Капсульные полисахариды относятся к микробным продуктам, синтезируемым в больших количествах. Декстраны с молекулярной массой 50 000-100 000 дальтон могут служить замеmrrелями плазмы крови; когда цепи этих полимеров поперечно сшиты, они образуют структуры, очень эффективные в качестве молекулярных спт Декстраны синтезируются Leuconostoi: mesenteroides и молочнокислыми бактериями, но только при росте в среде, содержащей в качестве субстрата сахарозу. В капсуле бактерий декстраны представлены полимерами глюкозы с молекулярной массой от 15 тыс. до 20 млн. дальтон в зависимосm от штамма микроорганизма. Бакте. рии содержат фермент трансглюкозидазу или декстрансахаразу, который расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу; фруктоза используется для роста бактерий, а глюкоза полимеризуется в декстран.

Ксантаныэто смолы, синтезируемые Xanthomonas campestris, когда он аэробно растет на глюкозной среде. Ксантаны представляют собой разветвленные полимеры, состоящие из молекул глюкозы, маннозы и глюкуроновой кислоты. Некоторые из них несут ацетильную (СН₃СО) и пируватную (СН₃СОСО) группы. Ксантаны безопасны для человека; их добавляют ко многим пищевым продуктам в качестве загустителей и стабилизаторов. Они находят применение как красители в текстильной промышленности и в полиграфии, в производстве косметических товаров и фармацевтических препаратов, а также при бурении нефтяных скважин (в качестве добавки к буровому шламу).

Ферментация в твердых средах

Ферментацию в твердых средах часто противопоставляют процессам, происходящим в жидкой среде. Этот· процесс, с древних времен связанный с питанием человека, в большинстве случаев представляет собой переработку сельскохозяйственных продуктов и продуктов питания при помощи плесеней.

Получение сыра из молочных белков пример типичной ферментации в твердой среде, которая служит способом сохранения молока. Если не принять особых мер предосторожности, в молоко быстро попадают бактерии и другие микроорганизмы, которые заквашивают его, сбраживая лактозу в молочную кислоту в наши дни по уровню сбыта производство молочнокислых продуктов стоит на втором месте в мире среди видов промышленности, в которых используются микробиологические процессы (после производства алкогольных напитков).

Процесс приготовления сыра начинается с добавки к молоку культуры бактерий (одного или нескольких видов), чтобы молоко свернулось, к смеси добавляют протеолитический фермент. Традиционно для этого использовали сычужный фермент, получаемый из желудка грудного теленка, но в последнее время он все чаще заменяется микробиологическими ферментами. Затем свернувшееся молоко отделяют от сыворотки, прессуют, чтобы отжать часть воды, и заворачивают в ткань для высушивания. В процессе затвердевания продукта микроорганизмы растут на внешней поверхности сыра, обеспечивая тем самым его вкус и запах. Большое разнообразие сортов сыра объясняется природой и свойствами микробных культур, служащих исходными культурами при свертывании молока, температурой изготовления и наличием или отсутствием вторичной микробной флоры, растущей на сыре (см. табл. 9).

Мягкие сыры содержат 50-80% воды и включают такие конечные продукты, как прессованный творог и вещества, появляющиеся в процессе созревания сыра при росте на его поверхности плесеней (Penicillium) и дрожжей (к таким сырам относятся бри и камамбер). Полумягкие сыры недолго варят, чтобы уменьшить содержание воды до 45%. Некоторые из них пропитывают рассолом, который индуцирует размножение на поверхности дрожжей и бактерий. В твердых сырах не более 40% воды. Они могут содержать только бактериальную флору (чеддер) или быть заражены спорами Penicillium roquefortii. Рост плесени в мякоти сыра придает ему характерный вкус и аромат (датский голубой, горгонзола, рокфор). При изготовлении сыра грюйер к молоку добавляют пропионовокислые бактерии: они вырабатывают двуокись углерода, в силу чего образуются дырки, характерные для сыров такого типа.

Йогурт получают при сбраживании цельного молока смесью двух симбиотических молочнокислых бактерий: Lactobacillus bulgaricus и Streptococcus termophilus. Температура при брожении поддерживается около 40° С. Своим характерным вкусом йогурт обязан молочной кислоте, получаемой из лактозы молока, и ацетальдегиду. Оба этих вещества вырабатываются L. bulgaricus.

Сметана образуется при закислении пастеризованных сливок молочнокислыми бактериями. Пахту получают при брожении снятого или nолуснятого молока под действием смеси молочнокислых и родственных им бактерий. Среди других ферментируемых молочных продуктов упомянем кефир и кумыс, которые потребляют жители центральноевропейских стран, а также вилию, которую пьют в Финляндии.

Для консервирования овощей их пропитывают рассолом, в котором они подвергаются брожению. Первая стадия-рост в рассоле аэробной микрофлоры на поверхности овощей. Затем в процесс включаются молочнокислые бактерии и дрожжи, относящиеся к родам Saccharomyces и Torulopsis. В результате брожения образуются молочная и уксусная кислоты. В дальнейшем дрожжи вытесняют молочнокислые бактерии; брожение завершается, когда использованы все сбраживаемые углеводы овощей. Однако некоторые виды дрожжей, относящиеся к родам Candida, Debaryomyces и Pichia, продолжают расти на поверхности рассола. В современной технике консервирования овощей используются микробные штаммы, в частности, штаммы молочнокислых бактерий, подвергшиеся селекции. Пастеризация на последней стадии консервирования уничтожает микробы и гарантирует качество продукта.

Во Франции исследователи кафедры технологических процессов Технологического университета в Компьене и сотрудники компании «Крист» в департаменте Сарте разработали новый производственный процесс получения кислой капусты. В ферментационные баки закладывают 6,6 т капусты вместо 20-110 т при традиционном производственном процессе; баки пластмассовые, их внутреннее покрытие устойчиво к кислоте, выделяемой кислой капустой, к тому же их можно транспортировать. Правда, при новом способе требовалось около месяца, чтобы получить годный в пищу продукт. По мере усовершенствования производственного процесса этот срок удалось сократить до восьми дней. Капустный сок собирают на дне бака при 15° С, затем нагревают до 25-26° С и снова переносят в верхнюю часть бака, в результате листья капусты постоянно омываются жидкостью; бактериальное брожение ускоряется за счет повышения температуры. Новый ускоренный производственный процесс, запатентованный в 1978 г., был внедрен в промышленность уже через год. Он способствовал не только улучшению самого производства кислой капусты, но и усовершенствованию переработки отходов. Последний процесс осуществляется с применением дрожжей Candida utilis, выделенных из сока кислой капусты исследователями Компьенского университета. При этом 25% молочной кислоты превращается в дрожжевую белковую биомассу, стоки теряют кислотность (рН возрастает до 7) и могут быть переработаны на очистных станциях. Новая технология, дополняющая технику ускоренного получения кислой капусты, весьма выгодна, так как позволяет уменьшить загрязнение окружающей среды соками кислой капусты. Во Франции она применяется с 1977 г.

В случае молока и овощей (а также некоторых плодов, например маслин) брожение в первую очередь служит сохранению питательных компонентов, которые в противном случае быстро деградируют и становятся несъедобными. Другие виды пищевого брожения используются для улучшения вкуса и запаха продуктов питания с одновременным повышением белкового содержания в пище. Исходными продуктами для этих видов пищевого брожения служат рыба или соевые бобы. Их приготовление и употребление в пищу особенно распространено в странах Юго-Восточной Азии, где они вносят существенный вклад в белковый компонент питания.

Индонезийский темпех, содержащий 55% белков, представляет собой плоmую лепешку (шрот), изготовленную из соевых бобов (кеделе), арахиса (онтьём) или кокосовых орехов (бонгкрек).

С 1960 г. в США изучались различные стадии производства темпеха. Исследования были направлены на повышение активности плесеней при этом брожении и на улучшение питательных качеств самого темпеха. Стейнкраус из агрономического факультета Корнеллского университета и Хэсселтайн из Сельскохозяйственного исследовательского центра в Пеории (шт. Иллинойс) первыми начали исследования в этой области. Затем последовали другие эксперименты, связанные с производством дешевых и богатых белком пищевых продуктов, основанных на местном сырье.

Производство темпеха занимает два-три дня. Сначала соевые бобы на 12 ч погружают в воду и лущат (в Индонезии традиционно принято давить соевые бобы в бамбуковых корзинах, после чего их промывают для удаления шелухи). Соевые бобы кипятят в течение получаса, чтобы разрушить ингибиторы трипсина желудочного сока и гормона роста (эти два ингибитора делают сырые соевые бобы несъедобными для человека). Бобы несколько раз промывают и высушивают. Затем производится засев спорами плесени Rhizopus oligosporus, которые вводятся в массу, находящуюся на подносах или в банановых или тиковых листьях (когда темпех изготовляют в ·сельской месmости). Засев обычно производят остатками от предыдущей порции темпеха. Брожение длится 36-38 ч приблизительно при 31° С. В итоге получается компактный светло-коричневый шрот, состоящий из бобового пюре и филаментов гриба Rhizopus. Темпех обычно употребляют в пищу сразу после изготовления или хорошенько обжаривают в кокосовом масле.

В процессе ферментации гидролизуются а-галактозиды и 30% триглицеридов; при этом высвобождается ценная жирная кислоталинолевая кислота (в количестве 2,5 г/100 г), хотя суммарное содержание жиров в темпехе не отличается от такового в соевых бобах, т. е. составляет примерно 20-26% сухого веса. Содержание белка возрастает, достигая 50-55% сухого веса, по сравнению с 40-43% в соевых бобах (содержание растворимого азота возрастает с 0,5 до 2%, так как значительная часть белков под действием протеолитических ферментов плесени распадается на аминокислоты), рН возрастает с 5 до 7,6. Брожение - высококачественный процесс: из 100 г сырых соевых бобов получается лишь чуть меньше темпеха, который по праву считается высокопитательной и легкоусваиваемой пищей. В его состав входит рибофлавин (витамин В₂; 7 мкг/г), а также никотиновая кислота (витамин РР; 60 мкг/г), причем их концентрация в два и пять раз соответственно превышает концентрацию этих витаминов в соевых бобах. Темпех, приготовленный rрадиционным путем, содержит также витамин В₁₂ (530 н. г/г), который синтезируется бактерией, а не плесенью. Эта бактерия отсутствует в ходе контролируемого в лаборатории производственного процесса, в результате там получают темпех, лишенный цианокобаламина.

Промышленное или полупромышленное производство темпеха проходит те же стадии, что и традиционный процесс; это гарантирует не только максимальное содержание ценных пищевых компонентов, но и удаление вредных или ингибирующих веществ из соевых бобов.

В центральных районах Явы из копровых тротов при помощи той же плесени, что используется при получении темпеха (R. oligosporis), приготовляют бонгкрек. В западной части Явы для приготовления двух видов продукта онтьём используются троты из земляного ореха. Один из этих продуктов темно-коричневый или черный и содержит Rhizopus, другой-красного цвета и содержит Neurospora sitophila. Загрязнение бонгкрека или онтьёма бактериями (Pseudomonas) или плесенями (Aspergillus flavus) вызывает накопление чрезвычайно опасных токсинов (токсофлавина и афлатоксина). Исследования, проводимые в Сельскохозяйственном университете и Исследовательском институте питания города Богор, направлены на усовершенствование производственных процессов, связанных с получением этих пищевых продуктов, и контроль микробного загрязнения.

Со своей стороны американские ученые приспособили производственный процесс получения индонезийского темпеха для хлебных злаков и маниока. Они обратили внимание на то, что пшеница, ферментируемая с той же плесенью R.·oligosporus в течение 20 ч при 31° С, превращается в продукт, содержащий в шесть-семь раз больше белка, в пять раз больше рибофлавина и в два раза больше никотиновой кислоты, чем обычная пшеница. R. oligosporus производит мало амилаз, поэтому пшеничный крахмал не гидролизуется и не происходит спиртового брожения.

Индонезийский темпех и его разновидности, приготовляемые из арахиса и кокосовых орехов, это высокопитательные продукты, получаемые традиционными способами. Они служивают более широкого распространения за nределамн своих регионов, поскольку в них содержатся белки, витамины и необходимые жирные кислоты в высокой концентрации, зато почти нет насыщенных жиров; кроме того, они просты в приготовлении и дешевы.

Среди других восточных блюд, получаемых ферментацией, можно выделить японское мисо (его производство к 1980 г. составляло 700 000 т ежегодно), которое приготовляется из целых соевых бобов, ферментируемых с Aspergillus oryzae (в Японии, по данным на 1980 г., среднее потребление мисо составляет 24 г на человека в день); китайское суфунапоминающий сыр продукт, получаемый при выращивании на закваске из соевых бобов нескольких видов плесеней, преимущественно Mucor; ангкак, также употребляемый в Китае, при приготовлении этого блюда рис заражается плесенью Monascus purpureus (здесь цель состоит не столько в улучшении вкуса риса, сколько в том, чтобы придать ему красный цвет). Соевый соус приготовляли много веков назад в Китае и позднее ввезли в другие страны Дальнего Востока, в частности в Японию, которая в настоящее время является его основным производителем; в стране предпринимаются важные попытки поднять продуктивность процесса на промышленном уровне. Соевый соус получают сбраживанием осоложенной смеси соевых бобов и пшеницы Aspergillus oryzae. Промежуточный продукт, называемый койя, помещают в сосуд с равным объемом раствора соли, чтобы получить массу - мороми. Мороми бродит в больших цистернах на протяжении 8-12 мес при низкой температуре; время от времени ее перемешивают. В брожении принимают участие бактерии Pediococcus soyae и дрожжи Saccharomyces rouxii и Torulopsis spp. Их специально добавляют к мороми в виде исходных культур или они размножаются в мороми из уже имеющихся там клеток. В результате брожения мороми обогащается молочной и другими кислотами и этанолом. По окончании процесса мороми отжимают и экстрагированный соевый соус расфасовывают. Остающийся при этом шрот часто скармливают домашним животным.

Исследователи из французского Бюро по изучению науки и техники Заморских стран (OSTROM) и Национального исследовательского института прикладной химии (IRCHA) разработали метод обогащения белком крахмалсодержащих пищевых продуктов, используемых в ·каче· стве корма животных. В сваренный крахмалсодержащий пищевой продукт (маниок), который фрагментирован и содержит около 50% воды и минеральные соли, необходимые для роста штамма Aspergillus niger, производится гомогенный засев этого микроорганизма. Гранулярная и пористая структура крахмалистого материала обеспечивает хорошую диффузию кислорода в субстрате, который постепенно зарастает плесенью.

Крахмал разрушается и ассимилируется, а субстрат остается твердым, пористым и хорошо пропускающим воздух. Как показал Ренбо (1978), наилучшие результаты достигаются при содержании в маниоковой муке 55% воды и температуре ферментации 35-40° С. В начале ферментации рН должен быть достаточно низким, чтобы воспрепятствовать бактериальному заражению. По мере развития гриба происходит быстрое закисление, которое замедляют добавлением смеси соли аммония и мочевины, служащей также источником азота. Достаточно стабильный рН для обеспечения оптимальной скорости роста поддерживается в условиях, когда потребность в азоте на 50-60% удовлетворяется за счет мочевины. Наилучшая плотность засева 2•10⁷ спор на 1 г муки. Примерно 20% углеводов превращаются в белки, и это выше, чем выход в жидкой среде (18%). В 40-литровом экспериментальном ферментере (эквивалентном 150-литровому ферментеру для жидкости) усваивается 8 кг сухого субстрата. После 30 ч ферментации, вызванной штаммом Aspergillus niger при 38° С, содержание белка в крахмалсодержащих отходах картофеля возрастает с 5 до 18%, а содержание углеводов падает с 65 до 28%.

Простота и такие преимущества рассматриваемой технологии, как отсутствие необходимости стерилизовать субстрат, полнота выхода конечного продукта, низкий расход энергии и очень небольшие капиталовложения, позволяют создавать мелкомасштабные установки, приспособленные к условиям деревни или мелких хозяйств. Технология может представлять особый интерес для экваториальных странпроизводителей маниока и других крахмалсодержащих клубневых растений, питательная ценность которых в результате применения такой технологии может значительно возрасти.

На экспериментальной ферментационной установке емкостью 1200 л были проведены исследования с целью изучения надежности процесса, усовершенствования знаний о брожении в твердой среде и анализа питательной ценности конечных продуктов при скармливании свиньям и домашней птице. По оценкам французских ученых, белки, полученные при ферментировании маниоковой муки, смогут конкурировать с белками соевых бобов, если стоимость 1 кг сои достигнет 1,2 франка (что примерно соответствует ценам 1979 г.).

В Гэлфском университете (провинция Онтарио, Канада) был разработан сходный процесс переработки для 3000-литрового ферментера, содержащего маниоковую муку и штамм Aspergillus niger. Брожение происходило при 40° С в очень кислых условиях. Эта опытная установка проверялась в Международном центре тропического сельского хозяйства (CIAТ) в Колумбии на предмет получения обогащенных белками пищевых продуктов для кормления крупного рогатого скота. Исследовательская программа была начата в 1972 г. Международным исследовательским центром по развитию (IDRC) в Канаде совместно с CIAT и Гэлфским университетом. Сначала микробиологи использовали штаммы Aspergillus fumigatus и мутанты этого вида плесени, однако оказалось, что этот микроорганизм вызывает аллергические реакции у рабочих, занятых в производственном процессе. Затем стали использовать Rhizopus chinensis и, наконец, другой грибCephalosporium eichhorniae 152, который хорошо растет в кислой среде при высокой температуре. Конечный продукт, полученный из маниока под действием этого штамма, содержал 49% белка и охотно употреблялся в пищу экспериментальными животными. Разработанный процесс прост, недорог, надежен и хорошо приспособлен для применения в сельской местности. Проводились также исследования по генетической модификации гриба, чтобы добиться деградации целлюлозного материала для получения белков, в частности отходов и остатков соплодий бананов.

При современной технологии хлебопечения необходима повышенная скорость получения теста; по этой причине брожение осуществляется при более высокой температуре (35° С) и в тесто кладут больше дрожжей. Можно также использовать штаммы Saccharomyces cerevisiae с больщей ферментативной активностью. Наряду с этим тесто подвергают интенсивному механическому перемешиванию, которое влияет на его структуру. Пекарские дрожжи, которые вплоть до середины прошлого столетия были отходом пивоваренной промышленности, сейчас производят на фабриках, где специально отобранные штаммы выращивают в аэробных условиях в питательной среде, основанной на мелассе.

Биоконверсия

Биоконверсия заключается в превращении метаболитов в структурно родственные соединения под действием микробных клеток. Тем самым микроорганизмы могут влиять только на отдельные стадии сложных и важных процессов химического синтеза.

Один из древнейших видов биоконверсии превращение этилового спирта в уксусную кислоту, которое происходит при получении уксуса. Использование этого процесса, осуществляемого Gluconobacter suboxidans, можно проследить вплоть до Древнего Вавилона (5000 лет до н. э.).

Биоконверсии чрезвычайно специфичны, поскольку они имеют дело с одним типом реакции и с соединением определенной структуры (стереоспефичность). В ходе биоконверсий происходит превращение изопропанола в ацетон, глицерина в дигидроксиацетон, L-тирозина в L-диоксифенилаланин (ДОФА), глюкозы в глюконовую кислоту и затем в 2-кетоглюконовую или 5-кетоглюконовую кислоты и сорбита в L-сорбозу. Биоконверсия сорбита в сорбозуединственная биологическая реакция в химическом производстве аскорбиновой кислоты (витамина С).

Применение методов, основанных на биоконверсии, наиболее полно иллюстрирует история синтеза стероидных гормонов. В начале 1930-х гг. Кендалл из Фонда Мэйо и Райхштейн из Базельского университета выделили из надпочечников кортизон. Десятилетием позже Хенч из того же Фонда Мэйо установил, что кортизон эффективен при лечении ревматоидного артрита. Химический синтез кортизона состоит из 37 стадий, и 1 г вещества, произведенного таким образом, стоит 200 долл. Одна из ключевых стадий синтеза состоит во введении атома кислорода в положение 11α стероидного ядра; эта стадия необходима для создания физиологически активной молекулы. В 1952 г. Петерсон и Мюррей из «Апджон К°» обнаружили, что штамм Rhizopus arrhizus способен гидроксилировать прогестерон и тем самым вводить атом кислорода в положение 11α. Прогестерон ранний промежуточный продукт синтеза кортизона, и при помощи микробного гидроксилирования (которое осуществляется в промышленности микроорганизмами, близко родственными R. arrhizus, например R. nigricans) синтез кортизона сократился до 11 стадий вместо 37, а стоимость гормона упала до 6 долл. за 1 г. Другие преимущества микробной конверсии заключались в том, что брожение происходило при 37° С в водной среде и при атмосферном давлении, тогда как химический синтез кортизона требовал экстремальных температур и давления. Сеrодня любой атом углерода стероидного ядра можно гидроксилировать при помощи ·определенных микроорганизмов.

Микроорганизмы находят также применение при производстве сырья для получения стероидов. Таким сырьем являются стерины; их основными источниками служат диосгенин из корней ямса и стигмастерин и ситостерин, экстрагируемые из жмыха соевых бобов. При этом необходимо отщепить боковую цепь молекулы растительных стеринов, и в ряде фармацевтических компаний обнаружили, что для этого экономически выгодно использовать микобактерии. Некоторые мутантные штаммы микобактерий не способны завершить разложение молекулы стерина, они-то и вызывают накопление промежуточных продуктов, удобных для синтеза стероидных гормонов. Все эти усовершенствования, особенно связанные с использованием микроорганизмов, постепенно снизили цену кортизона в США до 0,46 долл. за 1 г к 1980 г., что в 400 раз меньше, чем в 1930 г. Промышленное производство стероидов постоянно растет, чтобы удовлетворять растущий спрос на них в связи с появлением новых сфер применения (в качестве противозачаточных средств, в лечении гормональных недостаточностей, кожных болезней, аллергий и воспалительных процессов). В 1978 г. в мире производились четыре основных стероида (альдостерон, кортизон, преднизон и преднизолон) общей стоимостью примерно 300 млн. долл.

Иногда для биоконверсии требуются смешанные культуры или последовательное добавление микробных штаммов или видов, каждый из которых осуществляет специфическую стадию биоконверсии. Использование иммобилизованных клеток, более стабильных, чем ферменты или клеточные культуры, дает возможность повысить эффективность биоконверсии и уменьшить ее стоимость. Это может также помочь в разрешении проблем, связанных с нерастворимостью субстратов, таких, как стероиды.

Рис. 14. Стероидное ядро (замещенный
циклопентенопергидрофенантрен).

Рис. 15. Превращение 10-кетостероидов в 17-β-гидроксистероиды и гидроксилирование
стероидов (прогестерона) в положении 11 под влиянием микроорганизмов.

Рис. 16. Дегидрирование стероидов (кортизона и гидрокортизона) микроорганизмами.

Рис. 17. Синтез эстрона Nocardia restrictus.