растворов), вата, марля, фильтровальная бумага.
2.1. Методы и средства стерилизации, применяемые в микробиологической практике Стерилизация (от лат. sterilis – бесплодный) в микробиологической практике и пищевой промышленности означает уничтожение
в материалах всех вегетативных клеток микроорганизмов и их спор. Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике.
Существуют следующие способы стерилизации: Термическая стерилизация
прокаливание в пламени (фламбирование);
кипячение;
сухой жар;
насыщенный пар под давлением; Холодная стерилизация
фильтрование;
облучение; Дезинфекция.
Термическая стерилизация Фламбирование – стерилизация путем прокаливания мелких предметов в пламени спиртовки или горелки (предметные стекла, бактериологические петли, иглы, пинцеты, ланцеты и т.п.). В пламени обжигают также горлышки колб, пробирок при пересевах культур и розливе питательных сред.
Кипячение применяют для стерилизации металлических инструментов, игл, резиновых трубок. Инструменты кипятят в специальных металлических стерилизаторах с крышками в течение 30–40 мин. Однако даже весьма продолжительное кипячение не обеспечивает полной стерильности объекта, так как споры ряда анаэробных клостридий могут выдерживать кипячение в течение 3 ч.
Стерилизация сухим жаром. Стеклянную посуду (пипетки, пробирки, колбы, чашки Петри и др.) выдерживают в сухожаровом шкафу при температуре от 160 до 180 ºС в течение 1,0–1,5 ч. При такой обработке погибают вегетативные клетки и споры микроорганизмов.
Перед стерилизацией посуду моют и высушивают. Пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Пробирки заворачивают в бумагу по 10–20 штук. На колбы надевают бумажные колпачки, предохраняющие горлышко от пыли. В концы пипеток, которые берут в рот, вставляют ватные тампоны. Пипетки помещают в специальные стеклянные или металлические пеналы или заворачивают в бумагу. При работе пипетки вынимают из пенала только за верхний конец, в который вставлен тампон. Чашки Петри заворачивают в бу-
магу (каждую отдельно или по 2–3 шт.). Посуду, подготовленную для стерилизации, загружают в сушильный шкаф не слишком плотно, чтобы обеспечить равномерный ее нагрев. По окончании стерилизации шкаф отключают, но не открывают до тех пор, пока температура в нем не снизится до 100–70 ºС, чтобы предохранить посуду от растрескивания. Для сохранения стерильности посуду разворачивают непосредственно перед работой.
Стерилизация насыщенным паром под давлением – один из наиболее распространенных и эффективных методов, основанный на том, что пар, образующийся при кипячении воды, скапливается в замкнутом пространстве и повышает давление. При увеличении давления повышается температура пара (табл. 2.1).
Таблица 2.1 Соотношение показаний манометра и температуры насыщенного пара
| Показания манометра, МПа | Температура насыщенного пара, ºС | Показания манометра, МПа | Температура насыщенного пара, ºС |
|---|---|---|---|
| 0,00 | 100 | 0,15 | 128 |
| 0,05 | 112 | 0,20 | 134 |
| 0,10 | 121 | 0,30 | 144 |
В автоклавах стерилизуют питательные среды, физиологические растворы, резиновые предметы, стеклянную посуду с резиновыми пробками. Режим стерилизации (температура и продолжительность обработки) определяется составом питательной среды, значе-
нием рН. Среды, содержащие сахара, молоко, витамины, стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 15–20 мин, мясопептонные среды – при давлении 0,10 МПа в течение 20–30 мин. Время стерилизации отсчитывают от момента установления необходимого давления.
При низком значении рН некоторые вещества, входящие в состав питательной среды, в процессе стерилизации подвергаются гидролизу. Во избежание этого растворы некоторых компонентов (аминокислоты, витамины) стерилизуют отдельно и добавляют в среду после стерилизации.
Стерилизация текучим паром (дробная стерилизация) – метод, применяемый для обеспложивания питательных сред, изменяющих свой состав при воздействии температур выше 100 ºС. Сущность дробной стерилизации состоит в том, что нагревание среды проводят по 15–30 мин при температуре 100 ºС в течение трех дней подряд. После первого прогревания погибают вегетативные клетки, некоторые споры при этом сохраняются и затем прорастают. Образовавшиеся из термоустойчивых спор вегетативные формы погибают при повторном нагревании. Дробную стерилизацию проводят в аппарате Коха или в автоклаве при открытом спускном кране.
Тиндализация – дробная стерилизация материалов, легко разрушающихся при высокой температуре (сыворотки, витамины, некоторые антибиотики). Стерилизацию проводят прогреванием объекта при температуре от 60 до 65 ºС в течение 60 мин 5–6 дней подряд или при температуре 70–80 ºС в течение 3 дней.
Холодная стерилизация Фильтрование через бактериальные фильтры. Фильтрование через мелкопористые фильтры применяют в тех случаях, когда повышенная температура может резко изменить качество стерилизуемых материалов. Кроме того, стерилизация фильтрованием используется для очистки бактериальных токсинов и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.
Существуют два основных типа фильтров – глубинные и мембранные.
Глубинные фильтры состоят из волокнистых материалов. Частицы задерживаются в них в результате адсорбции и механического захвата в материале фильтра. Бактериальные фильтры изготавливаются из разного материала и с разным диаметром пор, что указывает-
ся на упаковке. Для стерилизации фильтрованием используют пластинчатые асбестовые фильтры Зейтца, свечи Шамберлана, изготовленные из каолина с примесью кварцевого песка, свечи Беркефельда из инфузорной земли и асбеста.
Мембранные фильтры имеют непрерывную структуру, они состоят из нитроклетчатки, и захват ими частиц определяется размером пор. Мембранные фильтры обозначают номерами от 1 до 5 в зависимости от диаметра пор (350–1200 нм).
Стерилизацию фильтрованием осуществляют под вакуумом с использованием вакуумного или водоструйного насоса. Перед началом работы фильтры закрепляют в специальном держателе, который соединяют с колбой Бунзена. Установку для фильтрования стерилизуют в автоклаве в течение 30–40 мин при 0,15 МПа. Мембранные и асбестовые фильтры используют однократно. Свечи Шамберлана и Беркефельда после окончания фильтрования промывают дистиллированной водой, просасывая ее в обратном направлении, и обрабатывают для повторного использования.
Стерилизация облучением. Стерилизация ультрафиолетовыми лучами применяется для уничтожения микроорганизмов в воздухе помещений, на поверхности пищевых продуктов перед их упаковкой. Ее проводят с помощью бактерицидных ламп различной мощности (длина волны 253–265 нм). Ионизирующее излучение применяют для стерилизации некоторых упаковочных материалов, используемых в пищевой промышленности.
Дезинфекция Уничтожение микроорганизмов при помощи химических веществ называется дезинфекцией (от лат. infektia – инфекция и французской отрицательной приставки des). Химические вещества применяются для уничтожения патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды – на рабочем месте, в помещениях, на рабочей одежде, руках, технологическом оборудовании и инвентаре.
К веществам, используемым с целью дезинфекции, предъявляется целый ряд требований:
они должны хорошо растворяться в воде;
в короткие сроки проявлять бактерицидное действие;
не оказывать токсического действия на человека и животных;
не вызывать порчу обеззараживаемых предметов.
Дезинфицирующие вещества подразделяют на несколько групп:
1) хлорсодержащие соединения (хлорная известь, натрия гипохлорит, хлорамин, пантоцид, хлордезинсульфохлорантин и др.);
2) соединения на основе йода и брома (йодопирин, дибромантин); 3) окислители (пероксид водорода, перманганат калия и др.); 4) фенолы и их производные (фенол, лизол, креолин, гексахлорофен);
5) соли тяжелых металлов (мертиолят натрия, сулема). Антимикробным действием обладают также кислоты и их соли (борная, салициловая), щелочи, спирты (70 %-й раствор этанола), альдегиды (формальдегид).
Выпускаются также бактерицидные мыла: феноловое, дегтярное, «Гигиена», содержащие 3–5 % гексахлорофена.
Контрольные вопросы 1. Какие методы стерилизации Вы знаете? 2. Какие методы стерилизации относятся к термическим? 3. Как подготовить лабораторную посуду для стерилизации? 4. Какие факторы определяют режим стерилизации? 5. В каких случаях используют «холодные» методы стерилизации?
6. Какие требования предъявляют к дезинфицирующим веществам?
7. Какие вещества используют для дезинфекции?
3. МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ Цель работы: получить представление о работе с чистыми культурами микроорганизмов; научиться готовить фиксированные окрашенные и прижизненные препараты микроорганизмов и препараты-отпечатки.
В практике микробиологии морфологию, биохимию и физиологию микроорганизмов изучают, используя чистые культуры микроорганизмов. Чистой культурой называют популяцию микроорганизмов, являющихся потомством одной клетки.
При работе с чистыми культурами следует соблюдать определенные условия, которые позволили бы предохранить их от загрязнения другими микроорганизмами. Все операции проводят в зоне горящей спиртовки. Мелкие предметы (предметные стекла, пинцеты, ножницы, бактериологические петли и иглы) стерилизуют – фламбируют (от нем. flamme – пламя) в пламени спиртовки. Микроорганизмы, выращенные на плотной среде, извлекают из пробирки с помощью бактериологической петли или иглы. Для взятия бульонной культуры используют стерильную пипетку или петлю.
3.1. Приготовление фиксированных окрашенных препаратов микроорганизмов Цель фиксации: убить клетки микроорганизмов и зафиксировать их на поверхности предметного стекла, чтобы они не были смыты при окрашивании и промывке водой; улучшить окраску клеток, поскольку мертвые клетки становятся более проницаемыми для красителей.
Порядок приготовления фиксированного окрашенного препарата при взятии культуры микроорганизмов, выращенных в пробирке на скошенном питательном агаре, следующий:
1. Зажечь спиртовку. 2. Взять чистое предметное стекло и профламбировать его, пронеся несколько раз сквозь пламя спиртовки.
3. Охладить стекло на столе и нанести на него каплю воды из флакона.
4. Взять пробирку с культурой в левую руку между большим и указательным пальцами и держать в наклонном положении так, чтобы было видно содержимое пробирки.
5. Взять в правую руку бактериологическую петлю, накалить докрасна проволоку в пламени спиртовки и обжечь примыкающую к проволоке часть держателя.
6. Мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижать к ладони ватную пробку, вынуть ее из пробирки и держать в таком положении, не касаясь окружающих предметов.
В н и м а н и е ! Класть пробку на стол или другие поверхности нельзя во избежание ее контаминации микроорганизмами (от лат. contaminatio – приведение в соприкосновение).
7. Края открытой пробирки обжечь в пламени спиртовки. 8. Ввести петлю в пробирку и, охладив ее о стенки пробирки, взять небольшое количество культуры с поверхности питательной среды.
В н и м а н и е ! Питательный агар нельзя нарушать петлей. 9. Снова обжечь края пробирки в пламени горелки и закрыть ее, пронося пробирку сквозь пламя и надевая ее на пробку. Пробирку с культурой поставить в штатив.
10. Извлеченный из пробирки петлей материал внести в каплю воды на предметном стекле и после аккуратного перемешивания тонким слоем равномерно распределить по поверхности стекла.
11. Оставшиеся на петле клетки микроорганизмов тщательно сжечь в пламени горелки, после чего петлю поставить на место.
12. Суспензию микроорганизмов высушить в потоке горячего воздуха над пламенем спиртовки и зафиксировать, пронося 3–4 раза над пламенем (нельзя фиксировать невысушенные мазки).
13. После охлаждения стекло положить на мостик и окрасить метиленовым синим в течение 2 мин, следя по песочным часам.
14. Краску смыть водой, препарат осушить фильтровальной бумагой, осторожно прикладывая ее к предметному стеклу.
15. На окрашенный препарат нанести каплю кедрового масла. Предметное стекло положить на предметный столик, при помощи макровинта погрузить иммерсионный объектив (90х) в масло и найти микроскопическую картину, используя для установления четкости изображения микровинт.
В н и м а н и е! Нельзя использовать микровинт для поиска изображения микробов в препарате.
3.2. Приготовление прижизненных препаратов микроорганизмов Прижизненные препараты используют для исследования микробов в живом виде с целью наблюдения их подвижности, прорастания спор, способа деления и т.д. Существуют два основных способа приготовления прижизненных препаратов микроорганизмов – «раздавленная капля» и «висячая капля».
Препарат «раздавленная капля». На чистое предметное стекло наносят из флакона каплю воды. В нее из пробирки вносят петлей небольшое количество исследуемой культуры и осторожно перемешивают, не размазывая по стеклу. Культуру, выращенную в жидкой среде (суспензию микроорганизмов), наносят на предметное стекло пипеткой.
Суспензию микроорганизмов накрывают сверху покровным стеклом так, чтобы под ним не было пузырьков воздуха, мешающих исследованию. Избыток выступившей жидкости удаляют фильтровальной бумагой, прикладывая ее к краям покровного стекла.
На покровное стекло наносят каплю кедрового масла и рассматривают препарат с иммерсионным объективом при опущенном конденсоре. Активно движущиеся бактерии проплывают через все поле зрения, меняют направления, совершают вращательные и круговые движения.
Препарат «висячая капля». Для приготовления такого препарата требуются специальное предметное стекло с лункой посередине и обычное покровное стекло. Края лунки предметного стекла смазывают вазелином. Небольшую каплю бульонной культуры микроорганизмов (суспензию) наносят на середину покровного стекла. Предметное стекло переворачивают лункой вниз и опускают ее на покровное стекло таким образом, чтобы находящаяся на нем капля суспензии приходилась на центр лунки.
Предметное стекло слегка прижимают к покровному, и стекла склеиваются. Препарат приподнимают и быстро переворачивают покровным стеклом кверху. Получается герметическая камера, в которой капля долго не высыхает. В правильно подготовленном препарате капля должна свободно свисать с покровного стекла и не соприкасаться с дном или краями лунки. На покровное стекло наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают с объективом 90х в затемненном поле зрения (при суженной диафрагме и опущенном конденсоре).
3.3. Приготовление препарата-отпечатка Препарат-отпечаток используют для изучения естественного расположения клеток микроорганизмов на поверхности субстрата или пищевого продукта. Чистое предметное стекло фламбируют и прикладывают к поверхности исследуемого продукта (мяса, рыбы, сыра и т. п.). Препарат-отпечаток фиксируют над пламенем спиртовки и окрашивают метиленовым синим или по Граму. На препарат наносят каплю кедрового масла и микроскопируют с иммерсионным объективом.
3.4. Красители и индикаторы рН, используемые в микробиологической практике Без окрашивания микроорганизмы (кроме грибов) не видны в световой микроскоп из-за их малой контрастности. В микробиологической практике окрашивание широко используют для определения формы, размеров, структуры, взаимного расположения микробов. Способы окрашивания фиксированных препаратов разделяются на простые и сложные. Для простых способов окрашивания микроорганизмов применяют основные и кислые анилиновые красители. У основных красителей хромофором (ионом, придающим окраску) является катион, у кислых – анион. Основные красители более интенсивно связываются с ядерными компонентами клетки. Кислые красители хорошо окрашивают цитоплазматические компоненты клеток.
К основным красителям относятся:
красные – нейтральный красный, фуксин основной, сафранин, тионин, пиронин, гематоксилин;
синие – метиловый синий, «Виктория»;
фиолетовые – кристаллический фиолетовый, генциан фиолетовый;
зеленые – янус зеленый, малахитовый зеленый, метиловый зеленый;
черные – индулин. К кислым красителям относятся:
красные и розовые – фуксин кислый, эозин, эритрозин;
желтые – конго, пикриновая кислота, флуоресцин;
черные – нигрозин.
При простых способах окрашивания нельзя установить структуру микробов, а также зачастую их дифференцированное отношение к красителям. Для достижения этих целей применяют сложные способы окрашивания. К сложным способам относятся метод Грама (см. раздел 7.2), выявление кислотоустойчивости по Цилю–Нельсену, определение зерен полифосфатов по Леффлеру (см. раздел 6.3), выявление спор бактерий по Цилю–Нельсену или по Пешкову (см. раздел 7.4), выявление капсул по Гинсу–Бурри (см. раздел 7.5) и др.
Индикаторы рН – органические вещества, которые реагируют на изменение активной кислотности среды изменением ее цвета. В процессе жизнедеятельности микроорганизмы изменяют кислотнощелочное соотношение среды, в которой они развиваются, поэтому индикаторы используют для регистрации этих изменений. Индикаторы, окрашенные в одной среде и бесцветные в другой, называют одноцветными, а индикаторы, имеющие разную окраску по ту и другую стороны интервала, называют двуцветными.
В микробиологии наиболее часто употребляются двуцветные индикаторы, приведенные в табл. 3.1.
Таблица 3.1 Двуцветные индикаторы
| Индикатор | рН, при котором изменяется окраска | Изменение цвета |
|---|---|---|
| Тимоловый синий (кислый) Бромфеноловый синий Бромкрезолгрюн Метиловый красный Бромкрезоловый пурпурный Бромтимоловый синий Феноловый красный Крезоловый красный Тимоловый синий (щелочной) |
1,2–2,8 3,0–4,6 3,8–5,4 4,4–6,0 5,2–6,8 6,0–7,6 6,8–8,4 7,2–8,8 8,0–9,6 |
Красный→желтый Желтый →синий Желтый →синий Красный→желтый Желтый →пурпурный Желтый →синий Желтый →красный Желтый →красный Желтый →синий |
синим. Засеянные пробирки со средой Гисса инкубируют при оптимальной температуре в течение 24 ч. Микроорганизмы расщепляют углеводы с образованием кислоты, за счет чего изменяется цвет среды: розово-красной становится среда с индикатором Андреде, желтой – среда с бромтимоловым синим.
Контрольные вопросы 1. Какие условия необходимо соблюдать при взятии чистой культуры микроорганизмов для приготовления препарата?