Количественный и качественный учет микрофлоры воздуха

1 Микрофлора воздуха, ее изучение

2 Количественный и качественный учет микрофлоры воздуха

3 Изучение культуральных особенностей микроорганизмов

1 Микрофлора воздуха, ее изучение

Воздух – среда, наименее благоприятная для жизни микроорганизмов. Микробные клетки и их споры попадают в воздух из почвы или воды вместе с пылью и аэрозолем (аэрозоль – коллоидная система, состоящая из воздуха, капелек жидкости или твёрдых частиц, и включающая различные микроорганизмы; размер аэрозольных частиц варьирует от 10 до 2000 нм). Хорошая освещенность воздуха солнечными лучами УФ-спектра, отсутствие питательных веществ и влаги – все эти условия не способствуют жизни микробов в воздухе. Жизнеспособность микроорганизмов в воздухе обеспечивают взвешенные частицы воды, слизи, пыли и фрагментов почвы. Атмосферный воздух и воздух закрытых помещений значительно различаются по количественному и качественному составу микрофлоры. Бактериальная обсеменённость жилых помещений всегда выше, чем атмосферного воздуха; это справедливо и в отношении патогенных микроорганизмов, попадающих в воздух от больных людей, животных и бактерионосителей. Микрофлору атмосферного воздуха условно разделяют на резидентную (постоянно обнаруживаемую) и временную (обнаруживают спорадически). Наибольшее количество микробов содержится в околоземных слоях атмосферы. По мере удаления от земной поверхности воздух становится чище. Постоянная микрофлора атмосферного воздуха формируется почвенными микроорганизмами. Более или менее регулярно в её состав входят Micrococcus roseus, M. flavus, M. candicam, Sarcina flava, S. alba, S. rosea, Bacillus subtills, B. mycoides, B. mesenterieus, виды Actinomyces, Aerococcus, грибы родов Penicillium, Aspergillus, Mucor и др. Временная микрофлора атмосферного воздуха также формируется за счёт микроорганизмов почвы и видов, поступающих с поверхности водоёмов. Находящиеся в атмосферном воздухе микроорганизмы подвергаются солнечному и температурному

воздействию, атмосферным осадкам и ветру. Поэтому микрофлора воздуха весьма динамична, непрерывно меняется и обновляется. Контаминация воздуха патогенными микроорганизмами происходит капельным путём; микробы содержатся в составе аэрозоля, образующегося при разговоре, кашле, чиханьи. Также микроорганизмы попадают в воздух со слущивающимся эпителием кожных покровов, пылью из загрязнённого постельного белья и заражённой почвы. При оценке санитарного состояния закрытых помещений в зависимости от задач исследования, определяют общее микробное число, наличие санитарно-показательных микроорганизмов (стафилококков, гемолитических стрептококков, являющихся показателями контаминации микрофлорой носоглотки человека). Кроме того, при исследовании воздуха медицинских стационаров (родильные дома) основное внимание направлено на выявление патогенных стафилококков, синегнойных палочек, других условно-патогенных бактерий – возбудителей внутрибольничных инфекций. На предприятиях микробиологической промышленности выявляют наличие и содержание микроорганизмов-продуцентов. Определение тех или иных патогенных или условно-патогенных микроорганизмов из воздуха проводят на специальных дифференциально-диагностических средах. Изучение состава микрофлоры воздуха имеет большое значение для санитарной оценки этой среды.

2 Количественный и качественный учет микрофлоры воздуха

Количественный учет микрофлоры воздуха. Для исследования общего количества микроорганизмов в воздухе применяют наиболее простой, хотя и недостаточно точный, метод «оседания» (седиментационный метод), предложенный Кохом (1881). Стерильные чашки Петри с питательной средой (МПА (мясо-пептонный агар) – для бактерий, СА (сусловый агар) – для грибов) открывают в исследуемом помещении на 5 минут (чашки располагают на высоте, соответствующей уровню дыхания сидящего или стоящего человека). Следят за тем, чтобы при открывании крышки чашки Петри не было движения воздуха. После этого чашки закрывают и помещают на сутки в термостат при 37 °С, что дает возможность развиться бактериальной флоре. Затем чашки переставляют в термостат и выдерживают при температуре 25 °С. В таких условиях прорастают бактерии, требующие для своего развития более низкие температуры, а также плесневые грибы. Обычно опыт ставится в двух повторностях. Затем подсчитывают выросшие колонии микроорганизмов. Счет колоний на чашках производят с помощью прибора для счета колоний бактерий

или лупы. Для лучшей видимости считают колонии на темном фоне (под чашку кладут темную бумагу), чашки помещают дном кверху. Каждую колонию отмечают на две чашки чернилами или тушью. Седиментационный метод – самый простой метод для суждения о зараженности воздуха микроорганизмами, но он позволяет иметь лишь ориентированное представления о содержании микрофлоры в воздухе. С его помощью определяется только 35-60% микроорганизмов в воздухе. Хотя этот метод и не дает полного представления ни о количестве микроорганизмов, находящихся в воздухе, ни об их видовом разнообразии, однако с его помощью можно учесть микрофлору тяжелой оседающей пыли, которая не захватывается и не учитывается другими аспирационными методами. Метод не точен и абсолютно не пригоден для изучения атмосферного воздуха, где имеют место большие колебания в скорости его движения. Этот метод может быть использован для анализа микрофлоры воздуха в закрытых помещениях в тех случаях, когда отсутствуют более совершенные приборы или нет электроэнергии. Используя данный метод можно рассчитать количество микроорганизмов в 1 м³ воздуха. Обычно производят перерасчет по Омелянскому: допускают, что на площадь в 100 см2 за 5 мин осаждается примерно столько бактерий, сколько их содержится в 10 л воздуха (0,01 м³). Зная площадь чашки Петри, определяют количество микроорганизмов в 1 м³ воздуха. Для этого: 1) определяют площадь агаровой пластинки в чашке Петри по формуле S= π × r² = 3,14 × r² (радиус чашки Петри равен 0,5 дм, соответственно, площадь агаровой пластинки равна 0,785 дм2); 2) вычисляют количество колоний на площади 1 дм2; 3) пересчитывают количество бактерий на 1 м³ воздуха, умножая найденное количество колоний на площади 1 дм2 на 100; 4) результаты определения микробного числа воздуха оценивают по суммарному числу колоний, выросших на обеих чашках; 5) обязательно учитывают, что полученные показатели занижены примерно в 3 раза. Чтобы судить о степени загрязненности воздуха жилых помещений, можно воспользоваться таблицей 3.1.

Таблица 3.1 – Критерии для санитарной оценки воздуха жилых помещений (число микроорганизмов в 1 м³ по А.И. Шафиру)

По данным А. Ф. Войткевича, в 1 м³ морского воздуха содержится 1– 2 клетки, в таком же объеме воздуха в городском парке – 200, городской

улице – 5 тыс., жилом помещении – 20 тыс., скотном дворе – более 1 млн. клеток. Для исследования микрофлоры воздуха можно использовать различные аспирационные методы, например, аппарат Кротова, работа которого основана на принципе ударно-прибивного действия воздушной струи. Подобные методы наиболее надежны и точны. При качественном анализе микрофлоры воздуха отмечают культуральные особенности роста микроорганизмов на плотных питательных средах, общее количество типов колоний, их морфологические особенности и количественное соотношение. Отдельные колонии микроскопируют с иммерсионной системой либо пересевают на дифференциально-диагностические питательные среды для выделения чистых культур микроорганизмов, видовой состав которых можно определить, используя специальные определители.

3 Изучение культуральных особенностей микроорганизмов

К культуральным, или макроморфологическим, свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. Рост на плотных питательных средах. На поверхности плотных питательных сред микроорганизмы могут расти в виде колонии, штриха или сплошного газона. Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросшее в большинстве случаев из одной клетки. В зависимости от того, где развивались клетки (на поверхности плотной питательной среды, в толще ее или на дне сосуда), различают поверхностные, глубинные и донные колонии. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются большим разнообразием. При их описании учитывают следующие признаки: – форму колонии – округлая, амебовидная, неправильная, ризоидная

и т.д. (рисунок 3.1); – размер (диаметр) колонии измеряют в мм. Если размеры колонии

не превышают 1 мм, то их называют точечными; – поверхность колонии – гладкая, шероховатая, бороздчатая,

складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная; – профили колонии – плоский, выпуклый, кратерообразный,

конусовидный и т.д. (рисунок 3.2);

– блеск и прозрачность – колония блестящая, тусклая, мучнистая,

прозрачная;

Рисунок 3. 1 – Форма колоний: 1 – круглая; 2 – круглая с фестончатым краем; 3 – круглая с валиком по краю; 4, 5 – ризоидные; 6 – с ризоидным краем; 7 – амебовидная; 8 – нитевидная; 9 – складчатая; 10 – неправильная; 11 – концентрическая; 12 – сложная,

Рисунок 3.2 – Профиль колонии: 1 – изогнутый; 2 – кратерообразный; 3 – бугристый; 4 – врастающий в субстрат; 5 – плоский; 6 – выпуклый; 7 – каплевидный; 8 –конусовидный

– цвет колонии – бесцветная (грязно-белые колонии относятся к

бесцветным) или пигментированная – белая, желтая, красная, черная и др. Отмечают выделение пигмента в субстрат. При описании колоний актиномицетов отмечают пигментацию воздушного и субстратного мицелия, выделение пигментов в среду; – край колонии* – ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т.д.

(рисунок 3.3); – структура колонии* – однородная, мелко- и крупнозернистая,

струйчатая и т.д. (рисунок 3.4); *Край и структуру колонии определяют с помощью лупы или при малом увеличении микроскопа. Для этого чашку помещают на столик крышкой вверх.

Рисунок 3.4 — структура колонии

Рисунок 3.4 – Структура колонии: 1 – однородная; 2 – мелкозернистая; 3 – крупнозернистая; 4 – струйчатая; 5 – волокнистая

Консистенцию колонии определяют, прикасаясь к ее поверхности петлей. Колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой или врастающей в агар, слизистой (прилипает к петле), тягучей,

пленчатой (снимается целиком), хрупкой (легко ломается при прикосновении петлей). При посеве клеток в толщу плотной питательной среды наряду с поверхностными колониями наблюдается образование глубинных и донных колоний. Глубинные колонии довольно однообразны. Чаще всего они по виду похожи на более или менее сплющенные чечевички, в проекции имеющие форму овалов с заостренными концами. Лишь у немногих бактерий глубинные колонии напоминают пучки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если развивающиеся микроорганизмы выделяют углекислоту и другие газы. Донные колонии образуются при соприкосновении агаризованной среды с дном чашки Петри. Эти колонии обычно имеют вид довольно крупных, бесцветных прозрачных налетов либо вид тонких прозрачных пленок, стелящихся по дну. Размеры и некоторые другие особенности колоний изменяются с возрастом и зависят от состава среды. При описании роста микроорганизмов по штриху отмечают следующие особенности: скудный, умеренный или обильный, сплошной с ровным или волнистым краем, четковидный, напоминающий цепочки изолированных колоний, диффузный, перистый, древовидный или ризоидный (рисунок 3.5). Характеризуют оптические свойства налета, его цвет, поверхность и консистенцию. При описании колонии и роста микроорганизмов по штриху обязательно указывают состав среды и возраст культуры, так как колонии одного и того же организма на различных средах могут отличаться рядом признаков.

Рисунок 3.5 — рост бактерий по штриху

Рисунок 3.5 – Рост бактерий по штриху: 1 – сплошной с ровным краем; 2 – сплошной с волнистым краем; 3 – четко-видный; 4 – диффузный; 5 – перистый; 6 – ризоидный

В определителях обычно приведены описания колоний и роста микроорганизмов по штриху только на мясо-пептонном агаре или мясо- пептонной желатине. Рост в жидких питательных средах. Рост микроорганизмов в жидких питательных средах при стационарных условиях культивирования характеризуется большим единообразием по сравнению с ростом на плотных средах. Он сопровождается помутнением среды, образованием пленки или осадка. Характеризуя рост в жидкой среде, отмечают: – степень помутнения – слабая, умеренная или сильная;

– особенности пленки – тонкая, плотная или рыхлая, гладкая или

складчатая; – при образовании осадка указывают – скудный он или обильный,

плотный, рыхлый, слизистый, хлопьевидный; – нередко рост микроорганизмов сопровождается появлением запаха,

пигментацией среды, выделением газа (последнее обнаруживают по образованию пены, пузырьков). Для описания характера роста в жидких средах хемоорганогетеротрофные микроорганизмы выращивают на МПБ (мясопептонном бульоне) или на другой среде, обеспечивающей хороший рост этого организма. Чаще всего используют 4–7–суточные культуры.

Вопросы для самоконтроля

1 Насколько точным является учет микрофлоры воздуха методом

«оседания» на агаровые пластинки? 2 Какие факторы влияют на количество микроорганизмов в воздухе

помещений? 3 Какие микроорганизмы обычно составляют микрофлору воздуха

помещений? ### 4 Каково санитарное значение изучения состава микрофлоры воздуха

помещений? 5 Охарактеризуйте седиментационный метод количественного учета

микрофлоры воздуха. ### 6 Каким образом производится методика расчета количества

микроорганизмов в 1 м³ воздуха? 7 Перечислите основные признаки колоний, выросших на

поверхности среды.

8 Какие факторы влияют на размеры и особенности роста колоний?

9 Охарактеризуйте рост микроорганизмов в жидких питательных

средах.