Благодаря неисчерпаемому метаболическому потенциалу микроорганизмы используются человеком в самых различных целях, в том числе для решения экологических проблем. Экобиотехнология – направление науки и прикладной биотехнологии, изучающее теоретические и практические аспекты использования живых организмов в природоохранных целях. Одним из наиболее важных направлений экобиотехнологии является очистка окружающей среды от загрязнений природного и техногенного происхождения с помощью биологических объектов (биоремедиация). Впервые микроорганизмы стали использовать для очистки сточных вод от бытовых отходов еще в XIX в. Уже в начале ХХ в. начали применять систему аэробной очистки сточных вод с помощью активного ила и принудительной аэрации, что позволило существенно повысить скорость и эффективность процессов биоремедиации.

В настоящее время микроорганизмы используются для очистки сточных вод, газовоздушных выбросов, почв и водоемов, загрязненных в результате человеческой деятельности. Для очистки сточных вод применяют аэротенки, биофильтры, анаэробное сбраживание органических отходов в метантенках и биореакторах других конструкций. В процессах биологической очистки принимает участие сложная биологическая ассоциация, состоящая не только из бактерий, но и одноклеточных эукариотических организмов – грибов, простейших (амебы, жгутиковые и ресничные инфузории), микроскопических животных (коловратки, нематоды, водные клещи) и др. Эта сложная ассоциация в процессе биологической очистки формируется в виде активного ила или биопленки. Активный ил представляет собой темно-коричневые хлопья размером до сотен микрон, состоящие на 70 % из живых микроорганизмов и на 30 % из частиц неорганической природы. Микроорганизмы прикреплены к твердому носителю и вместе с ним образуют зооглей – симбиоз популяций микроорганизмов, покрытый общей слизистой оболочкой. Биопленка – это слизистое обрастание материала фильтрующего слоя очистных сооружений живыми микроорганизмами толщиной 1–3 мм. Аэротенк – это открытое сооружение, через которое пропускается аэрированная сточная вода и суспензия активного ила. Аэротенки относятся к гомогенным биореакторам. Типовая конструкция аэротенка представляет собой железобетонный герметичный сосуд прямоугольного сечения, связанный с отстойником. Аэротенк разделяется продольными перегородками на несколько коридоров (3–4). Процесс биоочистки в аэротенке состоит из двух этапов: 1) взаимодействие отстоявшихся сточных вод, содержащих взвешенные частицы и органические вещества, с воздухом и частицами активного ила в аэротенке в течение некоторого времени (от 4 до 24 ч и более, в зависимости от типа стоков, требований к глубине очистки и др.). Окисление органических веществ стоков микроорганизмами активного ила осуществляется в две стадии. На первой стадии микроорганизмы адсорбируют загрязняющие вещества стоков, на второй – окисляют их и восстанавливают свою окислительную способность. В ходе очистки происходит прирост биомассы активного ила, что приводит к его «старению» и снижению биокаталитической активности. Поэтому большая часть ила выводится из системы, а часть возвращается в реактор; 2) разделение вод и частиц активного ила во вторичном отстойнике. Биофильтр – это наиболее распространенный тип биореактора с неподвижной биопленкой, применяемый для очистки стоков и газовоздушных выбросов. В биофильтрах сточные воды или загрязненный воз

дух пропускают через слой крупнозернистого материала (фильтрующий слой), покрытого тонкой бактериальной пленкой, благодаря которой интенсивно протекают процессы биологического очищения. Особенностью насадки, или фильтрующего слоя, является высокая удельная поверхность для развития микроорганизмов и большая пористость. Пористость придает необходимые газодинамические свойства слою и способствует прохождению воздуха и жидкости через него. При просачивании сточных вод через материал фильтрующего слоя происходит ряд последовательных процессов: 1) контакт с биопленкой, развивающейся на поверхности частиц фильтрующего материала; 2) сорбция органических веществ поверхностью микробных клеток; 3) окисление веществ стоков в процессе микробного метаболизма. В биофильтре происходят непрерывный прирост и отмирание биопленки. Отмершая биопленка смывается током очищаемой воды и выносится из биофильтра. Очищенная вода поступает в отстойник, в нем освобождается от частиц биопленки и далее сбрасывается в водоем. Кроме аэробных способов очистки сточных вод существуют ана-эробные, несомненным преимуществом которых является высокая степень превращения углерода загрязняющих веществ при относительно низкой степени прироста биомассы. В процессе анаэробного сбраживания органических отходов сточных вод получают такой ценный продукт, как биогаз. Анаэробные процессы очистки происходят в септиктенках, метантенках, причем процессу сбраживания подвергаются не сами сточные воды, а осевший ил. Биодеградация загрязняющих веществ протекает в септиктенках на основе сложной микробной ассоциации и включает гидролитические процессы с участием ацидогенных, гетероацетогенных бактерий и метаногенерацию с участием метаногенов. Часто септиктенки используют для сбраживания ила из первичных отстойников (входящих в состав аэротенков). При этом объем ила заметно снижается, уменьшается количество патогенных микроорганизмов. Сброженный ил затем ликвидируют или закапывают. Очистка газовоздушных выбросов может осуществляться в биореакторах с орошаемым слоем. Микроорганизмы-деструкторы в таких биореакторах иммобилизованы на искусственных носителях (например, полиамидных волокнах). Важное условие эффективного функционирования биореакторов такого типа – поддержание влажности на постоянном оптимальном уровне, что достигается путем равномерного орошения носителя микроорганизмов.

Для очистки загрязненных водоемов и почв используют биопрепараты на основе микроорганизмов-деструкторов. Микроорганизмы вносят в почву или водоем в виде суспензии, а они также могут быть иммобилизованы на различных носителях, чаще всего природного происхождения (торф, древесные опилки, лузга). Нередко для повышения эффективности процессов очистки биопрепараты используются в комплексе с минеральными удобрениями. Первое место среди загрязнителей почвы и водоемов занимают нефть и нефтепродукты. Их нежелательное попадание в окружающую среду происходит на этапах добычи нефти, ее транспортировки и переработки. Нефть представляет собой сложную смесь, состоящую из более 1000 органических соединений различных классов (алифатические, ароматические моно- и полициклические, алициклические углеводороды) и неорганических примесей. Микроорганизмы, способные утилизировать нефть, распространены очень широко и могут быть выделены из любого типа почвы и воды. Однако при попадании нефти в почву или водоем в больших количествах происходит угнетение естественной микробиоты и резкое снижение ее численности, поэтому процессы самоочищения происходят крайне медленно. Восстановление микробиоты начинается с постепенного увеличения численности деструкторов нефти (углеводородокисляющих микроорганизмов). В средах с постоянным загрязнением нефтепродуктами наблюдается заметное преобладание данной группы микроорганизмов по численности. Способность использовать нефть в качестве источника углерода и энергии присуща не единичным специализированным формам, а многим группам микроорганизмов. Однако сложно представить себе организм, который мог бы утилизировать все компоненты нефти. Для каждого микроорганизма-деструктора характерен определенный спектр утилизируемых соединений, входящих в состав нефти. Наиболее часто деструкторы нефти встречаются среди представителей родов бактерий Rhodococcus, Pseudomonas, Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus, Cytophaga, Clostridium, Corynebacterium, Flavobacterium, Methanobacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, мицелиальных грибов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Fusarium, Trichoderma, дрожжей Candida, Endomyces, Rhodotorula, Saccharomyces, Torulopsis. Среди приспособлений, выработанных бактериями – деструкторами нефти, следует отметить способность к продукции поверхностноактивных веществ (ПАВ). Поскольку компоненты, входящие в состав

нефти, преимущественно гидрофобные, их проникновение в клетку затруднено. Различные группы микроорганизмов решают эту проблему разными путями: одни продуцируют ПАВ во внешнюю среду, повышая тем самым растворимость углеводородов нефти и их биодоступность (например, бактерии родов Bacillus, Pseudomоnas); другие вырабатывают клеточносвязанные ПАВ, которые повышают гидрофобность клеточной поверхности (Rhodococcus и иные нокардиоформные бактерии). В клетке углеводороды подвергаются ферментативному расщеплению моно- и диоксигеназами. Гены, кодирующие данные ферменты, организованы в кластеры и часто имеют плазмидную локализацию. Например, для бактерий рода Pseudomоnas описаны такие плазмиды, как OCT (определяет утилизацию алканов), TOL (определяет утилизацию моноароматических углеводородов), NAH (детерминирует утилизацию полиароматических углеводородов).

Контрольные вопросы

1. Дайте определение понятию «экобиотехнология». 2. Что представляют собой активный ил и биопленки? 3. Каково устройство и принцип действия аэротенка? 4. Каково устройство и принцип действия биофильтра? 5. Каковы преимущества анаэробного сбраживания органических отходов сточных вод перед аэробными способами очистки? 6. Почему при очистке почв и водоемов от загрязнений с использованием иммобилизованных микроорганизмов применяются преимущественно природные носители? 7. Приведите примеры нефтеокисляющих микроорганизмов. 8. Чем можно объяснить таксономическое разнообразие нефтеокисляющих микроорганизмов?

Лабораторная работа 7 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДЕСТРУКЦИЯ НЕФТИ

Цель работы: оценить микробиологическую деструкцию нефти представителями разных родов бактерий при различной температуре. Материалы и оборудование: ПДБ, жидкая минеральная среда М9, нефть, стерильные пробирки, пипетки на 1–2 мл и 5–10 мл, дозатор на 20–200 мкл, наконечники для дозатора на 20–200 мкл, спиртовка, шейкер, термостаты на 25 и 37 °С.

Ход работы 1. Культуры микроорганизмов – деструкторов нефти различных родов (Bacillus, Rhodococcus, Pseudomonas и др.), выращенные в ПДБ, в количестве 0,1 мл вносят в пробирки с 4 мл жидкой минеральной среды М9 (в двух повторах). В качестве контроля используют минеральную среду M9 без бактериальной культуры. 2. В пробирки вносят нефть (1 %) в качестве единственного источника углерода.

3. Одну серию пробирок, включая контрольную, инкубируют с аэрацией при температуре 25 °С, вторую – при температуре 37 °С в течение 7–14 суток, регистрируя изменения по сравнению с контролем каждый день. Результаты наблюдений вносят в таблицу (табл. 9).

КОНТРОЛЬ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ СТУДЕНТОВ

1. Какой из разделов экологической микробиологии изучает влияние внешних абиотических факторов на микроорганизмы: а) демэкология; в) аутэкология; б) комэкология; г) синэкология?

2. Кто считается основоположником экологической микробиологии: а) А. Левенгук; г) Д. К. Заболотный; б) Л. Пастер; д) Д. И. Ивановский; в) С. Н. Виноградский; е) В. Л. Омелянский?

3. Метабиоз – тип взаимоотношений между микроорганизмами, при котором: а) два или более вида микроорганизмов создают взаимовыгодные условия для развития друг друга; б) выгоду извлекает только один партнер; в) одна группа организмов использует в пищу другую группу?

4. С помощью чего получают накопительные культуры фотоавтотрофных, хемолитотрофных и хемогетеротрофных микроорганизмов: а) колонки Виноградова; в) батометра; б) колонки Виноградского; г) камеры Горяева?

5. Как называют организмы, способные существовать в относительно узких пределах изменений экологического фактора: а) амфибионты; г) гидробионты; б) эврибионты; д) эвритрофы? в) стенобионты;

6. Как называют интервал значений абиотического фактора, в котором наблюдаются оптимальные показатели жизнедеятельности организма:

а) зона лимитирования; б) область толерантности; в) зона оптимума; г) зона ингибирования?

7. Как называют группу микроорганизмов, способных расти при температуре от 0 до 35 °С, оптимальная температура роста которых сдвинута в сторону максимальной:

а) психрофилы; б) психротрофы; в) мезофилы; г) термотолерантные микроорганизмы?

8. К какой физиологической группе по отношению к температуре относят бактерии Escherichia coli:

а) психрофилы; б) психротрофы; в) мезофилы; г) термотолерантные микроорганизмы?

9. К какой физиологической группе по отношению к температуре относят бактерии родов Thermus, Thermomicrobium, Thermoplasma:

а) психрофилы; б) психротрофы; в) мезофилы; г) термофилы?

10. Чем обусловлено летальное действие высоких температур на микроорганизмы:

а) денатурацией клеточных белков; б) возникновением мутаций в ДНК; в) изменением проницаемости клеточной мембраны; г) нарушением синтеза пептидогликана; д) повышением вязкости цитоплазмы?

11. Какой параметр ограничивает нижний предел роста микроорганизмов: а) температура «застывания» мембраны; б) температура инактивации белков; в) температура ингибирования биосинтеза белка; г) температура нарушения проницаемости клеточной стенки?

12. Как называют микроорганизмы, оптимум роста которых находится в области низких температур: а) мезофилы; г) психрофилы; б) термофилы; д) ксилофилы; в) ксерофилы; е) галофилы?

13. Какой количественный параметр используют для оценки летального действия температуры на клетки микроорганизмов: а) термическую точку отмирания; б) летальную температуру; в) температурную точку ингибирования роста; г) точку термотолерантности?

14. Каким микроорганизмам для роста необходимо повышенное гидростатическое давление: а) барочувствительным; б) баротолерантным; в) барофильным?

15. Какие виды электромагнитного излучения оказывают физиологический эффект на клетки микроорганизмов: а) ионизирующее излучение (до 10 нм); б) ультрафиолетовое излучение (10–350 нм); в) ультрафиолетовое излучение (350–400 нм); г) видимый свет (400–800 нм); д) инфракрасное излучение (800–1100 нм)?

16. Какие биополимеры имеют максимум поглощения УФ-света в области 260 нм: а) ДНК; б) муреин; в) липополисахариды; г) белки?

17. Какие типы повреждений ДНК наиболее часто вызывает УФ-излучение:

а) образование пуриновых димеров; б) образование пиримидиновых димеров; в) образование циклобутановых мостиков между пурином и пиримидином одной цепи?

18. Какие существуют механизмы устранения повреждений ДНК, вызванных действием УФ-лучей на микробную клетку:

а) фотореактивация; г) темновая репарация; б) световая репарация; д) пострепликативная репарация? в) фотоокисление;

19. Бактерии какой формы более чувствительны к ультразвуку:

а) кокки; б) палочки; в) извитые формы?

20. Как называют клеточные структуры, позволяющие микроорганизмам ориентироваться в магнитном поле:

а) мезосомы; в) магнитосомы; б) рибосомы; г) магнитофоры?

21. Как называется среда, концентрация солей в которой выше, чем в клетке:

а) изотоническая; б) гипертоническая; в) гипотоническая?

22. Какой процесс происходит при помещении клетки в гипертонический раствор:

а) плазмолиз; в) цитолиз; б) метастаз; г) гидролиз?

23. В каком диапазоне концентраций соли растут умеренные галофилы:

а) 5–15 %; г) 3–5 %; б) 10–12 %; д) 5–7 %? в) 5–10 %;

24. Как называют низкомолекулярные нейтральные по отношению к метаболитам клетки органические соединения, уравновешивающие внешнее осмотическое давление:

а) ксеропротекторы; в) баропротекторы; б) осмопротекторы; г) криопротекторы?

25. Галоалкалифилы – физиологическая группа микроорганизмов, способная развиваться:

а) при повышенных концентрациях NaCl; б) при пониженных концентрациях NaCl; в) при повышенных концентрациях NaНCО3; г) при пониженных концентрациях NaНCО3?

26. К какой физиологической группе по отношению к рН среды относят бактерии Escherichia coli:

а) галофилы; в) ацидофилы; б) алкалофилы; г) нейтрофилы?

27. Как называют микроорганизмы, оптимум рН среды для которых смещен в щелочную сторону (рН 8,5–11,5):

а) ацидофилы; г) алкалифилы; б) нейтрофилы; д) ксерофилы? в) алкалофилы;

28. Какими требованиями относительно содержания молекулярного кислорода в среде характеризуются микроаэрофилы:

а) требуют наличия молекулярного кислорода, но в концентрации, ниже атмосферной; б) требуют наличия молекулярного кислорода, но в концентрации, выше атмосферной; в) не требуют наличия молекулярного кислорода; г) молекулярный кислород угнетает их рост?

29. Чем обусловлено токсическое действие молекулярного кислорода на клетки микроорганизмов:

а) инактивацией ферментов; б) нарушением синтеза белка; в) образованием высокореакционных форм кислорода;

г) изменением проницаемости цитоплазматической мембраны; д) повреждениями ДНК?

30. Как называют микробиоту, характерную для данного местообитания: а) аллохтонная; в) сапротрофная; б) автохтонная; г) автотрофная?

31. С помощью какого прибора осуществляется забор проб воды с разных глубин: а) барометра; в) статометра; б) батометра; г) камеры Горяева?

32. Какие группы бактерий относят к санитарно-показательным: а) актиномицеты; б) бактерии группы кишечной палочки; в) энтерококки; г) стафилококки?

33. Какие из перечисленных патогенных микроорганизмов постоянно обитают в почве: а) Clostridium botulinum; б) Salmonella typhi; в) Bacillus anthracis; г) Staphylococcus aureus?

34. Какой санитарный показатель называют коли-индексом: а) минимальное количество воды (мл), в котором обнаруживаются БГКП; б) количество БГКП, содержащихся в 1 л исследуемой воды; в) количество БГКП, содержащихся в 100 мл исследуемой воды?

35. Как называют направление прикладной биотехнологии, рассматривающее теоретические и практические аспекты использования живых организмов в природоохранных целях: а) экобиотехнология; б) агробиотехнология; в) агробиоценология; г) биоремедиация; д) микробиоценология?

36. Какие ферменты участвуют в расщеплении нефти в клетках бактерий-деструкторов: а) оксигеназы; г) лиазы; б) оксидазы; д) лигазы? в) гидролазы;

37. Какие микроорганизмы продуцируют клеточносвязанные ПАВ: а) бактерии родов Pseudomonas и Bacillus; б) бактерии родов Rhodococcus и Nocardia; в) бактерии родов Rhodococcus и Pseudomonas; г) бактерии родов Bacillus и Arthrobacter?

38. Как называют открытое очистное сооружение, через которое пропускаются аэрированная сточная вода и суспензия активного ила: а) биофильтр; г) метантенк; б) аэротенк; д) биореактор с орошаемым слоем? в) септиктенк;

39. Какие типы установок обеспечивают анаэробное сбраживание органических отходов: а) аэротенки; в) септиктенки; б) биофильтры; г) метантенки?

40. Утилизацию какого класса углеводородов обеспечивают гены, расположенные на NAH-плазмидах бактерий рода Pseudomоnas:

а) алифатических; б) гетероциклических; в) моноциклических ароматических; г) полициклических ароматических?