Выделение чистых культур микроорганизмов ### 1 Понятие «чистые культуры микроорганизмов»

2 Методы получения накопительной культуры

3 Методы выделения чистой культуры

4 Способы определения чистоты выделенной культуры

5 Массовая культура на плотной среде

1 Понятие «чистые культуры микроорганизмов»

В условиях естественного обитания чистые культуры микроорганизмов встречаются довольно редко. Тем не менее, основная часть современных представлений о свойствах бактерий, а также их взаимоотношениях получена при изучении чистых культур. Поэтому совершенно необходимой задачей является выделение чистых культур различных видов бактерий, существующих в естественных условиях. Для выделения чистых культур большинства бактерий обычно затрачивается не более 2–3 суток, однако для некоторых (например, бактерии туберкулеза), этот процесс может затягиваться до 4–6 недель. Чистой культурой микроорганизмов называют популяцию бактерий одного вида, представляющую потомство одной клетки. Выделение чистой культуры предполагает проведение трех этапов (рисунок 4.1): 1) получение накопительной культуры; 2) выделение чистой культуры; 3) определение чистоты выделенной культуры.

2 Методы получения накопительной культуры

В основе выделения и определения численности представителей отдельных групп микроорганизмов лежит получение накопительных культур с помощью создания элективных условий. Накопительными называют такие культуры, в которых преобладают представители одной группы или даже одного вида микроорганизмов. Элективными называют условия, обеспечивающие преимущественное развитие определенной группы или вида микроорганизмов. При создании элективных условий учитывают особенности физиологии и метаболизма микроорганизмов: требования их к источникам питания, отношение к кислотности среды, аэрации, температуре, способность к

образованию эндоспор и т.д. Особенно часто элективные условия создают путем подбора соответствующей питательной среды.

Рисунок 4.1 — этапы выделения чистых культур микроорганизмов

Рисунок 4.1 – Этапы выделения чистых культур микроорганизмов

Источником для получения бактериальных культур, родовую и видовую принадлежность которых необходимо определить, могут служить почва, воздух, вода, пищевые продукты, надземные и подземные части растений, а также различные тканевые жидкости животных и человека, отделяемое ран, слизистой оболочки и т.д. Методы накопления имеют целью добиться увеличения относительного количества данного микроорганизма за счет создания благоприятных условий для его роста и выживания по сравнению с другими или путем пространственного отделения его из популяции. К физическим методам, которые могут быть использованы при получении накопительной культуры, следует отнести регуляцию роста температурой, тепловую и ультразвуковую обработку, ультрафиолетовое облучение и др. Можно использовать также и особенности некоторых других физических свойств данного

микроорганизма, например, его размеры, подвижность, что позволяет отделять данный микроорганизм от других членов популяции. В качестве примеров можно привести следующие: – использование освещения для получения культур

цианобактерий. Такие виды легко выделяются из пресной воды и морских осадков. Для получения накопительных культур, образцы инкубируют при 25 °С и постоянном освещении от 500 до 3000 лк. Через 4–7 дней наблюдается увеличение мутности культуры, имеющей часто розовую, коричневую, желтую окраску; – инкубация при низкой температуре для получения культур

психрофильных бактерий. Низкая температура способствует задержке роста многих бактерий. На первом этапе проводят инкубирование при температурах 0–5 °С в течение 14–24 дней. При использовании химических методов применяют токсические вещества, которые убивают или подавляют рост оставшейся части популяции, не влияя на выделяемый микроорганизм. Кроме того, эти вещества могут быть источниками питания, используемыми преимущественно отдельными бактериями в смешанной популяции. Примерами использования химических методов для выделения микроорганизмов являются следующие: – условия инкубирования в кислой среде для выделения культур

лактобацилл. Для выделения бактерий из сыров, высев производится на среду, которая за счет ацетатной буферной системы имеет pH, равный 5,3. В этом случае Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum способны образовывать колонии, а другие молочнокислые бактерии – нет; - ингибирование роста пенициллином для получения культур

микоплазм. Поскольку микоплазмы лишены клеточной стенки, они устойчивы к высоким концентрациям пенициллина, который подавляет рост многих бактерий с клеточной стенкой. Антибиотик, добавленный к питательной среде в концентрации 100–200 Е/мл, позволяет избавиться от посторонней чувствительной к нему микрофлоры; – целлюлоза как субстрат для цитофаг. Для получения

накопительных культур цитофаг, разлагающих целлюлозу, на поверхность основного минерального агара помещают кусочки фильтровальной бумаги. На бумагу кладут частицы почвы или растительного материала и инкубируют чашки при комнатной температуре. Следят за образованием вокруг частиц желтой, оранжевой или розовой окраски, а также за процессом лизиса бумаги.

Биологические методы включают использование специфических хозяев выделяемого микроорганизма, а также преимуществ некоторых свойств патогенных микроорганизмов. К ним относятся, например, такие методы как: ### 1 Получение накопительной культуры бактерий, патогенных для

животных организмов. Патогенные для животных бактерии можно выделить, заражая восприимчивое животное-хозяин смешанной культурой исследуемого материала, в котором предполагается его присутствие. В инфицированном животном патогенный микроорганизм часто преобладает и обнаруживается в крови и тканях в виде чистой культуры. При этом в результате действия защитных механизмов животного рост непатогенных сопутствующих микроорганизмов ингибируется и они гибнут. Например, чистую культуру пневмококков можно получить через 4–6 часов после внутрибрюшинного введения мыши 1 мл эмульгированной мокроты, содержащей Streptococcus pneumoniaе. Пробы перитонеальной жидкости берут из брюшинной полости животного с помощью стерильной остроконечной капиллярной пипетки. ### 2 Симбиоз растений с Rhizobium. Клубеньки, образуемые на корнях

бобовых растений, представляют собой природную накопительную культуру симбиотических азотфиксирующих бактерий. Корни бобовых растений, содержащие клубеньки, промывают и отделяют часть корня с клубеньками. После поверхностной стерилизации корень помещают в воду, раздавливают пинцетом в одной чашке Петри, 1–2 петли такой суспензии переносят в следующую чашку и т. д. К каждому разведению добавляют расплавленный и остуженный агар с маннитом. После застывания агара чашки инкубируют при оптимальной температуре. Во многих случаях для получения накопительной культуры определенных бактерий используют сочетание физических, химических и биологических методов.

3 Методы выделения чистой культуры

Для выделения бактерий в виде чистых культур известно сравнительно мало методов. Чаще всего это делают путем изолирования отдельных клеток на твердой питательной среде, используя метод посева штрихом или разлива по чашкам небольшого количества жидкой культуры (метод предельных разведений). Однако получение отдельной колонии не всегда гарантирует чистоту культуры, поскольку колонии могут вырасти не только из отдельных клеток, но и из их

скоплений. Если микроорганизмы образуют слизь, то часто к ней прикрепляются посторонние формы. Для очистки предпочтительно использовать неселективную среду (МПА), поскольку на ней лучше растут контаминирующие микроорганизмы и их легче обнаружить. Получение изолированных колоний на твердой питательной среде достигается либо путем рассева взвеси микроорганизмов шпателем (метод Коха), либо с помощью бактериологической петли (метод истощающего штриха). В результате механического разобщения клеток микроорганизмов каждая из них может дать начало изолированной колонии одного вида микробов. Рассев шпателем (метод Коха) производят в следующей последовательности: 1) на поверхность питательной среды в чашке № 1 наносят стерильной пипеткой каплю накопительной культуры и распределяют ее стерильным шпателем; 2) шпатель достают, чашку быстро закрывают и переносят шпатель в чашку № 2, не стерилизуя его. Имитируют распределение культуры по всей поверхности среды, прикасаясь к ее поверхности той же стороной шпателя, которой ранее распределяли пробу; 3) точно те же действия проводят и в чашке № 3, после чего шпатель стерилизуют; 4) засеянные чашки помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре. Через определенное время чашки достают из термостата и изучают рост микроорганизмов. Обычно в чашке № 1 наблюдают сплошной рост бактерий, в последующих чашках отмечают колонии. Рассев петлей (метод истощающего штриха) предполагает высев бактериологической петлей из накопительной культуры на поверхность агаризованной среды в чашках Петри. На первом этапе петлей с культурой наносят ряд параллельных штрихов на агаризованной среде (рисунок 4.2, А). Петлю стерилизуют, остужают о незасеянную часть агаризованной среды и проводят серию штрихов в направлении, перпендикулярном первым (рисунок 4.2, Б). Затем петлю вновь стерилизуют, остужают и штрихи наносят в направлении В (рисунок 4.2), а после очередной стерилизации – в направлении Г (рисунок 4.2). Чашки помещают в термостат и через определенное время учитывают результаты. Обычно на штрихах А и Б вырастает большое число колоний (иногда сплошной рост), тогда как на штрихах В и Г формируются изолированные (отдельные) колонии.

Рисунок 4.2 — схема рассева бактерий штрихами

Рисунок 4.2 – Схема рассева бактерий штрихами для получения изолированных колоний

Последовательные разведения в твердой среде – самый простой способ посева по чашкам, который заключается в том, что после инокуляции пробы в пробирку со стерильным расплавленным и охлажденным агаром, среду перемешивают, выливают в чашку Петри и дают ей застыть. Для получения хорошо изолированных колоний готовят ряд последовательных десятикратных разведений и по 1 мл проб вносят сразу в чашку, добавляют 15–20 мл расплавленной агаризованной среды и смешивают, покачивая чашку. Иногда отдельные колонии оказываются погруженными в агар и извлечь их можно только механически. Плохо и то, что бактерии некоторое время находятся в среде при температуре расплавленного агара.

4 Способы определения чистоты выделенной культуры

Выросшие изолированные колонии отсевают бактериологической петлей на поверхность скошенной агаризованной среды в пробирке. Поскольку изолированные колонии иногда могут формироваться не только из отдельных клеток, обязательным этапом выделения чистой культуры должна быть проверка их однородности. Это осуществляется несколькими способами: визуальным, микроскопическим, высевом на соответствующие питательные среды.

При визуальном контроле исследуют рост культуры по штриху на поверхности скошенной среды; в том случае, если рост неоднороден, считают, что культура загрязнена и требуется ее дополнительная расчистка. При описании колоний бактерий определяют их диаметр в миллиметрах, пигментацию, форму, высоту, профиль, вид края, поверхность колоний, отмечают степень прозрачности колоний и их консистенцию. На характеристики колоний могут влиять среда, возраст культуры, условия культивирования. Чистоту культур микроорганизмов обязательно нужно контролировать путем микроскопии клеток. Для этого готовят препарат фиксированных окрашенных клеток, который микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки чистых культур микроорганизмов, как правило, однородны по размеру и окраске по Граму. Однако следует помнить, что колонии, вырастающие из чистой культуры могут быть гладкие (S) и шероховатые (R). Кроме того, в чистых культурах многих бактерий могут появляться кокковидные клетки, цисты, споры. Наконец, многие микроорганизмы проявляют грамвариабельность. Чистоту культуры клеток проверяют также и путем повторного рассева (высева) на селективные среды, обеспечивающие избирательный рост тех или иных микроорганизмов. Критерием чистоты в этом случае является однородность формирующихся при этом колоний.

5 Массовая культура на плотной среде

Выращиванием колоний на плотной среде получают максимальную плотность клеток, поскольку в данном случае жидкость находится только в межклеточном пространстве. Если инокулят сильно разбавлен, каждая клетка в результате деления дает начало отдельной колонии. Это может быть полезным для массовой культуры, если отбор колонии ведут по одному признаку. Чаще инокулят бывает не разбавлен и его равномерно распределяют по всей поверхности среды. В этом случае микроорганизмы растут в виде сплошного газона. Массовая культура бактерий на плотной среде имеет ряд преимуществ по сравнению с культурой, выращиваемой в жидкой среде: ### 1 В случае культур, выращенных на плотной среде, нет

необходимости использовать центрифугу или другие средства для сбора клеток, поскольку в этих культурах клетки находятся уже в сконцентрированном состоянии. Особенно следует избегать центрифугирования при получении большого количества патогенных

или других вредных микроорганизмов, поскольку при этом образуются аэрозоли. ### 2 Массовые культуры бактерий на плотной среде относительно

свободны от макромолекулярных компонентов и полностью свободны от частиц питательной среды, так как последние обычно находятся внутри агарового геля. Такие культуры относительно свободны от низкомолекулярных питательных веществ и продуктов метаболизма микроорганизмов, поскольку для их растворения необходимы значительно большие объемы среды. Следовательно, культуры, выращенные на твердой среде, особенно полезны для приготовления антигенов или для других целей, когда важна чистота клеточной суспензии. ### 3 На твердых средах можно получать результаты, которые

невозможно достичь другим путем. Например, плодовые тела миксобактерий и эндоспоры определенных видов Bacillus образуются только при росте культур на твердой среде. Вместе с тем, выращивание микроорганизмов на твердых средах по сравнению с культивированием в жидкой среде имеет определенные недостатки: ### 1 Твердая культура имеет ограничения при выращивании больших

количеств биомассы. Она дает возможность легко получать граммы клеток; десятки граммов выращивать уже затруднительно, а сотни граммов или килограммы клеток на твердой среде в лаборатории вырастить невозможно. ### 2 Твердые культуры не обеспечивают однородность популяции

клеток, т. е. культура гетерогенна в физиологическом отношении. Например, клетки в верхней части твердой аэробной среды (слой глубиной до 1000 клеток) могут находиться в условиях низкого содержания питательных веществ, но высокого содержания кислорода, в то время как в нижних слоях среды условия могут быть противоположными. Гетерогенна культура и в техническом смысле, так как клетки микроорганизмов и питательная среда распределены неравномерно. ### 3 Твердые культуры характеризуются небольшим числом клеток в

пересчете на данное количество среды.

Вопросы для самоконтроля

1 Определите понятие «чистые культуры микроорганизмов».

2 Перечислите этапы выделения чистых культур микроорганизмов.

3 Определите понятие «накопительные культуры микроорганизмов».

4 Что такое «элективные условия» и каким образом они создаются в

лабораторных условиях? 5 Охарактеризуйте различные методы получения накопительных

культур микроорганизмов, укажите примеры. 6 Охарактеризуйте методы выделения чистой культуры.

7 Охарактеризуйте этап определения чистоты выделенной культуры,

и применяемые на этом этапе методы. 8 Перечислите преимущества и недостатки массовой культуры

бактерий на плотной среде.

Практическое занятие 4

Цель: ознакомление с этапами выделения чистой культуры;

определение чистоты выделенной исследуемой культуры: визуально, микроскопически и по однородности колоний.

Материалы и оборудование: лупа, микроскопы биологические,

предметные стекла, покровные стекла, спиртовки, бактериальные петли, иммерсионное масло, стерильные пипетки, пинцеты, держатели, фильтровальная бумага, спички, стерильная водопроводная вода, палочки ватные гигиенические, маркеры, дистиллированная вода для промывки, промывалки, кюветы, мостики, набор готовых растворов красок в штативе, спирт 960, культуры микрофлоры воздуха с предыдущего занятия. ### Ход работы

1 Ознакомиться с этапами выделения чистой культуры.

2 Зарисовать в рабочей тетради схему «Этапы выделения чистых

культур микроорганизмов». 3 Просмотреть выделенную на предыдущем занятии культуру

микроорганизмов. 4 Определить характер роста полученной культуры по штриху на

поверхности скошенной агаризованной среды в соответствии с указаниями п. 3 лабораторной работы 3. При выполнении визуального обследования микроорганизмов использовать лупу.

5 Полученные наблюдения описать согласно схеме таблицы 4.1,

зарисовать рост микроорганизмов по штриху. 6 Сделать выводы об однородности колоний микроорганизмов и,

соответственно, чистоте исследуемой культуры. 7 Приготовить препараты «раздавленная капля» и фиксированный

(простая окраска, по Граму, на наличие спор).

Таблица 4.1 – Описание роста микроорганизмов по штриху

8 Препараты микроскопировать использованием биологического

микроскопа, модель XSP–136 с объективами 10х и 100х. Отметить форму и сочетание клеток, подвижность, наличие или отсутствие спор. Сделать зарисовки. ### 9 Наблюдения и рисунки отметить в таблице 4.2. Под рисунком

указать увеличение микроскопа.

Таблица 4.2 – Особенности морфологии клеток микроорганизмов

10 Сделать выводы о чистоте исследуемой культуры на основании

микроскопирования материала.