В определенные периоды роста культур клеток в реакторах периодического действия или после возмущений в проточных реакторах непрерывного действия популяции клеток находятся в переходном состоянии, кинетика которого может оказаться весьма сложной. Для описания различных вариантов роста клеток в переходном состоянии могут потребоваться разные типы математических моделей кинетики роста. Здесь мы рассмотрим несколько примеров кинетики клеточного роста в переходном состоянии, причем основное внимание уделим наиболее общему случаю роста популяции в реакторе периодического действия. Другие аспекты кинетики роста клеток в переходном состоянии мы обсудим в ходе изучения динамики биореакторов в гл. 9.2.

7.3.1. Основные фазы роста клеток в реакторах периодического действия

Как показано на рис. 7.13, в типичном периодическом процессе число живых клеток изменяется во времени. После лагфазы (фазы задержки, латентной фазы), в течение которой численность популяции практически не изменяется, наступает период быстрого роста, когда число клеток возрастает во времени экспоненциально. Часто эту стадию роста культур клеток в реакторе периодического действия называют логарифмической фазой (лаг-фазой); мы предпочитаем более точный термин – экспоненциальный рост, который и будем использовать в последующем изложении. Понятно, что в закрытом сосуде клетки не могут размножаться бесконечно, и вслед за фазой экспоненциального роста наступает стационарная фаза. В этот момент число клеток достигает максимума. В конце концов стационарная фаза сменяется фазой отмирания, когда число клеток начинает снижаться. Здесь также часто наблюдается экспоненциальное снижение численности популяции живых организмов.

РИС. 7.13. Кривая роста культуры в реакторе периодического действия

В микробиологических процессах важную роль может играть любая из фаз. Так, при разработке процесса одной из его задач может быть сокращение до минимума продолжительности лаг-фазы и достижение максимальной длительности фазы экспоненциального роста (и скорости роста клеток в этой фазе); вторая цель в свою очередь достигается путем искусственного торможения перехода к стационарной фазе. Часто очень важно к концу процесса добиться максимальной плотности популяции клеток, что возможно только при условии учета всех переменных, влияющих на фазы роста культуры, В последующем изложении мы будем рассматривать каждую фазу отдельно и в соответствующие моменты обсудим математические модели наиболее важных явлений. Это обсуждение мы продолжим в разд. 7.3.2, где рассмотрим математические модели всего процесса клеточного роста в реакторе периодического действия.

Продолжительность лаг-фазы, наступающей после инокуляции свежей среды, зависит как от изменений в составе питательных веществ (если такие изменения имеют место), так и от возраста и массы инокулята. Сопровождающее перенос клеток из одной среды в другую резкое изменение условий может оказывать на живые клетки разностороннее действие. Во-первых, как мы уже знаем, системы контроля и регуляции ферментативной активности включают и адаптационные механизмы; в частности, сталкиваясь с новым питательным веществом, клетка начинает его усваивать только после синтеза новых ферментов. Поэтому, например, перенос находящейся в экспоненциальной фазе культуры из глюкозной среды в лактозную всегда сопровождается периодом с незначительной скоростью деления клеток; в этот период в клетках синтезируются ферменты и кофакторы, участвующие в пути метаболизма лактозы. (Что произойдет, если выращенную на лактозе культуру перенести в глюкозо-лактозную среду?) Аналогично лаг-фаза может наступить и после изменения концентраций питательных веществ. Если новая питательная среда богаче лимитирующим клеточный рост питательным веществом, то в течение некоторого времени это вещество будет расходоваться не на рост клеток, а на повышение концентраций метаболизирующих ферментов. Снижение концентрации питательного вещества может и не сопровождаться лаг-фазой; в этом случае экспоненциальный рост возобновляется сразу же после снижения концентрации, но скорость клеточного роста снижается.

Для активации многих внутриклеточных ферментов необходимы те или иные низкомолекулярные соединения (витамины, кофакторы) или ионы металлов (активаторы), которые могут проникать через клеточные мембраны. Перенос небольшого объема культуры клеток или инокулята в значительно больший объем среды вызовет обратную диффузию этих необходимых для ферментативного катализа веществ в среду, если в последней они отсутствуют или если среда резко отличается от инокулята по своей ионной силе. В таком случае опять-таки скорость роста упадет соответственно понижению концентрации активаторов в клетке, что в свою очередь, повлечет за собой лаг-фазу на период «включения» новых механизмов синтеза этих активаторов. Если в описанных процессах снижаются концентрации незаменимых активаторов (ионов и витаминов, которые не могут синтезироваться в клетке), то общий уровень клеточной активности должен снизиться необратимо.

На длительность лаг-фазы очень большое влияние оказывает фаза роста, в которой находится инокулят, полученный в свою очередь путем культивирования клеток в небольшом реакторе периодического действия. Объем инокулята также является важной переменной; в частности, как мы уже упоминали, она влияет на количество диффундирующих в среду веществ, например витаминов и активаторов. Так, перенос популяции молодых клеток в среду, богатую промежуточными метаболитами (например, аминокислотами), не сопровождается лаг-фазой; напротив, при переносе того же самого инокулята в среду с сульфатом аммония клетки будут обедняться жизненно важными промежуточными веществами за счет их транспорта в раствор. Если в момент переноса культура находится в фазе экспоненциального роста, то в среде инокулята уже должны содержаться в значительных концентрациях продукты промежуточного метаболизма, поэтому сопровождающее перенос разведение окажет меньший эффект. Перенос в аммониевосульфатную среду старой культуры (находящейся в стационарной фазе или близкой к ней) приведет к более длительной лагфазе.

Если среда содержит несколько источников углерода, то иногда можно наблюдать ряд последовательных лаг-фаз (рис. 7.14). Это явлеиие, называемое диауксией (двухфазным ростом), обусловливается изменением метаболического механизма в процессе роста. При диауксии клетки сначала усваивают один источник углерода, а затем, когда это питательное вещество истощается, клеткам приходится переключать свою активность с роста на «перестройку», необходимую для усвоения нового источника углерода. В основе такой последовательной утилизации питательных веществ, возможно, лежит явление катаболитной репрессии, рассмотренное в разд. 6.1.4.

РИС. 7.14. Если среда содержит одинаковые начальные концентрации глюкозы
и ксилозы, то в реакторе периодического действия наблюдается диауксия – двухфазный рост культуры Е. coli.

Попытки свести к минимуму время роста культуры и всего процесса обычно включали сокращение продолжительности лаг-фазы, типичной для любого периодического процесса с участием микроорганизмов. Из уже рассмотренного нами материала и ряда1 других данных (описанных в приведенной в конце главы литературе) вытекают следующие общие принципы:

1. Культура инокулята должна обладать максимальной активностью, а в момент введения в среду инокулят должен находиться в фазе экспоненциального роста.
2. Среда, в которой выращивается инокулят, по своему составу должна быть близкой к составу среды крупномасштабного микробиологического процесса.
3. Для предотвращения обусловленных диффузией потерь незаменимых промежуточных веществ и активаторов целесообразно применять инокулят большего объема (до 5–10% от объема новой среды).

К концу лаг-фазы популяция микроорганизмов приспосабливается к новым условиям. Теперь клетки могут быстро размножаться, и клеточная масса (или число живых клеток) удваивается через определенные промежутки времени. Увеличение числа клеток в этот период может быть описано уравнением

Таким образом, скорость увеличения x пропорциональна х. Интегрируя уравнения (7.35), получим

Отсюда следует, что время, необходимое для удвоения численности популяции клеток, составляет

Как и в случае роста клеток в стационарном состоянии в ПРПП, для описания популяции в ходе экспоненциального роста в периодическом процессе необходим только один параметр μ (или t̅_d). В первом приближении можно считать, что в этой фазе рост периодической культуры сбалансирован. Следовательно, путем изучения роста культуры клеток в реакторе периодического действия можно получить полезные данные о кинетике сбалансированного роста, если только это изучение ограничено фазой экспоненциального роста.

Экспоненциальный рост заканчивается, когда одна из важных переменных процесса (например, концентрация питательного вещества или токсина) достигает значения, не обеспечивающего максимальную скорость роста клеток. Истощение запасов лимитирующего рост питательного вещества может привести к очень резкому изменению скорости клеточного роста, поскольку в экспоненциальной фазе общая скорость утилизации питательного вещества возрастает очень быстро. Чтобы найти описывающее это явление приближенное математическое выражение, предположим, что до установления стационарной фазы скорость потребления питательного вещества А пропорциональна массовой концентрации живых клеток:

Допустим далее, что экспоненциальный рост продолжается до тех пор, пока не установится стационарная фаза, и что экспоненциальный рост начинается в нулевой момент времени. Тогда

X = X₀e^µt     (7.39)

где x₀ – массовая концентрация живых клеток в момент начала экспоненциального роста.

Если в нулевой момент времени концентрация А равна α₀, то из уравнений (7.38) и (7.39) следует, что А будет полностью утилизировано, когда

Здесь X_s–массовая концентрация популяции в тот момент, когда вещество А истощено и популяция переходит в стационарную фазу. Следовательно, xs представляет собой максимальную концентрацию биомассы в периодическом процессе (ср. рис. 7.13). Преобразованием уравнения (7.40) можно получить уравнение, выражающее максимальную концентрацию биомассы в момент истощения питательного вещества:

Линейная зависимость xs от начальной концентрации питательного вещества α₀ во многих случаях наблюдалась экспериментально (x₀ часто настолько мало, что им можно пренебречь). Пример такого поведения популяции клеток приведен на рис. 7.15. В то же время график зависимости n_s (численной плотности клеток в стационарной фазе) бактерии A. aerogenes от концентрации лактозы заметно отличается от зависимости, предсказываемой уравнением (7.41). Очевидно, на начало стационарной фазы и максимальную концентрацию биомассы могут влиять и другие факторы.

РИС. 7.15. Зависимость максимальной концентрации биомассы в периодическом процессе от исходной концентрации лимитирующего рост питательного вещества: а – Pseudomonas sp. во фруктозной среде; б – A. aerogenes в лактозной среде; в – A. aerogenes в среде на основе тартрата аммония.

Согласно уравнению (7.42), рост клеток прекращается только тогда, когда C_t достигает значения, равного 1/b. Разведение данной среды, содержащей токсин, или введение непитательного вещества, связывающего этот токсин, должно сопровождаться возобновлением клеточного роста и, следовательно, увеличением максимальной концентрации биомассы x_s в стационарной фазе. Если рост сдерживается истощением питательного вещества, то разведение раствором, не содержащим питательных веществ, не влияет на xs. Этими зависимостями можно пользоваться в качестве критериев для предварительной оценки причин снижения скорости и прекращения клеточного роста. Более точные критерии сформулировать труднее, поскольку, как мы увидим позднее, рост популяции клеток в условиях истощения основного питательного вещества замедляется несколько раньше, чем это вещество полностью утилизируется, а скорость роста клеток в присутствии токсина может стать неизмеримо малой задолго до того момента, когда dx/dt станет равным нулю.

На рис. 7.16 изображена предсказываемая теорией зависимость максимальной концентрации биомассы от исходной концентрации данного питательного вещества. Постепенное снижение концентрации питательного вещества в конце концов приводит к линейно» зависимости максимальной концентрации биомассы от начальной концентрации питательного вещества. В этом случае отсутствие фазы экспоненциального роста, очевидно, вызвано недостатком питательного вещества. Напротив, повышение начальной концентрации питательного вещества может привести к тому, что величина x_s в конце концов перестанет быть зависимой от а₀; возможно, это объясняется накоплением токсичных веществ или влиянием другого лимитирующего клеточный рост питательного вещества.

РИС. 7.16. Взаимосвязь между начальной концентрацией питательного вещества и максимальной концентрацией биомассы в периодической культуре. При высоких концентрациях питательных веществ, когда они не определяют максимальную концентрацию биомассы, фактором, лимитирующим концентрацию, может стать накопление токсичных веществ.

Изучая всю популяцию, мы не должны забывать о судьбе индивидуальных клеток. В общем случае популяции всегданегомогенны, и кривая роста популяции в периодическом процессе отражает лишь некоторый усредненный параметр чрезвычайно сложной системы. Во время фазы экспоненциального роста, например, некоторые клетки делятся и порождают новые, молодые клетки, а другие в тот же самый момент растут и созревают. Поскольку клетки разного возраста обычно имеют различные размеры и химический состав, мы можем рассматривать клетки одного возраста как некоторое «вещество». С этой точки зрения рост одного вида микроорганизма приводит к популяции, содержащей множество различных «веществ».

Гетерогенность популяции становится особенно заметной в стационарной фазе и фазе отмирания. Так, в стационарной фазе некоторые клетки делятся, а некоторые погибают. Мертвые клетки часто подвергаются лизису (разрушению и растворению); в результате углеводы, аминокислоты и другие компоненты клеток попадают в среду и становятся питательными веществами для живых членов популяции. Такой каннибализм способствует сохранению массы популяции в стационарной фазе. В конце концов, однако, истощение питательных веществ и накопление токсинов приводит к тому, что популяция не может поддерживать далее свое существование и наступает фаза отмирания.

Фазе отмирания было посвящено сравнительно небольшое число исследований, возможно, вследствие того, что многие промышленные микробиологические периодические процессы заканчиваются задолго до наступления этой фазы. Обычно считается, что гибель популяции подчиняется экспоненциальному закону:

X = X_s ^e-kd^t      (7.48)

В этом уравнении t означает время, прошедшее с начала фазы отмирания. В основу уравнения (7.48) положено допущение о том, что в любое время погибает одна и та же доля живых клеток.

Одно из объяснений экспоненциального уменьшения численности популяции в фазе отмирания заключается в том, что в культуре клеток летальный исход является случайным событием и гибель данной клетки определяется только вероятностью этого события. Недостатком такого объяснения является пренебрежение историей популяции. Дин и Хиншелвуд предположили, что в стабильной и отмирающей популяциях не только живые клетки существуют за счет отмерших, но и конкурирующие участки метаболического механизма клетки в борьбе за дефицитные промежуточные соединения также существуют один за счет другого [3]. Если примять это предположение, можно показать, что скорость гибели клеток должна подчиняться экспоненциальному закону. Другие модели снижения численности популяции мы обсудим в разд. 7.7.

Чтобы лучше понять закономерности роста популяции клеток в периодическом процессе и создать основу для вывода соответствующих математических выражений, целесообразно, рассмотреть ряд результатов экспериментального изучения изменений массы и химического состава популяции в периодических процессах. Следует опять-таки подчеркнуть, что эти результаты относятся не к индивидуальной клетке, а к совокупности множества клеток, составляющих популяцию в данный момент.

Дин, Хиншелвуд и другие исследователи посвятили много работ изучению изменений в составе культуры бактерий A. aerogenes. В частности, ими было показано, что в среде, содержащей глюкозу, лаг-фаза сокращается до минимума* если инокулят взят из популяции в стационарной фазе, наступившей после истощения запасов глюкозы. Полученные данные изображены на, рис. 7.17. Обратите внимание на то, что на ранних этапах цикла роста на кривых изменения средней массы клетки и отношения РНК/ДНК наблюдаются резкие максимумы. Хотя количество ДНК в расчете на единицу клеточной массы и отношение массы белков к массе РНК остаются относительно постоянными, по этим данным в совокупности с некоторой другой информацией нетрудно воспроизвести картину активизации метаболической активности клетки, направленной на использование повышенных количеств питательных веществ в новой среде и на синтез больших количеств диффундирующих промежуточных метаболитов.

РИС. 7.17. Изменения характеристик клеток в ходе роста A. aerogenes в периодическом процессе.

На рис. 7.18 представлены данные, иллюстрирующие другое интересное явление, к которому мы обратимся еще раз при изучении скоростей образования конечных продуктов жизнедеятельности клеток. Средняя концентрация РНК в клетке возрастает пропорционально скорости роста популяции. Следует подчеркнуть, что такая зависимость наблюдается только тогда, когда изменение скорости роста обусловлено вариациями в составе питательной среды. Если же скорость клеточного роста изменяется, например, за счет понижения или повышения температуры, то в фазе экспоненциального роста концентрация РНК, по-видимому, остается практически на одном уровне.

РИС. 7.18. Зависимость содержания РНК от скорости роста
A. aerogenes для" различных источников углерода.

В завершение этого раздела мы несколько подробнее рассмотрим свойства популяций клеток и характер изменения активностей ферментов в течение клеточного цикла. В фазе экспоненциального роста A. aerogenes концентрации двух ферментов с гидрогеназной активностью изменяются очень мало, в то время как удельная активность аспарагиндеаминазы варьирует в довольно широких пределах. Первоначальное падение активности этого фермента приписывается разбавлению инокулята, а повышение активности в конце клеточного цикла обусловлено, по-видимому, снижением рН среды на этой стадии процесса.

Этот факт лишний раз свидетельствует о том, что периодическую культуру клеток следует рассматривать как сложную единую систему, состоящую из популяции клеток и жидкой среды переменного состава. В известном смысле рост популяции в периодическом процессе можно считать функцией начальных характеристик не только клеток, но и среды, поэтому любые параметры популяции после начала процесса зависят от каждой из этих двух фаз. Таким образом, в общем случае до известной степени необоснованно рассматривать свойства одной лишь популяции клеток в периодическом процессе роста, поскольку эти свойства определяются взаимодействием между средой и популяцией.

7.3.2. Неструктурированные модели
клеточного роста в периодических процессах

В простейшем подходе к моделированию роста культуры клеток в периодическом процессе мы допускаем, что скорость роста клеточной массы во времени является функцией одной лишь клеточной массы, т. е.

      (7.49)

Как мы скоро увидим, из этого уравнения отнюдь не следует, что мы должны пренебрегать любыми изменениями, происходящими в ходе клеточного роста в среде.

Одной из простейших моделей типа (7.49) является закон Мальтуса, который математически можно выразить следующим образом:

f(x) = μx      (7.50)

РИС. 7.19. Логистическая кривая (k>0; β>0).

где μ – константа. Нетрудно видеть, что таким же образом выражается уже известная нам закономерность накопления клеточной массы в фазе экспоненциального роста. Предсказание Мальтуса о неизбежности рокового конца человечества в результате неконтролируемого роста народонаселения не оправдалось (или, быть может, пока еще не оправдалось?); так же и в случае популяций микроорганизмов вслед за фазой экспоненциального роста наблюдается переход к стационарной популяции.

Эта теория получила дальнейшее развитие в работах Ферлхурста (1844 г.), а также Перла и Рида (1920 г.), которые при анализе роста популяции стали учитывать ингибирующий фактор. Допустив, что ингибирование пропорционально х2, эти исследователи предложили уравнение

Это выражение представляет собой уравнение Риккати; его интегрирование не представляет затруднений и приводит к уравнению логистической кривой:

Как показано на рис. 7.19, логистическая кривая имеет S-образную форму и приводит к стационарной популяции с максимальной концентрацией биомассы x_s= 1/β.

Одно из возможных объяснений логистической кривой сводится к допущению, что скорость продуцирования токсина про-порциональна скорости роста популяции:

Обычно x₀ пренебрежимо мало по сравнению с х; в таких случаях подстановка уравнения (7.55) в (7.42) приводит к уравнению типа (7.51).

В основу неструктурированных моделей другого типа, описывающих приближающиеся к стационарному состоянию популяции, положен принцип истощения лимитирующего рост питательного вещества. Если, как и при выводе уравнения Моно, допустить, что μ = μ(s) и что общий экономический коэффициент Y_х/s постоянен, то уравнения материального баланса для питательного вещества и клеточных веществ можно объединить в одном уравнении типа (7.49) (см. упражнение 7.14).

Недостатком логистического уравнения является пренебрежение фазой снижения массы (численности) популяции после того, как стационарная популяция исчерпала все свои ресурсы. Этот фактор учтен в модели, разработанной в начале этого столетия Вольтеррой. В модели Вольтерры уравнение (7.50) дополняется интегральным членом типа

Физический смысл выражения (7.56) в первом приближении можно интерпретировать как влияние истории популяции K(t,r) на скорость ее роста. Выражение (7.56) отражает зависимость скорости роста во время t от всех предыдущих значений плотности популяции. Если К не зависит от t, то выражение (7.56) можно рассматривать как отражение влияния компонента культуры, изменение концентрации которого подчиняется закону

Предположим, что К постоянно и равно К₀, и дополним уравнение (7.51) выражением (7.57), отражающим предыдущую историю популяции. Тогда изменение массы или плотности популяции во времени можно описать следующим уравнением

В соответствии с уравнением (7.58) К₀ для ингибитора имеет отрицательное значение, а для соединения, промотирующего клеточный рост, – положительное. Это уравнение можно решить численно; пример такого решения приведен на рис. 7.20. При отрицательных К₀ масса популяции достигает максимума и затем уменьшается.

РИС. 7.20. Решение уравнения Вольтерры при различных значениях
параметра λ, отражающего историю популяции клеток.

Описанные выше неструктурированные модели клеточного роста имеют несколько недостатков. В частности, в них не находит отражения лаг-фаза, не учтены влияющие на рост клеток различные переменные, а также данные о метаболизме клетки и его регуляции. В последующих разделах мы попытаемся найти связи между сложной биохимией клетки и явлениями, наблюдаемыми при росте популяции в периодическом процессе.

7.3.3. Рост филаментозных организмов

В предыдущих разделах настоящей главы мы рассматривали популяции микроорганизмов, в которых увеличение биомассы сопровождается повышением числа клеток. По-другому складывается ситуация при росте плесневых грибов и других филаментозных организмов; здесь по мере роста культуры изменяется как масса, так и морфология гранул или суспензии плесени. Экспериментальное изучение роста погруженных культур в периодических процессах показало, что количество биомассы возрастает во времени не экспоненциально, а с меньшей скоростью, так что масса популяции приблизительно пропорциональна третьей степени времени. Чтобы объяснить эту зависимость, нужно начать изучение с однои двумерных культур плесневых грибов. В случае одномерной культуры скорость увеличения длины колонии остается постоянной во времени, а для культур плесеней на поверхности (двумерных) характерна постоянная скорость увеличения радиуса культуры.

Экстраполируя эти результаты на сферическую гранулу, растущую в погруженной культуре, предположим, что

ПосколькуM₀ по сравнению с M обычно очень мало, то уравнение (7.64) свидетельствует об упоминавшейся выше пропорциональной зависимости M от t³.

Полный анализ роста филаментозного организма должен учитывать также кинетику образования гранул. Последние возникают в результате агломерации спор и последующего роста или в результате разрастания отдельной споры. Имеющиеся данные показывают, что на образование гранул влияют самые различные свойства организма и среды (рис. 7.21). Общая модель кинетики образования гранулы пока еще не разработана, поскольку сложные механизмы этого явления недостаточно изучены и не вполне понятны.

РИС. 7.21. Факторы, определяющие образование гранулы (а) и ее структуру (б) в процессе роста мицеллярных организмов.

При анализе роста уже образовавшихся гранул описанная модель может рассматриваться только в качестве очень грубого приближенного описания. На кинетику роста гранул должны оказывать влияние их размер, морфология и внутренняя структура, а эти факторы в свою очередь определяются совокупностью таких параметров, как интенсивность перемешивания, концентрация гранул, свойства организма и состав среды [12]. Кинетика роста гранул часто зависит и от взаимосвязей типа диффузия – реакция, рассмотренных нами в разд. 4.4.