Цель работы: ознакомление с морфологией культурных дрожжей, используемых в пивоварении и хлебопечении, и диких дрожжей, вызывающих порчу пищевых продуктов.

Дрожжи относятся к эукариотам и являются одноклеточными микроскопическими грибами. На основании характера полового процесса или его отсутствия дрожжи относят к трем классам высших грибов – аскомицетам, базидиомицетам и дейтеромицетам.

Класс аскомицетов (Ascomycetes) включает три семейства дрожжей: Saccharomycetaceae, Schizosaccharomycetaceae и Saccharomycodaceae. Характерными признаками грибов этого класса являются половое спороношение и наличие в асках (сумках) двух, четырех или восьми аскоспор.

В пищевой и микробиологической промышленности широко используются дрожжи рода Saccharomyces из семейства Saccharomycetaceae. Сахаромицеты применяются при производстве спирта, вина, пива, кваса, хлеба, хлебопекарных дрожжей. В пивоварении используют различные штаммы дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae, в хлебопечении – дрожжи видов Saccharomyces cerevisiae и Candida milleri (ранее Saccharomyces minor).

Некоторые представители семейства Saccharomycodaceae (родов Nadsonia, Saenko) участвуют в брожении при производстве хересных и шампанских вин. Все остальные виды дрожжей являются посторонними («дикими»), контаминирующими биотехнологический процесс на разных его стадиях.

Несовершенные дрожжи класса дейтеромицетов (Deuteromycetes) – это либо анаморфы известных аскомицетовых или базидомицетовых грибов, либо виды, для которых половая стадия не установлена или она отсутствует. В этом классе выделяют семейство Сandidaceae c признаками аскомицетового аффинитета и два семейства – Cryptococcaceae (не образуют баллистоспор) и Sporobolomycetaceae (образуют баллистоспоры) – с признаками базидиомицетового аффинитета. Дрожжи родов Candida и Trichosporon способны образовывать псевдомицелий.

6.1. Характеристика некоторых видов культурных и диких дрожжей Дрожжи представляют собой одноклеточные эукариотные микроорганизмы, размножающиеся почкованием, спорообразованием или бинарным делением. Размеры клеток дрожжей, используемых в пищевой промышленности, колеблются от 3 до 6 мкм в поперечнике и от 8 до 12 мкм в длину.

Для изучения морфологии дрожжей их выращивают в стерильном солодовом сусле с концентрацией сухих веществ от 8 до 10 % или в глюкозопептонной среде при температуре 25–28 °С в течение 2–3 сут.

Форма вегетативных клеток разных видов дрожжей весьма разнообразна. Форма и размеры дрожжевых клеток зависят от вида, возраста, питательной среды, способа культивирования. Клетки дрожжей могут иметь округлую, овальную, яйцевидную, реже цилиндрическую, лимоновидную (апикулятную) форму. У несовершенных дрожжей клетки имеют более характерную форму: стреловидную (род Brettanomyces), треугольную (род Trigonopsis), серповидную (род Selenotila), колбовидную (род Schizoblastosporion). У дрожжей родов Candida и Trichosporon наряду с округлыми и овальными клетками в препарате встречаются длинные клетки псевдомицелия.

Культурные дрожжи Вид Saccharomyces cerevisiae (рис. 6.1). Морфологические признаки. Клетки дрожжей данного вида имеют овальную, округлую, яйцевидную или слегка удлиненную форму размером (5–6)×(9–14) мкм. Цитологические особенности дрожжевой клетки могут существенно изменяться в зависимости от ее возраста. Новая молодая клетка развивается либо из споры при ее прорастании, либо образуется вегетативно при почковании.

М о л о д ы е активные клетки дрожжей (12–18-часовая культура) при микроскопировании имеют тонкую прозрачную оболочку и гомогенную, без видимых включений, цитоплазму, небольшую вакуоль. Иногда в цитоплазме встречаются одно–два зернышка полифосфатов. Молодые дрожжи интенсивно размножаются, при этом доля почкующихся клеток может достигать 70–80 %.

Рис. 6.1. Дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae:

а – молодые клетки; б – зрелые; в – старые З р е л ы е дрожжи (24–48-часовая культура) имеют зернистую неоднородную или гетерогенную цитоплазму. Количество клеток с вакуолями увеличивается, иногда обнаруживаются клетки с двумя и более вакуолями. Процесс размножения дрожжей замедляется; процент почкующихся клеток составляет в среднем 10–15 %. Внутри клетки появляются жировые включения, которые хорошо видны без специального окрашивания при полузакрытой диафрагме. В зрелых дрожжах встречается до 2–4 % мертвых клеток, которые выявляются с помощью прижизненного окрашивания суспензии дрожжей слабым раствором метиленового голубого. Метиленовый голубой проникает в цитоплазму только через оболочку мертвых клеток, в результате чего они окрашиваются в голубой цвет, тогда как живые клетки остаются бесцветными. Доля запасных веществ – липидов, гликогена – возрастает по мере роста клетки. Для зрелой культуры дрожжей характерно наличие в клетках большого количества гликогена. Он откладывается в вакуолях как резервное вещество и расходуется по мере старения клетки. При культивировании дрожжей на богатых углеводами средах без аэрации количество клеток с гликогеном составляет 65–70 %, что свидетельствует об «упитанности» и зрелости дрожжей. Гликоген выявляют путем окра-

шивания прижизненных препаратов дрожжей раствором йода. Наряду с гликогеном в зрелых дрожжах накапливается еще одно резервное вещество – метахроматин (волютин), который окрашивается в краснофиолетовый цвет при окрашивании фиксированного препарата дрожжей метиленовым голубым.

С т а р ы е дрожжи (48 ч и более) имеют утолщенную оболочку, которая хорошо видна при микроскопировании. Цитоплазма зернистая, гетерогенная, вакуоли крупные, по нескольку в одной клетке. В популяции старой культуры присутствует большое количество клеток, содержащих липиды в виде круглых, резко преломляющих свет включений. Характерным признаком старой культуры является наличие значительного количества мертвых клеток.

Существенные цитологические изменения происходят при изменении условий культивирования: переходе от аэробного процесса к анаэробному, замене состава среды и концентрации лимитирующих веществ, а также при стрессовых физиологических воздействиях.

В аэробных условиях дрожжи интенсивно размножаются, клетки более мелкие и однородные, митохондрии в них активно делятся, число их заметно возрастает.

В условиях анаэробного брожения митохондрии объединяются, в клетках накапливается больше гликогена, и он выглядит в виде крупных гранул.

Культуральные признаки. Колонии на сусло-агаре белые, круглой формы, с ровными краями и выпуклым центром, с гладкой тускло-блестящей поверхностью, диаметром 0,5–1,0 см. При росте на жидком солодовом сусле дрожжи этого вида образуют небольшой осадок желтовато-белого цвета.

Вид Сandida milleri (ранее Saccharomyces minor). Дрожжи этого вида являются специфическими для ржаного теста.

Морфологические признаки. Клетки мелкие, круглые, диаметром 1,5–3,0 мкм с характерным почкованием: почки располагаются на одном из концов клетки. При выращивании дрожжей в жидкой среде почки образуются на обоих концах клеток или по две почки на одном конце.

Культуральные признаки. На сусло-агаре вырастают мелкие серовато-белые колонии с ровными краями и приподнятым центром, диаметром от 0,4 до 0,8 см. Поверхность колоний гладкая, блестящая. В солодовом сусле образуют небольшой осадок серовато-белого цвета, который при взбалтывании легко взмучивается.

Дрожжи, вызывающие порчу пищевых продуктов Наряду с культурными дрожжами в биотехнологических процессах могут встречаться так называемые «дикие» дрожжи, которые конкурируют с культурными за питательные вещества субстрата и вызывают порчу или ухудшение органолептических показателей готового продукта. Чаще всего среди «диких» встречаются дрожжи родов Saccharomyces, Kloecera, Саndida, Torulopsis, Pichia, Hansenula, Brettanomyces, Rhodotorula и некоторые другие.

Вид Saccharomyces pastоrianus (рис. 6.2, а) – клетки эллипсовидные или колбасовидные, реже овальной формы. Не оседают с культурными дрожжами при главном брожении пива, при их размножении пиво мутнеет, плохо осветляется, приобретает неприятный запах, терпко-горький привкус.

Вид Saccharomyces turbidans (рис. 6.2, б) – клетки овальной или эллипсовидной формы, часто соединяются в цепочки по 4–5 клеток. В пиве вызывают сильную муть, порчу вкуса.

Вид Kloecera apiculata (рис. 6.2, в) – клетки мелкие, лимоновидные, заостренные на одном или двух полюсах, располагаются одиночно, реже парами. При старении приобретают вытянутую веретенообразную форму. Размеры клеток (5–8)×(2–4) мкм. При развитии в пиве накапливают летучие кислоты, эфиры и сероводород, придавая продукту неприятный специфический запах.

Вид Saccharomyces bayanus (рис. 6.2, г) – клетки крупные, овальные. Обнаруживаются в пиве, сидре, виноматериалах. Они придают готовому продукту неприемлемые вкус и запах в связи с образованием значительных количеств эфиров, диацетила, уксусной кислоты, серосодержащих летучих кислот.

Saccharomyces validus (рис. 6.2, д) – клетки овальные или сильно удлиненные, располагаются попарно или небольшими скоплениями. Вызывают помутнение пива и неприятный специфический запах.

Вид Hansenula аnomalia (рис 6.2, е) – клетки круглые, эллипсовидные, иногда колбасовидные или булавовидные. Дрожжи рода Hansenula образуют большое количество спиртов и эфиров, придавая пиву резкий запах. Подавляют развитие культурных дрожжей.

Вид Pichia farinosa (рис. 6.2, ж) – клетки округлые, овальные, располагаются одиночно или соединены в пары. Размеры клеток (4,0–7,5)×(3–6) мкм. Дрожжи этого вида, а также вида P. membranifaciens образуют на поверхности пива белую пленку. Накапливают

в продукте альдегиды, эфиры, летучие кислоты, придающие пиву фруктовый или лекарственный привкус. При доступе воздуха во время розлива размножаются и вызывают помутнение пива.

Рис. 6.2 (а – г). Некоторые представители диких дрожжей (Т.П. Слюсаренко, 1984):

а – Saccharomyces pastorianus; б – Saccharomyces turbidans;

в – Kloecera apiculata; г – Saccharomyces bayanus Вид Brettanomyces bruxellensis (рис. 6.2, з) – клетки имеют разную форму: овальную, сильно удлиненную, палочковидную, иногда со стрельчато-заостренными концами. B. bruxellensis контаминируют сусло и пиво. Развитие этих дрожжей сопровождается появлением в пиве постороннего фруктового запаха и помутнения. Другие

виды (B. anomalus, B. intermedius) вызывают порчу пастеризованного пива, придавая ему специфический неприятный запах.

Рис. 6.2 (д – к). Некоторые представители диких дрожжей (Т.П. Слюсаренко, 1984):

д – Saccharomyces validus; e – Hansenula anomalia; ж – Pichia farinose; з – Brettanomyces bruxellensis; и – Candida mycoderma; к – Torulopsis colliculosa

Род Candida. Основные представители этого рода – C. mycoderma (рис. 6.2, и), C. utilis, C. krusei, C. guillermondii – имеют клетки овальные или удлиненно-цилиндрические. Размеры клеток (4–16)×(2–5) мкм. Дрожжи этого рода не образуют спор и являются аспорогенными. Многие представители этого рода являются вредителями в производстве вина, пива, пекарских дрожжей. На поверхности сусла и пива часто образуют плотную белую или сероватую сухую пленку. Вызывают помутнение пива, придают ему неприятный вкус и запах.

В процессе накопления биомассы при производстве пекарских дрожжей дрожжи рода Candida конкурируют с культурными дрожжами за питательные вещества субстрата, снижают мальтазную активность готовых дрожжей.

Род Torulopsis. Клетки дрожжей рода торулопсис мелкие, округлые или овальные, размерами (5–8)×(2–5). Дрожжи этого рода часто выделяют из кефирных грибков (Torulopsis kefiri). Дрожжи вида Torulopsis colliculosa (рис. 6.2, к) являются вредителями пивоваренного и дрожжевого производства.

Вид Rhodotorula roseum – клетки округлые или овальные, одиночные, соединенные в пары, псевдомицелия не образуют. Размеры клеток (5–8)×(2,5–5,0) мкм. На питательном агаре R. roseum образует круглые блестящие колонии розового цвета. При размножении на поверхности пищевых продуктов вызывают их пигментацию.

6.2. Определение содержания мертвых и почкующихся клеток в суспензии дрожжей Морфологическое состояние дрожжей определяют путем микроскопирования. С этой целью проводят подсчет числа почкующихся и мертвых клеток.

Определение количества мертвых клеток. Содержание мертвых клеток – важный показатель качества пивных и пекарских дрожжей. В дрожжах хорошего качества должно содержаться не более 5 % мертвых клеток. Увеличение количества мертвых клеток указывает на наличие неблагоприятных факторов при выращивании дрожжей. При значительном количестве мертвых клеток возможны нарушения технологического процесса: медленное брожение, развитие посторонних видов микроорганизмов.

При определении количества мертвых клеток дрожжей, культивируемых на неокрашенных питательных средах, удобно окрашивать их метиленовым голубым. Для этого готовят раствор красителя на дистиллированной воде в разведении 1:10000. Препарат готовят следующим образом: на предметное стекло наносят каплю исследуемой культуры, добавляют в нее каплю раствора метиленового голубого и накрывают покровным стеклом. На покровное стекло наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют с увеличением 90х. Мертвые клетки окрашиваются в голубой цвет, а живые остаются бесцветными. В 10 полях зрения приготовленного препарата подсчитывают число мертвых клеток (В).

Определение количества почкующихся клеток. На предметное стекло наносят каплю исследуемой суспензии дрожжей, добавляют каплю метиленового синего, размешивают и накрывают покровным стеклом. Рассматривают с объективом 60х или 90х. В поле зрения препарата общее число не должно превышать 30–40. В каждом поле зрения подсчитывают число почкующихся клеток (С) и общее число клеток (А). Почкой считают клетку, которая по величине не превосходит 1/2 материнской клетки. Клетку с почкой, размер которой меньше 1/3 материнской, считают за одну. При активном размножении дрожжей число почкующихся клеток достигает 50 % и более. Малое количество почкующихся форм указывает на низкую активность размножения дрожжей. Подсчет общего количества и почкующихся клеток проводят не менее чем в 10 полях зрения.

Результаты опыта заносят в табл. 6.1 и рассчитывают процентное содержание мертвых и почкующихся клеток в исследуемой суспензии дрожжей.

Таблица 6.1

Результаты подсчета клеток дрожжей в 10 полях зрения

Содержание мертвых клеток в исследуемой суспензии дрожжей:

Х = В/А 100, %. Содержание почкующихся клеток в исследуемой суспензии дрожжей:

Y = С/А 100, %. 6.3. Окрашивание запасных питательных веществ, содержащихся в дрожжевых клетках Окрашивание гликогена. В молодых культурах дрожжей откладывается большое количество запасного питательного вещества – гликогена. В нормально «упитанных» дрожжах от 70 до 75 % клеток содержат гликоген. Меньшее количество клеток с гликогеном в производственных дрожжах свидетельствует о старости дрожжевых клеток или о недостаточном их питании.

Для обнаружения гликогена на предметное стекло наносят пипеткой каплю суспензии дрожжей, добавляют небольшое количество раствора йода. Суспензию накрывают покровным стеклом, на него наносят каплю кедрового масла и рассматривают препарат с иммерсионным объективом. Гликоген окрашивается в красно-бурый цвет, клетки дрожжей бесцветны.

Окрашивание липидов. В старых культурах дрожжей обычно накапливается большое количество липидов. Синтез липидов у дрожжей сахаромицетов имеет место при избытке углеводного питания, интенсивной аэрации и отсутствии азота в питательной среде. Липиды синтезируются также при наличии ингибиторов в среде.

1-й метод. Для окрашивания липидов на предметное стекло пипеткой наносят каплю суспензии дрожжей, в нее добавляют каплю спиртового раствора краски Судан III и накрывают покровным стеклом. На стекло палочкой наносят кедровое масло и микроскопируют с объективом 90х. Капли жира окрашены в желтый цвет, а клетки дрожжей бесцветны.

2-й метод. На предметное стекло наносят небольшую каплю 40 %-го раствора формалина. Петлей в каплю вносят культуру

дрожжей. Формалин убивает клетки и делает оболочку более проницаемой. Через 5 мин добавляют небольшую каплю метиленового синего, еще через 10 мин – каплю Судана III. Препарат накрывают покровным стеклом, избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионным объективом. Цитоплазма окрашивается в синий цвет, а капельки жира – в розовооранжевый.

Окрашивание полифосфатов по Леффлеру. Полифосфаты часто называют также метахроматиновыми зернами или зернами волютина. Для обнаружения полифосфатов готовят фиксированный препарат дрожжей и окрашивают его метиленовым синим. В вакуолях полифосфаты окрашены в красно-фиолетовый цвет. Цитоплазма дрожжевых клеток окрашивается в голубой цвет.

6.4. Спорообразование у дрожжей Аскоспорогенные дрожжи в неблагоприятных условиях могут образовывать аскоспоры. Для спорообразования необходимы определенные условия:

• молодой возраст культуры (предварительное выращивание на богатых средах в течение 1–2 суток;
• высев активно растущих дрожжей на голодные среды (среда Городковой);
• инкубация на голодной среде в течение 2–4 недель при температуре несколько ниже оптимальной (20–25 ºС) при еженедельном микроскопировании.

В дрожжевой клетке или в аске образуется от 1 до 8 аскоспор. Окрашивание спор дрожжей. Для окрашивания спор берут культуру дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae, выращенную предварительно в течение 2 недель на среде Городковой. Готовят фиксированный препарат, заливают его карболовым фуксином Циля и нагревают в течение 2–3 мин в пламени спиртовки до появления паров. Затем препарат обесцвечивают, погружая его в 2 %-й раствор молочной кислоты или в 95 %-й этанол, содержащий 1 % концентрированной соляной кислоты. Препарат промывают водой и докрашивают в течение 3–5 мин 1 %-м раствором метиленового синего, после чего снова промывают водой и осушают фильтровальной бумагой. На препарат наносят иммерсионное масло и рассматривают с объективом 90х.

Зрелые аскоспоры окрашиваются в красный цвет, вегетативные клетки – в синий.

Среда Городковой для образования аскоспор содержит в 1 л водопроводной воды (г): пептон –10, хлорид натрия – 5,0; глюкоза – 1,0; агар – 20. Устанавливают рН среды 7,3 и стерилизуют в течение 15 мин при давлении 0,1 МПа.

Контрольные вопросы 1. Какие виды дрожжей используют в производстве пива, вина, хлеба?

2. Какие виды дрожжей являются вредителями пивоваренного и хлебопекарного производств?

3. Каковы морфологические признаки молодых, старых и мертвых клеток дрожжей?

4. Какие запасные питательные вещества содержатся в цитоплазме дрожжевых клеток? Как их можно обнаружить?

5. При каких условиях дрожжи образуют споры?

7. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИЙ Цель работы: ознакомиться с морфологией бактерий. При определении вида бактерий (идентификации) используют совокупность признаков, в том числе морфологических (от греч. morphus – форма), к которым относятся форма и размеры клеток, окрашивание по Граму, подвижность (наличие или отсутствие жгутиков), способность образовывать эндоспоры и капсулы.

7.1. Формы бактерий По внешнему виду различают три основные формы бактерий: шаровидные (кокки), палочковидные (цилиндрические) и извитые (рис. 7.1). Среди извитых форм бактерий встречаются возбудители инфекционных заболеваний, поэтому они являются объектами изучения медицинской микробиологии.

Шаровидные бактерии имеют форму правильного шара, но некоторые из них по форме напоминают свечу, ланцет, бобы, кофейное зерно. В зависимости от расположения клеток (после деления) кокки подразделяют на:

м и к р о к о к к и (от греч. micros – малый) – одиночные или беспорядочно расположенные клетки;

д и п л о к о к к и (от греч. diplos – двойной) – располагаются парами, так как клетки после деления не расходятся (лактококки);

с т р е п т о к о к к и (от греч. streptos – витой, плетеный) – клетки округлой или вытянутой формы, составляющие цепочку вследствие деления клеток в одной плоскости и сохранения связи между ними;

т е т р а к о к к и (от греч. tetra – четыре) – сочетания по четыре кокка;

с а р ц и н ы (от лат. sarcinо – соединяю) – пакеты кокков, образующиеся при делении их в трех взаимно перпендикулярных плоскостях и состоящие из 8 или более клеток;

с т а ф и л о к о к к и (от греч. staphyle – виноградная гроздь) – скопления клеток, напоминающие гроздья винограда в результате деления в разных плоскостях;

г о н о к о к к и (возбудители гонореи) имеют форму кофейных зерен, соединенных по два и обращенных друг к другу вогнутыми сторонами;

п н е в м о к о к к и и м е н и н г о к о к к и по форме напоминают пламя свечи и располагаются попарно широкими основаниями вовнутрь.

Рис. 7.1. Основные формы бактерий (Воробьев и др., 1994): 1 – стафилококки; 2 – стрептококки; 3 – сарцина; 4 – гонококки; 5 – пневмококки; 6 – капсула пневмококков; 7 – коринебактерии дифтерии; 8 – клостридии; 9 – бациллы; 10 – вибрионы; 11 – спириллы; 12 – трепонемы; 13 – боррелии; 14 – лептоспиры; 15 – актиномицеты; 16 – расположение жгутиков: а – монотрихи; б – лофотрихи; в – амфитрихи; г – перитрихи

Палочковидные бактерии имеют цилиндрическую форму различной длины и диаметра и различаются также по форме концов клетки и взаимному расположению клеток. Концы палочек бывают обрезанными (сибиреязвенная палочка), заостренными (фузобактерии), закругленными (кишечная палочка), имеющими утолщения на концах и напоминающие булаву (коринебактерии дифтерии).

Палочки могут располагаться одиночно, парами, цепочками, частоколом, розеткой. Среди палочковидных бактерий встречаются виды, образующие эндоспоры – бациллы 8 (от лат. bacillus – палочка) и клостридии (от греч. closter – веретено), и не образующие спор – бактерии (псевдомонады, кишечные палочки, сальмонеллы, палочки протея и др.)

Возбудители дифтерии, относящиеся к роду коринебактерий, характеризуются наличием на концах палочек зерен полифосфатов. Палочки, образующие ветвистые формы, относят к микобактериям (микобактерии туберкулеза, актиномицеты, бифидобактерии).

Извитые бактерии. К извитым формам относятся: в и б р и о н ы (от лат. vibrio – изогнутый) – слегка изогнутые палочки, по форме напоминающие запятую (холерный вибрион);

к а м п и л о б а к т е р ы – клетки имеют изгибы, как у крыла чайки;

с п и р и л л ы – слабо извитые формы, клетки имеют 3–5 завитков;

с п и р о х е т ы – сильно извитые формы – тонкие, длинные, извитые клетки со множеством завитков. Среди спирохет встречаются виды, патогенные для человека. Это представители родов лептоспира (Leptospira), трепонема (Treponema), боррелия (Borrelia).

• 7.2. Окрашивание бактерий по Граму Все бактерии по этому признаку разделяются на две группы:
• красящиеся по Граму – грамположительные
• не красящиеся по Граму – грамотрицательные. В основе метода лежат различия в химическом составе и строении клеточной стенки бактерий.

Сущность метода основана на различии в химическом составе и строении клеточной стенки бактерий.

Техника окрашивания бактерий по Граму 1. На обезжиренное предметное стекло нанести в трех местах три капли воды и приготовить три тонких мазка разных видов бактерий: по краям контрольные (с заведомо известным отношением их к окраске по Граму), а в центре – мазок исследуемой культуры.

2. Мазки высушить и зафиксировать в пламени спиртовки. 3. Мазки окрасить в течение 1 мин генцианвиолетом (положить на предметное стекло полоску фильтровальной бумаги, пропитанной красителем, и смочить ее водой).

4. Бумажку с красителем удаляют и, не промывая препарат водой, наносят на него раствор Люголя. Выдерживают в течение 1 мин (до полного почернения мазка).

5. Препарат, не промывая водой, обрабатывают 96 %-м спиртом в течение 15–20 с, при этом предметное стекло следует непрерывно покачивать. Очень важно четко придерживаться времени обесцвечивания, так как при его превышении обесцвечиваются и грамположительные бактерии.

6. Препарат промывают водой, накладывают на него полоску фильтровальной бумаги, пропитанной фуксином Пфейфера, смачивают ее водой и окрашивают в течение 1 мин.

7. Бумажку с красителем удаляют, препарат промывают водой, осушают фильтровальной бумагой.

8. На препарат наносят кедровое масло и рассматривают с иммерсионным объективом.

После такой обработки грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные – в красный.

Грамположительными являются микрококки, стрептококки, стафилококки, бациллы, клостридии, молочнокислые бактерии. К грамотрицательным относятся кишечные палочки, сальмонеллы, бруцеллы, возбудители дизентерии, холеры, уксуснокислые бактерии, псевдомонады и др.

7.3. Обнаружение подвижности бактерий Многие виды бактерий способны к самостоятельному движению благодаря наличию у них жгутиков. Расположение жгутиков и их количество является одним из диагностических признаков при определении вида бактерий.

Для обнаружения подвижности бактерий готовят препараты «висячая капля» или «раздавленная капля», используя молодые (односуточные) бульонные культуры бактерий. При наблюдении под микроскопом в поле зрения хорошо видно активное перемещение отдельных клеток в разных направлениях и с разной скоростью.

7.4. Окрашивание спор бактерий Благодаря особенностям своего строения споры бактерий обладают высокой устойчивостью к различным неблагоприятным факторам внешней среды. При обычной обработке препарата метиленовым синим споры не окрашиваются и выглядят как бесцветные круглые, овальные или эллипсовидные тельца, хорошо преломляющие свет. Это объясняется тем, что оболочка споры обладает большой плотностью, характеризуется высоким содержанием липидов и в самой споре отсутствует свободная вода. Методы окрашивания спор основаны на применении протравливающих веществ (обычно слабых кислот, разрыхляющих оболочку споры) и дальнейшей окраске мазка красителем при нагревании. Окрасившийся протопласт споры удерживает краситель прочнее, чем цитоплазма клетки, поэтому он, в отличие от цитоплазмы, не обесцвечивается при последующей обработке кислотой. Обесцвеченную цитоплазму дополнительно окрашивают контрастным красителем.

Метод Циля –Нильсена 1. Готовят обычным способом фиксированный препарат бактерий.

2. На препарат наносят 5 %-й раствор хромовой кислоты и выдерживают в течение 5–10 мин.

3. Кислоту смывают водой, на препарат наносят полоску фильтровальной бумаги и обильно смачивают ее карболовым фуксином. Подогревают препарат над пламенем спиртовки до появления паров (не доводя до кипения), затем отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя. Эту процедуру проводят в течение 5–7 мин. Важно, чтобы краситель не испарялся и бумага не подсыхала.

4. После охлаждения предметного стекла бумагу снимают, препарат промывают водой и обрабатывают 1 %-м раствором соляной или серной кислоты в течение 15–30 с. При приготовлении препарата

спорообразующих палочек В. subtilis, B. mycoides или B. mesentericus цитоплазму клеток рекомендуется обесцвечивать в течение 16–18 с.

5. Препарат окрашивают метиленовым синим в течение 1–2 мин, затем краситель смывают, препарат осушают фильтровальной бумагой и рассматривают с иммерсионным объективом.

При такой обработке препарата споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные клетки – в синий.

Метод Пешкова 1. На приготовленный фиксированный препарат наливают метиленовый синий Леффлера и, держа стекло над пламенем, кипятят в течение 15–20 с, не допуская высыхания краски.

2. Мазок промывают водой и докрашивают 0,5 %-м раствором нейтрального красного в течение 30 с.

3. Препарат промывают водой, осушают и рассматривают с иммерсионным объективом.

При этом методе окраски споры окрашиваются в голубой или синий цвет, а цитоплазма клеток – в розовый.

Для идентификации бактерий важно выяснить тип спорообразования (бациллярный, клостридиальный или плектридиальный), расположение эндоспоры в клетке (полярное, центральное, эксцентральное), форму свободных спор (округлые, овальные, цилиндрические). Для этой цели используют двух- или трехсуточные культуры спорообразующих бактерий.

7.5. Выявление капсул у бактерий Некоторые микроорганизмы, особенно при росте на богатых углеводами средах, образуют капсулы. Наличие капсулы является диагностическим признаком при идентификации бактерий. При обычных методах окрашивания бактерий капсулы остаются бесцветными. Для выявления капсул применяют специальные методы окраски.

Окраска капсул по методу Гинса–Бурри. Жидкая черная тушь разводится дистиллированной водой в соотношении 1:10. Каплю суспензии бактерий смешивают на предметном стекле с каплей разведенной туши, тщательно размешивают и распределяют тонким слоем на поверхности стекла. Препарат высушивают на воздухе и рассматривают с иммерсионным объективом. На дымчато-темном фоне препарата бактериальные клетки окружены бесцветными капсулами.

Контрольные вопросы 1. Какие методы исследования морфологии бактерий Вам известны?

2. В чем заключается сущность и техника окраски бактерий по Граму?

3. Каковы особенности окрашивания спор бактерий? 4. Какими методами можно установить подвижность бактерий? 5. Каким методом пользуются для выявления капсул у бактерий?

8. ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И ФИЗИОЛОГОБИОХИМИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ БАКТЕРИЙ Цель работы: рассмотреть культуральные и физиологобиохимические признаки бактерий, выращенных на различных питательных средах.

8.1. Культуральные признаки бактерий Культуральные признаки бактерий выявляют по особенностям их роста на различных жидких и плотных питательных средах. Каждый вид микробов образует на плотных средах колонии определенного размера, соответствующей формы.

Колонии характеризуют по размеру, форме, профилю, контуру края, поверхности, цвету, структуре и консистенции.

Размер колонии определяется ее диаметром, в зависимости от которого различают точечные колонии – диаметр менее 1 мм, мелкие – диаметр 1–2 мм, средние – от 2 до 9 мм, крупные – 10 мм и более.

Форма колонии бывает округлой, неправильной, амебовидной, розетковидной, концентрической и т.д. (рис. 8.1).

Профиль колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Определяется профиль колонии при визуальном изучении сверху и сбоку. Различают плоские, выпуклые, кратерообразные, конусовидные, каплевидные колонии (рис. 8.2).

Край колонии определяют при рассмотрении его через лупу или в микроскоп с увеличением 8х. Различают следующие контуры края колоний: ровный, волнистый, бахромчатый, зубчатый, фестончатый, лопастной, реснитчатый, ворсинчатый, ветвистый, ризоидный и др.

Поверхность бывает гладкой или шероховатой, сухой или влажной, бороздчатой, складчатой, морщинистой, бархатистой, бугристой, с концентрическими кругами или радиально исчерченная.

Оптические свойства: прозрачная, полупрозрачная, непрозрачная, флуоресцирующая.

Цвет колонии определяется пигментом, который синтезируется данным видом микроорганизма. В зависимости от типа образуемого пигмента колонии микроорганизмов могут быть окрашены в красный, розовый, желтый, золотисто-оранжевый, желто-зеленый, синий, черный цвет.

Рис. 8.1 . Формы колоний микроорганизмов: а – круглая; б – круглая с фестончатым краем; в – круглая с валиком по краю; г, д – ризоидные; е – круглая с ризоидным краем; ж – амебовидная; з – мицелиальная; и – складчатая; к – неправильная; л – концентрическая; м – сложная

Структура колонии бывает однородной, мелко- или крупнозернистой, мучнистой, пленчатой, врастающей в агар.

Консистенция может быть пастообразной, легко снимающейся петлей, вязкой или слизистой, прилипающей и тянущейся за петлей; плотной; волокнистой; тестообразной; сметанообразной; сухой, сни-

мающейся с поверхности агара в виде упругой пленки; хрупкой, рассыпающейся при прикосновении петлей. Консистенцию колонии устанавливают, прикасаясь к ее поверхности петлей.

Рис. 8.2. Профиль колоний микроорганизмов: а – изогнутый; б – кратеровидный; в – бугристый; г – врастающий в агар; д – плоский; е – выпуклый; ж – каплевидный; з – конусовидный При посеве микроорганизмов штрихом отмечают интенсивность роста (обильный, умеренный, слабый), особенности штриха (затягивающий, ветвистый, бугристый), оптические свойства поверхности, цвет, консистенцию.

Для характеристики роста бактерий в жидких средах производят посевы культур в мясопептонный бульон или другую среду, обеспечивающую их хороший рост. Для описания роста используют 4–7-суточные культуры, выращенные в стационарных условиях. В первую очередь отмечают интенсивность роста (скудный, умеренный, обильный). Затем обращают внимание на помутнение среды (однородное, хлопьевидное, с шелковистой волнистостью), наличие пленки (толстая или тонкая, сухая или слизистая, гладкая или складчатая, кольцеобразная или сплошная). Если культура пигмента не образует, то цвет среды не изменяется, а осадок приобретает, как правило, серовато-белый или желтовато-коричневый цвет. Нередко рост микроорганизмов в жидкой среде сопровождается появлением запаха, выделением газа. Газообразование обнаруживается по появлению пузырьков или пены.

8.2. Физиолого-биохимические признаки бактерий

При изучении физиолого-биохимических признаков бактерий исследуют их отношение к кислороду, ферментативную активность, способность расщеплять различные углеводы с накоплением определенных продуктов метаболизма.

Отношение к кислороду воздуха. По отношению к кислороду воздуха микроорганизмы делят на облигатные аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы и облигатные анаэробы. Об отношении бактерий к кислороду судят по росту культуры при посеве ее уколом в столбик с питательным агаром. Аэробы развиваются в верхней части укола, анаэробы – в нижней части, а факультативные анаэробы – равномерно по всему уколу.

Среди биохимических свойств культуры наиболее важно определение их ферментативной активности.

Использование углеводов и спиртов культурами микроорганизмов определяют путем посева 0,1–0,2 см3 суспензии исследуемых клеток в пробирки с жидкой или полужидкой средой, содержащей углевод и индикатор. Для обнаружения образования газа при расщеплении углеводов в жидкую среду опускают поплавки. Набор сред с углеводами и индикатором называют «цветным» рядом Гисса. Название «цветной» ряд связано с тем, что под действием ферментов клеток одни сахара расщепляются с накоплением кислоты или щелочи, за счет чего изменяется цвет индикатора и среды, другие сахара не расщепляются, и цвет среды не изменяется. Короткий ряд Гисса включает среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и маннитом. В длинный ряд дополнительно вводят среды с арабинозой, ксилозой, рамнозой, галактозой, а также полисахариды (инулин, крахмал, декстрин) и спирты (глицерин, дульцит, инозит).

Засеянные пробирки помещают в термостат при оптимальной температуре. Результаты учитывают через 2–4 сут (для медленно растущих микроорганизмов – через 7–10 сут). Отмечают изменение цвета индикатора или отсутствие изменения цвета среды, а также появление или отсутствие газа в поплавке.

На основании полученных данных делают вывод, какие сахара ассимилирует исследуемая культура бактерий.

Протеолитическая активность. Микроорганизмы, обладающие протеолитической активностью, разжижают желатин, пептони-

зируют молоко. Для определения этого признака культуру исследуемых бактерий засевают уколом в пробирки с желатином и культивируют в течение 4–10 сут при комнатной температуре, отмечая при этом скорость разжижения и его характер: послойный, воронкообразный, пузырчатый и т.п. (рис. 8.3).

Рис. 8.3. Характер разжижения желатина протеазами исследуемых бактерий Каталазная активность. Фермент каталазу образуют многие аэробные микроорганизмы. Для проведения исследования каплю 10 %-го раствора пероксида водорода наносят на колонию микроорганизма, выросшую в течение 24 ч на плотной среде в чашке Петри. Выделение кислорода в виде пузырьков газа свидетельствует о наличии в клетках бактерий каталазы.

Характер роста в молоке. Обезжиренное молоко разводят водой в соотношении 4:1, добавляют индикатор бромкрезоловый пурпурный (2 см3 1,6 %-го спиртового раствора на 1 дм3 молока) или лакмус (10 см3 4 %-го раствора на 1 дм3 молока), разливают в пробирки емкостью 8–10 см3 и стерилизуют в автоклаве при 0,05 МПа в течение 20 мин. Пробирки с молоком засевают исследуемой культурой бактерий и культивируют 6–14 сут при оптимальной температуре. Образование кислот микроорганизмами при расщеплении лактозы отмечают по изменению цвета индикатора. Если кислота накапливается в значительном количестве, то образуется сгусток. Бактерии, обладающие активными протеазами, расщепляют казеин, вызывая пептонизацию молока.

Образование индола. Некоторые микроорганизмы обладают способностью расщеплять аминокислоту триптофан с образованием индола, что также является диагностическим признаком при определении вида бактерий. Для определения индола применяют метод Мореля. Пробирки с 8–10 см3 стерильного мясопептонного бульона с добавлением 0,01 %-го триптофана (или без него) засевают исследуемой культурой бактерий. Под ватной пробкой укрепляют полоску фильтровальной бумаги, пропитанную щавелевой кислотой. Пробирки инкубируют при оптимальной температуре в течение 24 ч. При образовании индола нижняя часть полоски окрашивается в розовый цвет.

Образование аммиака. Аммонификация белковых веществ под влиянием ферментов микроорганизмов сопровождается выделением аммиака. Эту способность бактерий устанавливают путем засева исследуемой культуры в пробирки с мясопептонным бульоном, которые инкубируют в течение 2–3 сут в термостате при температуре 37 °С. Образование аммиака определяют по изменению окраски полоски лакмусовой бумажки, укрепленной между пробкой и горлышком пробирки таким способом, чтобы полоска не касалась питательной среды. Выделение аммиака обозначается изменением цвета лакмусовой бумажки из красного в синий.

Образование сероводорода. При расщеплении микроорганизмами серосодержащих аминокислот (цистеин, метионин) образуется сероводород. Для определения образования сероводорода пробирки с мясопептонным бульоном засевают исследуемой культурой бактерий и под пробкой укрепляют полоску фильтровальной бумаги, пропитанную раствором ацетата свинца. Засеянные пробирки помещают в термостат при оптимальной температуре на 7–10 сут. Выделение сероводорода фиксируют по почернению полоски вследствие образования сернистого свинца.

На основании морфологических, культуральных и физиологобиохимических признаков выделенной культуры определяют ее видовую принадлежность, пользуясь определителем бактерий Берджи.

Исследования по идентификации бактерий оформляют в форме протокола (табл. 8.1).

В необходимых случаях проводят изучение других признаков, например, способность к восстановлению нитратов, образование оксидазы и т.д.

Таблица 8.1 Характеристика культуры по морфологическим, культуральным и физиолого-биохимическим признакам

Контрольные вопросы 1. Какие признаки используются при определении вида бактерий? 2. По каким признакам характеризуют колонии бактерий на плотной питательной среде?

3. Как характеризуется рост бактерий в жидкой среде? 4. Как выявляется протеолитическая активность бактерий? 5. Как определить способность бактерий сбраживать сахара? 6. Какие изменения могут наблюдаться при развитии бактерий в молоке и как их объяснить?

7. Какие признаки свидетельствуют об образовании бактериями аммиака, сероводорода, индола?

9. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ Цель работы: выделить из природных субстратов (капустный и огуречный рассол, растения, фрукты, рыночные кисломолочные продукты) чистые культуры мезофильных лактококков и лактобацилл и определить их свойства.

Выделение чистой культуры микроорганизмов из исследуемого материала включает три этапа:

1) получение накопительной культуры; 2) выделение чистой культуры; 3) определение чистоты выделенной культуры.

9.1. Получение накопительной культуры Накопительной называют культуру, в которой доминируют представители одной группы или даже одного вида микроорганизмов. Для получения накопительной культуры необходимо создать элективные условия, которые обеспечат преимущественное развитие выделяемой группы микроорганизмов.

Молочнокислые бактерии (МКБ) весьма требовательны к источникам питания, и не все их представители растут даже в такой богатой питательной среде, как молоко. Поскольку МКБ в отличие от других бактерий устойчивы к спирту, элективной средой для них может также служить неохмеленное сусло, содержащее 10–15 об.% этилового спирта.

С целью получения накопительной культуры мезофильных МКБ источник выделения помещают в пробирку со стерильным обезжиренным молоком и термостатируют в течение 24 ч при температуре 30±1 °С. После инкубации из свернувшегося молока готовят фиксированный окрашенный препарат, просматривают его и при наличии в микроскопической картине клеток, характерных для МКБ, используют для выделения чистой культуры. Обычно для получения накопительной культуры молочнокислых бактерий в пробирки со стерильным обезжиренным молоком делают 2–3 пассажа.

9.2. Выделение чистой культуры Для выделения чистой культуры МКБ на плотную среду методом Коха делают высев из накопительной культуры. Принцип метода

заключается в получении чистой культуры из изолированной колонии, которую считают потомством одной клетки.

С целью получения изолированных колоний МКБ в стерильном физиологическом растворе готовят десятикратные разведения накопительной культуры, после чего стерильной пипеткой наносят одну каплю соответствующего разведения этой культуры (10–3 или 10–4) на поверхность плотной питательной среды в чашке Петри (гидролизованное молоко с 1,5 % агара или сусло-агара). Материал осторожно размазывают стерильным стеклянным шпателем по всей поверхности среды. Разведение готовят с таким расчетом, чтобы в одной чашке вырастало не более 20–30 колоний. Затем этим же шпателем во второй чашке протирают поверхность плотной среды. Засеянные чашки выдерживают в термостате при температуре 30±1 °С в течение 2–3 сут, после чего рассматривают и анализируют выросшие колонии.

Внешний вид и строение колоний являются важными культуральными признаками при определении вида микроорганизмов, так как каждому виду присуща типичная форма колонии. Колонии изучают невооруженным глазом в проходящем и отраженном свете и под микроскопом при малом увеличении (8х). В проходящем свете колонии рассматривают со стороны дна чашки. Отмечают величину колоний (точечные – менее 1 мм, мелкие – 1–2 мм, средние – 2–4 мм, крупные – от 4–5 мм и более), их форму (правильная, круглая, неправильная, плоская, сферическая) и прозрачность. В отраженном свете, рассматривая колонию со стороны крышки, определяют цвет, характер поверхности (гладкая, бугристая, блестящая, матовая), профиль колонии (выпуклый, плоский, вдавленный).

Важно определить тип колонии. Различают два основных типа колоний бактериальной культуры:

а) колонии гладкие – S-тип (от англ. smooth – гладкий), характеризующиеся круглой и выпуклой формой, гладкой поверхностью, влажной консистенцией;

б) колонии шероховатые – R-тип (от англ. rough – шероховатый), характеризующиеся шероховатой поверхностью, неправильными краями, сухой консистенцией. Образуются из гладких S-форм в результате мутации.

Помимо этих двух основных типов колоний существует так называемый слизистый М-тип (от лат. mucus – слизистый), характе-

ризующийся тягучей слизистой консистенцией; образуется в процессе диссоциации бактериальных культур.

Для дальнейшей работы с чистой культурой по одной изолированной колонии МКБ пересевают в пробирки со стерилизованным обезжиренным молоком. Посевы термостатируют при оптимальной температуре в течение 18–24 ч (но не более 48 ч).

Примечание. Иногда бывает достаточно одного посева на плотную питательную среду для получения изолированных колоний. Однако чаще посев на плотную среду повторяют 2–3 раза, используя в качестве посевного материала выросшие на чашках отдельные колонии.

9.3. Определение чистоты выделенной культуры

Чистоту выделенной культуры определяют несколькими способами – визуальным, микроскопическим и высевом на ряд питательных сред.

При визуальном методе отмечают однотипный характер роста колоний на плотной среде.

Для микроскопического исследования чистоты культуры готовят фиксированные окрашенные препараты и просматривают их с иммерсионным объктивом. В микроскопическом препарате должны обнаруживаться морфологически и тинкториально однородные клетки.

Чистоту выделенной культуры МКБ проверяют также путем высева на ряд питательных сред, таких как сусло, гидролизованное молоко, питательный агар с мелом или цитратом кальция и др.

9.4. Идентификация выделенной культуры молочнокислых бактерий Идентификацию выделенных культур МКБ проводят путем изучения их морфологии, культуральных, биохимических и других признаков, присущих каждому виду.

Из рыночных кисломолочных продуктов – творога и сметаны – обычно выделяются мезофильные лактококки.

В капустном и огуречном рассоле доминирующими видами лактобацилл являются L. plantarum, L. brevis, L. fermentum, L. Buchneri.

Морфологические признаки: МКБ имеют форму клеток шаровидную или палочковидную. Шаровидные клетки располагаются одиночно, попарно (диплококки), в виде длинных или коротких цепочек. Палочки различаются по длине и толщине. МКБ грамположительны, в основном неподвижны, не образуют спор и капсул.

Культуральные и физиолого-биохимические признаки. На поверхности плотной питательной среды культуры Lactococcus lactis образуют мелкие (диаметром 1–2 мкм), каплевидные, блестящие, бесцветные колонии с ровными краями. Глубинные колонии имеют форму лодочки или чечевицы. Lactococcus cremoris образуют мелкие округлые колонии с выраженной зернистостью. Культуры Lactococcus diacetylactis на агаре с гидролизованным молоком и лимоннокислым кальцием образуют вокруг колоний зоны просветления, что свидетельствует о наличии фермента цитритазы, характерного для ароматобразующих лактококков.

С целью дифференциации лактококков от энтерококков (молочнокислых кокков кишечного происхождения) проводят ряд дополнительных тестов. В отличие от энтерококков лактококки и лейконостоки не растут в гидролизованном молоке, содержащем 6,5 % NaCl при температуре 45 ºС и при рН среды 9,5 (табл. 9.1).

Таблица 9.1 Дифференцирующие признаки лактококков и энтерококков

Предельную кислотность в молоке определяют путем титрования молока 0,1 н. раствором NaOH после ферментации его исследуемой культурой в течение 7 сут при оптимальной температуре. У лактококков предельная кислотность не превышает 115–120 ºТ, в мезофильных лактобациллах она составляет 160–180 ºТ, а в термофильных лактобациллах она может достигать 250–300 ºТ.

Молочнокислые бактерии – факультативные анаэробы. Не содержат фермента каталазы, но могут расти в присутствии кислорода воздуха.

Культуральные и биохимические признаки некоторых видов лактококков приведены в табл. 9.2.

Таблица 9.2 Основные культуральные и биохимические признаки лактококков и лейконостокков

*ВС – восстанавливает, свертывает.

Для определения принадлежности выделенных лактобактерий к группе гомо- или гетероферментативных их высевают в среду с глюкозой или лактозой и после термостатирования устанавливают наличие или отсутствие газа в поплавке.

Лактобациллы вида L. plantarum относятся к подроду стрептобактерий. Они свертывают молоко за 2–3 сут, предельная кислотность составляет 160–180 ºТ. Лактобациллы этого вида растут в гидролизованном молоке, содержащем 6 % NaCl и 20 % желчи, восстанавливают и свертывают лакмусовое молоко, не образуют аммиака из

аргинина. Глюкозу расщепляют по гексозодифосфатному пути с образованием преимущественно молочной кислоты.

Культуральные и биохимические признаки некоторых видов лактобацилл приведены в табл. 9.3.

Лактобациллы видов L. brevis, L. fermentum, L. buchneri относятся к подроду бетабактерий, вызывающих гетероферментативное молочнокислое брожение с образованием молочной и уксусной кислот, этанола и диоксида углерода.

Таблица 9.3 Основные культуральные и биохимические признаки лактобацилл

10. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО УЧЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ Число клеток микроорганизмов в единице объема или массы продукта можно определить либо непосредственным их подсчетом под микроскопом, либо путем подсчета колоний, выросших на питательных средах при посеве разведений продукта, или другими методами.

Кроме того, в микробиологической практике часто определяют биомассу – массу сухого вещества клеток, выраженную в граммах, выросшую в определенном объеме питательной среды. Непосредственный подсчет клеток проводят в счетных камерах, на фиксированных окрашенных мазках и на мембранных фильтрах. При непосредственном подсчете микроорганизмов под микроскопом учитывают как живые, так и мертвые клетки, что дает завышенные результаты о числе жизнеспособных клеток в субстрате.

10.1. Подсчет клеток микроорганизмов в камере Горяева

Цель работы: произвести подсчет клеток суспензии дрожжей в камере Горяева.

В камерах Горяева, Тома–Цейса и других можно произвести подсчет только крупных клеток микроорганизмов – дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых крупных бактерий.

Счетная камера Горяева представляет собой толстое предметное стекло, разделенное четырьмя прорезями на три поперечные площадки. Центральная площадка продольной прорезью делится пополам. На каждой половинке выгравирована сетка. Площадь квадрата сетки и глубина камеры указаны на предметном стекле и равны соответственно 1/25 (большой квадрат) и 1/400 мм2 (малый квадрат). Глубина камеры равна 0,1 или 0,2 мм.

Суспензию дрожжей перед подсчетом клеток разбавляют водой в зависимости от предполагаемой их концентрации. На поверхность сетки камеры Горяева наносят небольшую каплю исследуемой суспензии микроорганизмов, накрывают специальным шлифованным покровным стеклом и притирают его к боковым площадкам до появления так называемых Ньютоновых колец. Подсчет клеток рекомен-

дуется начинать не раньше чем через 3–5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и расположились в одной плоскости. Клетки подсчитывают с объективом 8х или 40х. Для получения достоверных результатов подсчет следует проводить в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали, при этом количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом – 10. В противном случае суспензию следует развести водопроводной водой.

Количество клеток в 1 см3 суспензии вычисляют по формуле

С = а 1000 n/h S, где С – число клеток в 1 см3 суспензии; а – среднее число клеток в квадрате сетки; 1000 мм2 = 1 см3; n – разведение исходной суспензии; h – глубина камеры в мм; S – площадь квадрата сетки в мм2.

10.2. Непосредственный подсчет клеток под микроскопом (метод Виноградского–Брида) Цель работы: произвести подсчет клеток лактобацилл в кисломолочном продукте.

Преимущество этого метода, по сравнению с учетом клеток в счетной камере, заключается в возможности подсчитывать клетки микроорганизмов малых размеров, так как подсчет проводят с использованием иммерсионного объектива.

Препарат готовят следующим образом. Хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой отмечают квадрат площадью 4 см2, и обводят его стеклографом или тушью. Готовят суспензию микроорганизмов, для чего 1 см3 кисломолочного продукта вносят в пробирку с 9 см3 физиологического раствора (n = 10). Затем на предметное стекло наносят микропипеткой строго определенный объем исследуемой суспензии микроорганизмов (обычно 0,01 или 0,02 см3). Тщательно распределяют суспензию бактериологической петлей по всей площади квадрата, отмеченного на стекле. Препарат подсушивают на воздухе, фиксируют в пламени спиртовки, окрашивают в течение 2 мин метиленовым синим, промывают водой и осушают фильтровальной бумагой. На препарат наносят каплю кедрового масла и рассматривают с иммерсионным объективом. Чтобы результат был достоверным, подсчет числа

клеток рекомендуется проводить не менее чем в 20 полях зрения. Общее количество подсчитанных клеток должно быть не менее 600. В мазке микроорганизмы распределяются неравномерно: в центре их содержится больше, чем по краям. Поэтому для получения среднего значения следует вести подсчет по диаметру мазка, смещая поле зрения от одного конца диаметра к другому.

Количество клеток в 1 см3 суспензии вычисляют по формуле

С = а S n/s V, где С – число клеток в 1 см3 суспензии; а – среднее число клеток в одном поле зрения; S – площадь приготовленного мазка (400 мм2); n – разведение исходной суспензии; s – площадь поля зрения (0,02 мм2); V – объем нанесенной на предметное стекло суспензии микроорганизмов (0,01 или 0,02 см3).

10.3. Прямой подсчет количества микроорганизмов флуоресцентным методом Флуоресцентная микроскопия основана на способности некоторых биологических объектов люминесцировать, т.е. светиться при освещении ультрафиолетовым или синим светом вследствие того, что свет люминесценции обладает большей длиной волны, чем поглощенный (правило Стокса). При этом объекты будут светиться желто-зеленым или оранжевым светом. Это собственная или первичная люминесцения. Поскольку большинство микроорганизмов не обладает собственной люминесценцией, существует несколько способов их обработки для наблюдения в люминесцентном микроскопе. Прежде всего это окрашивание их специальными красителями флуорохромами – сильно разбавленными растворами флуоресцирующих красителей. Из синтетических флуорохромов наилучшие результаты дают акридин желтый или оранжевый, корифосфин, примулин, родамин. Такой вид люминесцении в отличие от первичной носит название наведенной (вторичной).

Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычной позволяет:

• сочетать цветное изображение и контрастность объектов
• исследовать как прозрачные, так и непрозрачные живые объекты

• изучать морфологию как живых, так и мертвых клеток микроорганизмов;
• исследовать клеточные микроструктуры, избирательно поглощающие различные флуорохромы, и определять функциональноморфологические изменения клеток;
• исследовать различные жизненные процессы в динамике их развития.

Микробные клетки окрашивают акридиновым оранжевым и концентрируют их на фильтрах методом центрифугирования или фильтрования. В проходящем свете с длиной волны 450 нм живые бактерии светятся зеленым светом, а мертвые – оранжево-красным. Подсчет численности бактериальных клеток в ходе микроскопирования ведется одновременно по отдельным морфологическим признакам, что дает возможность охарактеризовать как состав сообщества, так и общую численность микроорганизмов (кл/см3) в исследуемом объекте.

Люминесцентная микроскопия широко используется в медицинской микробиологии для диагностики возбудителей туберкулеза, дифтерии, гонореи, возвратного тифа и др.

Разработан ГОСТ Р 52415–2005 Молоко натуральное коровье – сырое. Люминесцентный метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов.

В настоящее время для исследований применяют следующие модели люминесцентных микроскопов, выпускаемых отечественной промышленностью: ЛЮМАМ З–8, МЛД–2, ЕС БИМАМ Р–11, ЕС БИМАМ Р–13.

К главным недостаткам люминесцентной микроскопии относятся низкое разрешение при подсчете мелких бактериальных клеток (размером менее 1 мкм) и, следовательно, пропуск их большей части, большое напряжение зрения при подсчете мелких клеток, а также затемненные условия микроскопирования.

10.4. Метод проточной цитометрии Проточная цитометрия (ПЦ) является современной технологией быстрого оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов. Принцип метода ПЦ основан на ре-

гистрации флюоресценции и светорассеяния от каждой отдельно взятой клетки. Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцентными красителями, под давлением подается в проточную ячейку, где за счет гидродинамического фокусирования клетки, находясь в ламинарном потоке, выстраиваются в цепочку друг за другом. В момент пересечения клеткой лазерного луча высокочувствительные детекторы регистрируют интенсивность ее флюоресценции и рассеянное лазерное излучение. В ходе анализа учитывается также уровень флюоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлюоресценция). Полученный сигнал подается в компьютер, обрабатывается, и полученные данные отображаются в виде различных графиков или гистограмм. Аппарат для проведения ПЦ позволяет определять до 5–10 различных параметров клетки, таких как размер, активность ферментов, содержание белков, ДНК, липидов, антигенных веществ.

Метод ПЦ находит самое различное применение, начиная от простого подсчета клеток и определения их жизнеспособности и заканчивая более сложными исследованиями в иммунологии, онкологии, цитологии, гематологии, фармакологии.

10.5. Определение количества микроорганизмов методом мембранного фильтрования Сущность метода состоит в том, что определенный объем исследуемой пробы (питьевой воды, стойких безалкогольных напитков, пастеризованного пива) фильтруют через мембранные фильтры с размером пор от 0,15 до 0,25 мкм (см. раздел 10.3). Осевшие на фильтре микроорганизмы окрашивают и подсчитывают под микроскопом с применением окулярного сетчатого микрометра в нескольких полях зрения на определенной площади препарата. Подсчет численности бактериальных клеток в ходе микроскопирования ведется одновременно по отдельным морфологическим группам, что дает возможность охарактеризовать как состав микробного сообщества, так и (после суммирования данных) общую численность микроорганизмов в исследуемом объекте.

10.6. Определение количества микроорганизмов методом подсчета колоний (чашечный метод) Цель работы: определить количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов в пищевом продукте.

Чашечный метод широко применяется для определения численности жизнеспособных клеток микроорганизмов в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В основе метода лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Однако необходимо учитывать, что для микроорганизмов, образующих цепочки или другие скопления клеток, результаты всегда несколько занижены. Поэтому при использовании чашечного метода результат выражают не числом клеток в единице массы или объема, а количеством колониеобразующих единиц (КОЕ). В отличие от прямого подсчета клеток под микроскопом этот метод дает возможность определить только число жизнеспособных клеток.

Определение чашечным методом числа микроорганизмов включает следующие этапы: отбор проб и подготовку их к анализу, приготовление разведений микробной суспензии, посев в чашки Петри на плотную среду, инкубацию посевов при оптимальной температуре, подсчет выросших колоний и обработку результатов.

В качестве питательной среды для учета бактерий используют мясопептонный агар, на котором могут расти только сапрофитные аэробные и факультативно анаэробные бактерии, но неспособны расти строго анаэробные. Дрожжи и мицелиальные грибы обычно выращивают на сусло-агаре.

10.7. Учет живых микроорганизмов методом предельных разведений Метод предельных разведений применяется для установления количества микроорганизмов отдельных физиологических групп (молочнокислых, уксуснокислых бактерий, кишечных палочек и др.). Сущность метода состоит в том, что делается ряд десятикратных разведений исследуемого материала. Количество разведений готовится в зависимости от предполагаемого содержания бактерий в исследуе-

мом объекте таким образом, чтобы в последних разведениях данных бактерий не было. Материалом, взятым из приготовленных разведений, засевают определенное число пробирок с питательной средой. После инкубации при оптимальной температуре визуально устанавливают, в каком наименьшем количестве исследуемого материала еще находятся представители данной группы микроорганизмов.

Например, при определении количества молочнокислых бактерий в кисломолочном продукте готовят ряд его последовательных разведений от 10–1 до 10–10. Из каждого разведения в три пробирки со стерилизованным обезжиренным молоком параллельно засевают по 1 см3 суспензий. Пробирки выдерживают в термостате при оптимальной температуре в течение 18–24 ч, после чего отмечают, в каких пробирках образовался сгусток за счет накопления молочнокислыми бактериями молочной кислоты. В параллельных посевах может получиться не один и тот же результат вследствие неравномерного распределения клеток в исследуемой пробе. В дальнейшем титр определяется с помощью специальных расчетных таблиц.

Если для определения числа живых микроорганизмов используют бульонную питательную среду, то после инкубации пробирки, в которых размножились микроорганизмы, окажутся мутными, а пробирки, засеянные разведениями, в которых уже не содержалось жизнеспособных микроорганизмов, останутся прозрачными. Доля пробирок, оказавшихся мутными при посеве культуры данного разведения, зависит от числа живых клеток в неразведенной культуре. По числу мутных пробирок в группах, засеянных суспензиями трех последовательных разведений, определяют с помощью соответствующих таблиц наиболее вероятное число (НВЧ) клеток микроорганизмов.

10.8. Нефелометрический метод определения биомассы

Нефелометрический (турбидиметрический) метод определения биомассы нашел широкое применение в лабораторных микробиологических исследованиях, поскольку позволяет быстро и довольно точно определить концентрацию клеток в суспензии микроорганизмов.

Нефелометрический метод основан на рассеивании пучка света взвешенными в жидкой фазе частицами. Данный метод пригоден лишь для тех микроорганизмов, рост которых вызывает равномерное

помутнение среды и при этом не происходит образования мицелия, пленок и других скоплений. Питательная среда, в которой культивируют микроорганизмы, должна быть оптически прозрачной.

Светорассеяние, вызываемое микроорганизмами, выросшими в питательном бульоне, наиболее удобно измерять с помощью фотоэлектроколориметра (ФЭК) или спектрофотометра (СФ) при длине волны от 540 до 650 нм, при которой поглощение света данной суспензией является минимальным.

Зависимость между интенсивностью падающего света (I0) и прошедшего света I (т.е. света, не рассеянного культурой) при малых концентрациях бактерий подчиняется закону Ламберта–Бера:

I = I0 10–εlc, где ε – коэффициент экстинкции, l – толщина слоя суспензии, с –концентрация бактерий. Из этого соотношения следует:

lg(I0/I) = εlc. График зависимости lg(I0/I) от с (концентрации бактерий) имеет вид прямой, угол наклона которой определяется произведением εl. Таким образом, изменение оптической плотности, вызываемое изменением концентрации бактерий на одну единицу, зависит от толщины слоя суспензии l и свойств суспензии, характеризуемых коэффициентом ε.

При высоких концентрациях бактерий закон Ламберта–Бера теряет свою силу.

Для определения числа бактерий нефелометрическим методом строят калибровочные кривые зависимости между величиной светорассеяния и числом клеток (или сухой биомассы в единице объема среды). Для построения калибровочной кривой измеряют на ФЭК или СФ величину светорассеяния суспензии с различным содержанием клеток и в каждой из них определяют количество клеток и биомассы. Полученную зависимость выражают графически, откладывая на оси ординат показания ФЭК, а на оси абсцисс – количество клеток, содержащееся в 1 см3 суспензии, или биомассу в 1 дм3 культуральной среды. Для каждого микроорганизма необходимо строить свою калибровочную кривую.

Контрольные вопросы 1. Какие методы определения количества микроорганизмов в различных объектах вам известны?

2. С какой целью готовят серию разведений исследуемого объекта для определения общего количества микроорганизмов при использовании чашечного метода? Что такое КОЕ?

3. Все ли бактерии, находящиеся в исследуемом продукте, учитываются чашечным методом?

4. Какие питательные среды используют для определения в продукте количества бактерий и грибов (дрожжей и плесеней)?

5. Каковы достоинства и недостатки флуоресцентного метода подсчета микроорганизмов?

6. В чем заключается сущность метода проточной цитометрии? 7. На чем основан нефелометрический метод определения количества бактерий или биомассы в суспензии?