Под иммобилизацией понимают способы трансформации ферментов, обеспечивающие возможность их использования в непрерывных процессах. Необходимость в иммобилизации может возникнуть по целому ряду причин. Во-первых, иммобилизованные индивидуальные ферменты удерживаются в реакторе, в то время как растворимые ферменты обычно переходят в смесь, содержащую продукт реакции. В результате ценные ферменты необратимо теряются, и в реактор приходится вводить дополнительные количества биологического катализатора; к тому же фермент может оказаться нежелательной примесью и его придется отделять от конечного продукта реакции. Во-вторых, как мы уже упоминали в гл. 3, по сравнению с растворимыми биологическими катализаторами иммобилизованные ферменты часто сохраняют активность в течение более длительного периода (рис. 3.6). В-третьих, иммобилизованные ферменты можно локализовать в соответствии с последовательностью осуществляемых ими каталитических превращений, что будет способствовать повышению эффективности многостадийного процесса.

Указанные характеристики иммобилизованных ферментов свидетельствуют о том, что их применение целесообразно в случае переработки больших количеств субстрата и (или) в случае высокой стоимости фермента. Кроме того, возможность сконцентрировать фермент в определенном объеме и придать ему любую форму позволяет найти новые уникальные сферы приме-, нения иммобилизованных биологических катализаторов. Следующий раздел будет посвящен изучению методов иммобилизации ферментов, а затем мы рассмотрим пути применения иммобилизованных ферментов и перспективы дальнейшего промышленного использования.

4.3.1. Иммобилизация ферментов

Существует много методов иммобилизации ферментов. Как мы увидим ниже, от метода иммобилизации во многом зависят и свойства полученного биокатализатора. Таким образом, выбор конкретного способа иммобилизации зависит от целого ряда факторов и параметров каталитического процесса, в том числе от общей каталитической активности, эффективности использования катализатора, его способности подвергаться инактивации и регенерации и, конечно, от его цены. В связи с проблемой захоронения отходов производства, а также в зависимости от предполагаемой области использования получаемых продуктов следует принимать во внимание и токсичность реагентов, применяемых в реакциях синтеза иммобилизованных ферментов.

Все методы иммобилизации ферментов можно разделить на две группы: химические методы, основанные на создании ковалентных связей между ферментом и носителем, и физические методы, основанные на более слабых взаимодействиях или на включении ферментов в какую-либо оболочку или матрицу (рис. 4.5). Ферменты можно превратить в иммобилизованную форму посредством адсорбции на различных носителях (табл. 4.9); целесообразность применения этого метода иммобилизации обусловлена тем обстоятельством, что в ряде случаев катализатор удается сравнительно просто регенерировать путем десорбции отработанного фермента и адсорбции новой порции активного биокатализатора. Свойства иммобилизованного фермента определяются как свойствами фермента, так и характеристиками носителя или матрицы и методикой иммобилизации.

РИС. 4.5. Некоторые методы иммобилизации ферментов: химические (а); физические (б).

Таблица 4.9. Носители, применяемые для иммобилизации ферментов методом адсорбции, и типы взаимодействий между ферментом и носителем

Выбор носителя для химической или адсорбционной иммобилизации фермента зависит прежде всего от свойств его поверхности. Способен ли фермент адсорбироваться на этой поверхности? Есть ли у носителя функциональные группы, связывающие фермент? Если поверхность носителя не удовлетворительна в этом отношении, то можно ли химически модифицировать или иным образом трансформировать поверхность носителя, чтобы облегчить связывание фермента? В табл. 4.10 перечислены некоторые носители, используемые для иммобилизации ферментов путем создания ковалентных связей, и приведены функциональные группы, участвующие в этих связях. В качестве носителей иммобилизованных ферментов применяются также керамические материалы, стекло и оксиды ряда металлов.

Таблица 4.10. Нерастворимые носители, применяемые для ковалентного связывания ферментов
(указаны участвующие в связывании функциональные группы, расположенные на поверхности носителей)

Описание методики ковалентной иммобилизации фермента часто начинается со стадии модификации или активации поверхности носителя. В случае неорганических носителей для этой цели широко применяется силанизация, т. е. обработка поверхности кремнийорганическими реагентами (например, (CH₃CH₂O)₃Si (CH₂)₃R, где R чаще всего NH₂). Обработанный таким способом носитель содержит на поверхности аминогруппы, которые (как и аминогруппы других носителей) можно перевести в альдегидные группы конденсацией с глутаровым альдегидом или в ариламинные группы с помощью n-нитробензоил- хлорида, или в карбоксильные группы конденсацией с янтарным ангидридом. Другой способ модификации поверхности носителей основан на введении гибких, сравнительно длинных цепей (например, остатка н-пропиламина). Ввиду отсутствия пространственных препятствий последующее присоединение фермента к этим гибким группировкам позволяет в основном сохранить на- тивиую структуру фермента, что в свою очередь способствует сохранению и стабилизации его каталитической активности. С помощью подобных модификаций можно также изменять гидрофобность или гидрофильность поверхности носителя.

На рис. 4.6 суммированы типичные реакции иммобилизации ферментов с участием функциональных групп на поверхности носителей, в том числе перечисленных в табл. 4.10. Следует отметить, что каждая из указанных реакций протекает только в строго определенных условиях, в частности при заданных величинах рН, ионной силы и концентраций реагентов. Подробные сведения об условиях конкретных реакций, в том числе обширные табличные данные о различных методах иммобилизации ферментов на различных носителях, можно найти в литературе, приведенной в конце главы. Химическая природа функциональных групп на поверхности носителя определяет и функциональные группировки белка, с участием которых он образует ковалентные связи. Благодаря наличию достаточно большого числа методов поверхностной модификации носителей иммобилизацию какого-либо определенного фермента на конкретном носителе обычно можно осуществить несколькими способами. Конденсация фермента с носителем, очевидно, не должна затрагивать аминокислотные остатки, входящие в активный центр фермента или расположенные вблизи него.

РИС. 4.6. Некоторые методы ковалентного связывания ферментов с носителями (Е — фермент).

Решая вопрос о выборе носителя и способе Модификации его» свойств, нельзя забывать и о взаимодействиях между поверхностью носителя и реакционной смесью, благодаря которым непосредственно примыкающие к носителю, а, следовательно, и к. ферменту слои реакционной смеси могут существенно отличаться по своим свойствам от основного объема реакционной смеси. Например, вокруг частиц носителя с ионизированными группами образуется зона с повышенной концентрацией противоположно заряженных ионов, что в свою очередь приводит к существенному изменению зависимости наблюдаемой каталитической активности от рН жидкой фазы в сравнении с аналогичной зависимостью для ферментативной реакции в растворе (рис. 4.7). Аналогично гидрофобные или гидрофильные свойства носителя будут влиять на локальные концентрации растворенных веществ и растворителей в соответствии с их гидрофобностью (или. гидрофильностью).

РИС. 4.7. Различные зависимости каталитической активности от рН свободного фермента и фермента,
иммобилизованного на ионизированном носителе. Субстратом является этиловый эфир адетил-L-тирозина,
1 — химотрипсин (свободный); 2 — ЕМА-химотрипсин (иммобилизованный
на отрицательно заряженном носителе — сополимере этилена с метакриловой кислотой);
3 — полиорнитилхимотрипсин (иммобилизованный на положительно заряженном носителе),

Другая важная функция поверхности носителя связана с ее прямым или косвенным влиянием на молекулярное окружение фермента. В какой-то степени фермент всегда взаимодействует с поверхностью носителя на молекулярном уровне и в то же время контактирует с реакционной средой, на которую так же, как только что было показано, влияет носитель. Молекула фермента построена таким образом, что она принимает определенную конформацию и проявляет соответствующую активность только в свойственной ей природной среде. Очевидно, что путем подбора носителя для иммобилизации фермента можно попытаться как сохранить свойственное данному ферменту окружение, так и направленно изменить его с тем, чтобы повлиять на активность, а также на селективность и стабильность фермента. В настоящее время большое внимание уделяется изучению взаимодействий ферментов с их окружением на молекулярном уровне и выяснению возможности использования таких взаимодействий для углубления наших знаний о поведении ферментов в природных условиях и для оптимизации соответствующих биокаталитических процессов.

На активность и другие параметры иммобилизованного фермента оказывают влияние также физические и механические свойства носителя. Пористость носителя и распределение пор по размерам определяют количество фермента, которое может быть иммобилизовано на этом носителе, и доступность субстрата для молекул фермента, связанных с внутренними поверхностями. Механическая прочность носителя в существенной степени влияет на возможность его использования в реакторах определенных конструкций. Например, в реакторе с перемешиваемой взвесью твердого катализатора нецелесообразно использовать носители, склонные к механическому истиранию, а легко сжимаемые материалы нельзя применять в насадочных колоннах крупномасштабных производств. Важна и способность носителя к набуханию. Другие сведения о физических свойствах различных носителей, а также о способах их изучения можно найти в приведенной в конце главы литературе.

Для создания ковалентных связей между молекулами ферментов можно использовать некоторые реагенты, содержащие две (или более) функциональные группы. Из таких реагентов чаще всего применяют глутаровый альдегид, образующий межмолекулярные (и, возможно, внутримолекулярные) связи с участием аминогрупп фермента:

В качестве бифункциональных реагентов используют также бис- диазобензидин, цианурхлорид и гексаметилендиизоцианат. Сшитые поперечными связями ферменты обычно представляют собой желатинообразную массу, механические свойства которой не отвечают требованиям большинства процессов. Как показано на рис. 4.5, адсорбция фермента на носителе и последующая его сшивка бифункциональными реагентами способствуют улучшению механических свойств катализатора и облегчают доступ субстрата к ферменту.

Метод иммобилизации фермента путем его включения выгодно отличается относительной независимостью от природы фермента (и, следовательно, возможностью применения одной методики для иммобилизации различных ферментов), а также сравнительно небольшими нарушениями нативной структуры фермента. Методы включения можно разделить на две группы: к первой группе относят методы, основанные на включении фермента в полимерную матрицу, а ко второй — методы, в которых раствор фермента отделяют мембраной, проницаемой для субстратов и (или) продуктов реакции, но непроницаемой для фермента.

Чаще всего фермент иммобилизуют в трехмерной полимерной решетке полиакриламидного геля путем полимеризации акриламида в присутствии сшивающих мономеров и фермента (E) (рис. 4.8). Как указано на рисунке, инициатором полимеризации может быть персульфат калия (K₂S₂O₈), а ее ускорителем — β-диметиламинопропионитрил (DMAPN). Сообщалось, что с помощью этих реагентов можно получать гели иммобилизованных ферментов с диаметром пор от 100 до 400 нм, которые надежно удерживают многие ферменты, имеющие обычно диаметр» молекул от 300 до 2000 нм.

РИС. 4.8. Метод иммобилизации фермента путем его включения в полимер.
В данном случае полимерная матрица представляет собой полиакриламид,
сшитый поперечными связями.

В альтернативном способе иммобилизации раствор фермента отделяют мембраной таким образом, чтобы фермент постоянно» находился в объеме, ограниченном этой полупроницаемой мембраной. Биологическим прототипом этого метода иммобилизации являются лизосомы, в которых сконцентрированы гидролитические ферменты, вызывающие при попадании в цитоплазму мгновенную гибель клетки. В одном из вариантов этого способа, называемом микрокапсулированием, ферменты заключают в. крохотные капсулы диаметром до 300 мкм. Капсулы заключены в сферические мембраны с порами, через которые в любом направлении могут транспортироваться небольшие молекулы субстратов и продуктов реакции и в то же время не могут проникать ферменты и другие высокомолекулярные соединения.

Известны два метода» изготовления полупроницаемых микрокапсул. В первом методе формируют постоянную полимерную мембрану. Для этой цели на границе раздела двух фаз — органической и водной, содержащей фермент, проводят реакцию сополимеризации. Если в качестве одного из реагентов взять водонерастворимый мономер, а в качестве другого — мономер, обладающий заметной растворимостью в той и другой фазах» то их сополимеризация будет осуществляться только вблизи границы раздела фаз. Устойчивые полимерные микрокапсулы можно получить также путем коацервации, т. е. посредством выделения из раствора полимера в виде микрокапель новой жидкой фазы, обогащенной полимером. Неустойчивые микрокапсулы получают путем эмульгирования водного раствора фермента в присутствии поверхностно-активного вещества; прю этом образуются капсулы, заключенные в мембрану из поверхностно-активного вещества, которые можно затем добавлять к водному раствору субстрата.

Оба метода микрокапсулирования выгодно отличаются высокой удельной поверхностью катализатора (характерная величина составляет 2500 см² на 1 мл суспензии фермента) и возможностью повышения специфичности — иногда удается изготовить, мембраны, селективно пропускающие одни субстраты и задерживающие другие. В принципе эти методы применимы к любым ферментам. В то же время мембрана представляет собой определенное препятствие для массопередачи, поэтому «коэффициент эффективности» заключенных в микрокапсулу ферментов; может быть очень низким. Кроме того, эти методы вообще неприменимы, если размеры молекулы субстрата сравнимы с размерами молекулы фермента.

Для иммобилизации ферментов можно использовать и устройства, основанные на ультрафильтрации через полупроницаемые мембраны, которые не мешают обмену молекулами небольшого диаметра между раствором фермента и соседним раствором. На рис. 4.9 изображена принципиальная схема непрерывной ультрафильтрации, где, как и в случае микрокапсулирова- ния, фермент удерживается в определенном объеме. В то же время в отличие от метода микрокапсулирования в этом случае площадь поверхности, разделяющей два раствора, невелика, и к тому же здесь возникает опасность индуцированной потоком денатурации фермента. Скорость массообмена через мембрану довольно низка, что может лимитировать скорость всего процесса. К преимуществам метода иммобилизации ферментов с помощью полупроницаемых мембран можно отнести возможность применения практически любого фермента и смесей любых ферментов, а также высокомолекулярных или нерастворимых субстратов (по отношению к которым связанные с полимерными носителями ферменты обычно малоэффективны). Кроме того, в реакциях гидролиза полимеров через полупроницаемые мембраны проникают только низкомолекулярные соединения, а все вещества с относительно большой молекулярной массой остаются в растворе фермента. На этом принципе основан интересный метод регулирования молекулярно-массового распределения продуктов реакции на выходе из реактора.

РИС. 4.9. Локализация фермента в масштабе всего реактора.
Полупроницаемая мембрана удерживает фермент
и другие высокомолекулярные соединения в реакторе.

Изучен целый ряд вариантов принципиальной схемы, изображенной на рис. 4.9. Так, вместо реактора с перемешиванием можно использовать трубчатый реактор. Блок с одной полупроницаемой мембраной можно заменить на устройство с множеством параллельных пустотелых нитей, в котором один поток: направляется во внутреннюю полость нитей, а другой — в омывающий нити объем. Процесс ультрафильтрации и его количественную трактовку мы рассмотрим подробнее в гл. 11.

Важнейшие характеристики различных методов иммобилизации ферментов суммированы в табл. 4.11. Здесь под «ферментативной активностью» понимается собственная каталитическая активность иммобилизованных ферментов по отношению к активности тех же ферментов в растворе. В общем случае методы химической иммобилизации снижают активность ферментов, поскольку создающиеся в процессе иммобилизации ковалентные связи могут в какой-то мере нарушать третичную структуру, свойственную нативным белкам. С другой стороны, ковалентные связи обеспечивают надежное, прочное связывание фермента, а иногда снижают скорость его инактивации и изменяют специфичность в нужном направлении. Иммобилизация ферментов путем их включения или адсорбции обычно в меньшей степени сопровождается нарушением их структуры, и поэтому свойства иммобилизованных такими методами ферментов мало отличаются от их свойств в растворах. В то же время не надо забывать, что все сказанное выше относится только к собственным свойствам ферментов, а на практике в силу эффектов массопе- редачи соответствующие параметры иммобилизованного фермента могут иметь совершенно другие значения. Этот важный вопрос мы изучим подробнее в разд. 4.4. Диффузионные эффекты обычно сильнее проявляются в случае сшитых поперечными связями и включенных ферментных катализаторов и в меньшей степени—у ферментов, иммобилизованных на носителях.

Таблица 4.11. Сравнение основных характеристик различных методов иммобилизации ферментов^а

4.3.2. Промышленные процессы

Катализаторы на основе иммобилизованных ферментов уже используются в той или иной мере в ряде крупномасштабных промышленных производств. К числу наиболее важных областей применения иммобилизованных ферментов относятся производство сиропа с высоким содержанием фруктозы из кукурузного крахмала и производство L-аминокислот путем разделения рацемических смесей (состоящих из L- и D-изомеров). Кроме того, в производстве полусинтетических пенициллинов применяют иммобилизованную пенициллинацилазу. С экономической точки зрения наиболее важна первая из упомянутых областей.

Сахар (сахарозу) нельзя заменить D-глюкозой, поскольку глюкоза менее сладка. К тому же кристаллизация концентрированных растворов глюкозы может затруднить их последующую переработку и хранение. Эти осложнения в значительной мере могут быть устранены, если глюкозу частично изомеризовать во фруктозу с помощью фермента глюкозоизомеразы:

При 50 °C константа равновесия этой реакции близка к единице, и изменение температуры практически не влияет на нее, поскольку теплота реакции изомеризации составляет всего лишь около 1 ккал/моль. Поэтому продуктом реакции является смесь глюкозы и фруктозы в отношении приблизительно 1:1. Такая смесь значительно более сладка, чем чистая глюкоза, и может с успехом заменять сахар в самых различных областях, в том числе в производстве безалкогольных напитков, приготовлении различных пищевых продуктов и в хлебопекарной промышленности. Еще более сладкие смеси можно получать путем хроматографического разделения (гл. 11) продуктов изомеризации, приводящего к обогащению смеси фруктозой.

Глюкозоизомераза представляет собой внутриклеточный фермент, продуцируемый рядом микроорганизмов, из которых используются главным образом, некоторые штаммы Arthrobac- ter и Streptomyces. Необходимость дезинтеграции клеток достаточно мягкими методами, не вызывающими необратимую инактивацию фермента, приводит к существенному повышению стоимости глюкозоизомеразы по сравнению, например, с внеклеточными гидролазами. К тому же глюкозоизомераза очень чувствительна к ряду ингибиторов. Оба этих фактора предполагают целесообразность иммобилизации глюкозоизомеразы и ведения процесса в строго контролируемых условиях. Изучены различные методы иммобилизации глюкозоизомеразы, в том числе и метод, основанный на применении содержащих фермент целых жлеток, закрепленных в свою очередь в коллагене или с прмо- щью какого-либо другого флокулирующего и связывающего агента. Такой прием может служить примером еще одного подхода к иммобилизации внутриклеточных ферментов, заключающегося в иммобилизации продуцирующих этот фермент клеток (обычно обработанных с целью снижения сопротивления клеточных мембран массообмену) или лизатов таких клеток. К проблеме иммобилизации клеток мы еще вернемся в гл. 9.

РИС. 4.10. Схема vouecca производства кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы с помощью глюкозоизомеразы.

На рис. 4.10 приведена схема процесса производства кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы, основанного на использовании иммобилизованной глюкозоизомеразы. Здесь необходимость множества операций разделения и обработки промежуточных продуктов между стадиями осахаривания и изомеризации диктуется свойствами ферментных систем. Так, для повышения термической устойчивости а-амилазы, применяемой для гидролиза крахмала (обычно этот процесс проводят при температуре около 105°С), добавляют ионы кальция. Последние, однако, ингибируют глюкозоизомеразу, и поэтому их связывают ионообменными смолами прежде, чем декстрозный раствор поступит в реактор изомеризации.

Потребность в L-аминокислотах для производства пищевых продуктов и в медицинских целях постоянно возрастает. В связи с этим большое внимание уделяется разработке как микробиологических, так и химических методов получения L-аминокислот. Недостатком химических методов является рацемическая природа синтетических аминокислот. В общем случае D-изомеры не имеют питательной ценности, поэтому желательно получать только физиологически активные L-аминокислоты.

Указанная цель была достигнута в процессе, разработанном фирмой Tanabe Seiyaku Co., Ltd. (Осака, Япония), в котором впервые в промышленном масштабе применялись иммобилизованные ферменты и результаты которого были опубликованы в печати. Основой процесса является метод разделения оптических изомеров в соответствии со следующей реакцией, катализируемой ферментом аминоацилазой:

Эту реакцию осуществляют в реакторе колонного типа с иммобилизованной аминоацилазой (рис. 4.11), после чего основной продукт реакции, L-аминокислоту, отделяют от негидролизованной D-ациламинокислоты, используя их различные растворимости. Затем D-ациламинокислоту рацемизуют до DL-ациламинокислоты, которая снова поступает в колонну с аминоацилазой. Общая схема процесса приведена на рис. 4.12.

РИС. 4.11. Реакторы колонного типа с иммобилизованным ферментом, применяющиеся фирмой Tanabe Seiyaku Co., Ltd. в производстве L-амннокислот.

РИС. 4.12. Технологическая схема процесса с применением иммобилизованной аминоацилазы, реализованного фирмой Tanabe Seiyaku

Чтобы найти оптимальную форму иммобилизованного фермента для этого процесса, Шибата, Toca и их сотрудники из фирмы Tanabe Seiyaku провели обширные исследования, результаты которых частично изложены в опубликованной им в статье [16]. В табл. 4.12 суммированы их выводы о свойствах различных форм иммобилизованных ферментов. Эти данные еще раз говорят о том, что при подборе катализатора для промышленного использования помимо начальной активности необходимо учитывать и многие другие факторы. В рассматриваемом случае в конечном итоге исследователи остановились на амино- ацилазе, иммобилизованной ионными связями на DEAE-сефадексе, в силу высокой активности, простоты получения, возможности регенерации и устойчивости такого катализатора. В 1978 г. представители компании Tanabe Seiyaku сообщили, что этот катализатор используется уже более пяти лет без какого-либо механического разрушения и снижения (связывающей) активности.

Таблица 4.12. Свойства различных форм аминоацилазы (субстрат — ацетил-DL-метионин)^а

В 1983 г. было опубликовано сообщение о первом промышленном процессе с применением ферментов, иммобилизованных полупроницаемыми мембранами. В данном случае речь шла о процессе превращения N-ацетил-DL-метионина в L-метионин с помощью ацилазного фермента. Изучены возможности применения иммобилизованных ферментов во многих других химико-технологических процессах (табл. 4.13). Некоторые из этих возможностей уже реализованы в промышленности, другие находятся на стадиях разработки и внедрения.

Таблица 4.13. Применение иммобилизованных ферментов в химических процессах и потенциальные сферы их использования^а

4.3.3. Применение иммобилизованных ферментов
в медицине и химическом анализе

В настоящее время известно уже более 120 врожденных метаболических заболеваний человека; многие из этих дефектов связаны с отсутствием активности у какого-либо одного конкретного фермента, имеющегося в организме здоровых людей. Например, фенилкетонурия (болезнь, приводящая к задержке умственного развития), как полагают, вызывается недостатком фермента, превращающего фенил ал анин в тирозин. В настоящее время терапевтический способ лечения фенилкетонурии сводится к специальной диете, не содержащей фенилаланина. Альтернативным способом лечения могло бы быть введение недостающего фермента, однако фермент с такой же активностью, выделенный из животных, вызывает резкую иммунологическую реакцию организма человека. Эту проблему, возможно, удастся решить, заключив фермент в микрокапсулы, волокна или гель. Вполне вероятно, что иммобилизованный таким образом фермент уже не вызовет защитной реакции иммунной системы, и в то же время небольшие молекулы субстрата смогут контактировать с ферментом, проникая через стенки микрокапсулы, волокна или гель. Защищенные мембранами ферменты не подвергаются действию антител, но в то же время концентрация биокатализаторов на поверхности природных мембран снижаетэффективность массообмеиа, а, следовательно, и скорость утилизации субстрата.

Вариант изложенного выше подхода был положен в основу Одного из предполагаемых проектов компактной искусственной почки. Согласно этому проекту, уреазу и ионообменную смолу или активированный уголь помещают в одну микрокапсулу; образующийся в процессе разложения мочевины аммиак адсорбируется внутри микрокапсулы:

Из попыток применения иммобилизованных ферментов в мелкомасштабном производстве следует; отметить их использование для трансформаций стероидов (разд. 2.1.2). Так, например, применяемый при лечении артрита кортизол можно получать из дешевого предшественника 11-дезоксикортизола в колонне с иммобилизованной 11β-гидроксилазой, затем кортизол можно перевести в еще более ценный лекарственный препарат преднизолон в реакторе со слоем иммобилизованной Д'-дегид- рогеназы. Обратите внимание на чрезвычайно высокую специфичность этих ферментов. В настоящее время подавляющее большинство трансформаций стероидов в промышленном масштабе осуществляют микробиологическим путем.

Иммобилизованные ферменты уже сейчас широко применяются в аналитической биохимии, и сфера их использования в ближайшие годы, безусловно, еще больше расширится. Одним из примеров могут служить электроды с иммобилизованными ферментами, позволяющие осуществлять непрерывный контроль (мониторинг) за низкими концентрациями биохимически важных веществ. Так, в электроде для определения мочевины (рис. 4.13) иммобилизованная уреаза разлагает мочевину на ионы, которые могут быть обнаружены обычными электрохимическими методами. Электроды с иммобилизованными ферментами позволяют, как это показано схематически на рис. 4.14, автоматизировать стандартные биохимические анализы. Такая автоматизированная система может применяться, например, для определения концентраций глюкозы или лактата с помощью иммобилизованной глюкозооксидазы или лактатдегидрогеназы.

На таком же принципе основаны конструкции ферментных электродов, предназначенных для определения многих других биологически важных соединений (табл. 4.14). Для изучения ферментативных реакций в мембранах недавно был разработан также метод флуоримет- рии на поверхностях, позволяющий непосредственно определять концентрации различных ферментов, субстратов и кофакторов. В приведенной в конце главы литературе читатель найдет обширный дополнительный материал, детальнее освещающий эту проблему.

РИС. 4.13. Электрод для определения мочевины;
в этом электроде уреаза иммобилизована в геле,
нанесенном на поверхность стеклянного электрода.

РИС. 4.14. Схема автоматической системы для определения глюкозы (с помощью иммобилизованной глюкозооксидазы)
или лактата (с помощью иммобилизованной лактатдегидрогеназы).

Таблица 4.14. Некоторые соединения, которые можно определять
с помощью электродов с иммобилизованными ферментами.

Использование иммобилизованных биохимических соединений в аффинной хроматографии мы рассмотрим в гл. 11. Этот метод, основанный на чрезвычайно высоком сродстве определенных веществ, находящихся в растворе, к иммобилизованному соединению, позволяет выделять, очищать и анализировать ингибиторы ферментов, кофакторы, антигены, антитела и другие вещества.

4.3.4. Утилизация и регенерация кофакторов

Наряду с применением в аффинной хроматографии кофакторы представляют интерес и с точки зрения их способности обеспечивать активность ферментов. В отсутствие кофакторов только два класса ферментов из шести способны проявлять каталитическую активность. Очевидно, что для широкомасштабного промышленного использования ферментов четырех других классов необходимо располагать эффективными способами получения, разделения и выделения достаточных количеств органических кофакторов. Более того, для эффективной утилизации и регенерации коферментов необходимы специальные реакторы и каталитические установки. К настоящему времени многие из перечисленных задач еще не решены, хотя в этой области и проводятся интенсивные исследования, направленные на реализацию больших потенциальных практических и научных возможностей тщательно отработанной технологии кофакторов. Здесь мы вкратце рассмотрим только некоторые из проблем, возникающих при проектировании фермент-коферментных реакторов; более подробные сведения по вопросам применения кофакторов можно найти в соответствующей литературе, приведенной в конце главы.

Если фермент и кофермент помещены в полые волокна с полупроницаемыми стенками, через которые могут проникать и субстрат, и продукты реакции, то ферментативную реакцию можно провести без потери фермента и кофермента. На рис. 4.15 приведена схема лабораторного реактора, основанного на таком принципе. Очевидно, что при достаточной активности и стабильности каталитической системы подобная схема может быть взята за основу и при проектировании более крупномасштабного процесса. В таком реакторе, в частности, изучали протекающую <в присутствии NAD двустадийную реакцию окисления этанола:

Очевидно, что этот процесс может протекать непрерывно только при условии постоянной регенерации NAD⁺ путем окисления NADH; для этой цели в реакционную смесь, находящуюся внутри полых волокон, добавляли фермент диафоразу (из сердца свиньи). Диафораза катализирует окисление NADH кислородом, причем в процессе регенерации кофактора NAD⁺ образуется также H₂O₂. Поскольку пероксид водорода инактивирует многие ферменты, ферментную систему дополняют еще ферментом— каталазой. Понятно, что такой подход может быть распространен и на другие ферментативные реакции. В то же время если молекулярная масса субстрата близка молекулярной массе кофермента (коферментов) и ферментов, то потребуется некоторая модификация схемы. (Объясните, почему.) Если же и молекулы кофермента относительно невелики, то устранить их потерю за счет ультрафильтрации можно, например, путем ковалентного связывания с растворимым полимером типа поли- этиленгликоля, декстрана или полилизина.

РИС. 4.15. Схема лабораторного реактора с полыми полупроницаемыми волокнами, в котором осуществляется
непрерывный процесс, катализируемый фермент-коферментной системой.

Теперь рассмотрим такие катализируемые фермент-коферментной системой процессы, в которых ферменты и (или) соответствующие коферменты связаны с нерастворимыми носителями. Любой катализатор такого типа должен обеспечивать, во-первых, физический контакт фермента с коферментом и, во-вторых, возможность регенерации кофактора. Можно наметить по меньшей мере три различных подхода к решению такого типа задач.

1. Можно иммобилизовать кофермент, а фермент и все необходимые для регенерации вещества вводить в растворенном виде. Тогда в реакционной смеси на выходе из реактора будут содержаться все реагенты, за исключением кофермента.

2. Можно иммобилизовать фермент, а кофермент оставить в растворе; следовательно, он перейдет и в продукты реакции. Другие ферменты и субстраты, необходимые для регенерации кофермента, можно вводить в реактор в виде раствора. В альтернативном варианте процесс регенерации может осуществляться в отдельном реакторе, в котором также могут использоваться иммобилизованные ферменты.

3. Можно, наконец, соединить молекулы фермента и кофермента длинной гибкой цепью и затем иммобилизовать этот комплекс фермент–кофермент («кофермент на привязи»).

Первый и второй подходы были реализованы в лабораторных экспериментах, а возможности третьего подхода пока еще только изучаются. При переходе к промышленному производству выбор между первым и вторым подходами будет определяться целым рядом технологических и экономических факторов, из которых важнейшими являются легкость осуществления, эффективность и стоимость процессов выделения и повторного использования фермента, кофермента и (или) системы регенерации последнего. Если, например, повторное использование ни одного из этих компонентов реакционной смеси не представляется возможным, то первый подход может оказаться более целесообразным, поскольку большинство коферментов намного дороже любого другого компонента смеси.

Высокая эффективность процессов утилизации и регенерации кофакторов в живых клетках подсказывает принцип альтернативного подхода к разработке процессов, катализируемых фермент-коферментными системами. Этот подход заключается в иммобилизации живых клеток и последующем использовании природных систем синтеза и регенерации кофакторов. Практическая реализация этого внешне заманчивого подхода, однако, пока что была не слишком успешной. В частности, до сих, пор не решены проблемы обеспечения стабильности иммобилизованных клеток и введения необходимых фермент-коферментных систем в легкоиммобилизуемые, активные клетки. Последняя проблема в принципе может быть решена методами генетической инженерии, позволяющими внедрить в геном подходящей клетки ген, синтезирующий необходимый фермент; тогда клетка будет выполнять в основном функции хранилища кофактора и соответствующей системы его регенерации. Другое принципиальное затруднение, возникающее при работе с иммобилизованными клетками, связано с регуляцией транспорта через оболочку клетки. Точно так же, как и в случае фермент-кофермент- ной каталитической системы, иммобилизованной полупроницаемой мембраной, живая клетка должна пропускать внутрь клетки субстраты, выделять во внеклеточную среду продукты реакции и в то же время не должна терять ферменты, кофакторы и другие вещества, необходимые для нормального функционирования внутриклеточных каталитических систем.