В пиве может развиваться только ограниченное число видов микроорганизмов, среди которых отсут­ствуют патогенные для человека и спорообразующие штаммы. Современная классификация микроорганиз­мов пива может быть представлена следующим обра­зом [136]:

грамположительные бактерии — каталазоотрица­тельные палочки — Lactobacillus; каталазоотрицатель­ные кокки или клетки, собранные в пакеты,— Pediococ- cus;

грамотрицательные бактерии — уксуснокислые бак­терии— Acetomonas и Acetobacter; бактерия Obesum- bacterium proteus; бактерия Zymomonas anaerobia; бак­терии группы кишечной палочки — Klebsiella и Esche­richia;

дикие дрожжи.

Грамположительные бактерии. Встречающиеся в пи­ве грамположительные бактерии, относящиеся к родам Lactobacillus и Pediococcus, часто объединяются под названием молочнокислых бактерий.

Как указывает Шимвэлл [208], термин «истинные молочнокислые бактерии» относится только к опреде­ленной группе бактерий, которые не только образуют молочную кислоту в качестве основного продукта пре­вращения углеводов, но и обладают другими характер­ными свойствами. Все они грамположительны, непод­вижны, не образуют спор, каталазоотрицательны и тре­буют в различной степени для роста сложную смесь продуктов распада белка и факторов роста. Автор [208] предлагает разделить группу молочнокислых бак­терий пива на два рода: Lactobacillus и Streptococcus (вместо названия Pediococcus). В литературе часто встречаются оба названия.

В качестве источников азота молочнокислые бакте­рии требуют целого набора аминокислот, сильно сбра­живают сахара, на белки действуют слабо, жиры почти не атакуют. Дыхательная способность их ограниченна, поэтому рост их усиливается в анаэробных или микро- аэрофильных условиях. Некоторые штаммы обладают способностью усваивать СО2, поэтому в атмосфере этого газа отмечается особенно сильный рост. Оптимум pH для роста — примерно 5,5, но некоторые штаммы могут расти при pH 3,5.

Бактерии рода Pediococcus и некоторые штаммы Lactobacillus являются гомоферментативными бакте­риями, т. е. образуют из сахара в основном молочную кислоту. Другие штаммы Lactobacillus, например наи­более часто встречающийся в пиве вид L. pastorianus, являются гетероферментативными бактериями, обра­зующими из сахара наряду с молочной кислотой уксус­ную кислоту, глицерин, этанол и СОг.

В пиве встречаются следующие виды Lactobacillus: L. pastorianus, L. pastorianus var. brownii, L. diastati- cus, L. lindneri, L. malefermentans, L. fridigus и L. par­vus. L. lindneri и L. fridigus имеют более низкий опти­мум температуры (19° С) для роста, чем L. pastorianus, и встречаются почти исключительно при низовом бро­жении. L. malefermentans и L. parvus отличаются от L. pastorianus по набору сахаров, которые поддержи­вают рост. L. diastaticus особенно устойчив к этанолу и хмелевым смолам и характеризуется также способ­ностью гидролизовать декстрины и крахмал.

Гетероферментативные штаммы обычно имеют вид длинных палочковидных клеток, однако часто наряду с длинными могут встречаться и короткие палочки, еди­ничные или соединенные в пары. Размеры клеток 1,ОХ (5-4-120) мкм.

Хмелевые смолы и изомеризованные продукты в об­щем ингибируют рост молочнокислых бактерий, однако виды, обычно встречающиеся в пиве, в значительной мере утратили свою чувствительность к этим ингиби­торам, очевидно, приспособившись к условиям, сущест­вующим в пиве. Было показано [136], что устойчивость к гумулону и его производным быстро создается у ряда штаммов и достаточно 2—5 пассажей, чтобы ре­зистентность к этим веществам в концентрации 100 мг/мл повысилась в 8—20 раз.

Многие молочнокислые бактерии способны образо­вывать в пиве диацетил. Запах диацетила чувствуется уже в концентрации 0,0025 мкг/мл (раньше образова­ние больших количеств диацетила называли «сарцин- ной болезнью» пива; считалось, что это заболевание вызывается определенной сарциной — Pediococcus по современной номенклатуре).

Как гомоферментативные, так и гетероферментатив- ные молочнокислые бактерии являются ауксотрофными по ряду специфических аминокислот и часто не способ­ны расти при отсутствии хотя бы одной из них. К числу таких необходимых для роста аминокислот относятся аргинин, аспарагиновая и глютаминовая кислоты, изо­лейцин, лейцин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан и валин. Кроме того, некоторые штаммы требуют для роста аланин, глицин, гистидин, лизин, метионин и тирозин, т. е. почти все аминокислоты не­обходимы для роста молочнокислых бактерий. Различ­ные молочнокислые бактерии требуют определенных витаминов и факторов роста, таких, как р-аминобен- зойная и фолиевая кислоты, а также некоторые пури­ны и пиримидины.

Количество образующейся молочной кислоты зави­сит от концентрации углеводов, ассимилируемых мо­лочнокислыми бактериями. Биохимические пути прев­ращения углеводов у молочнокислых бактерий разнооб­разны. Гомоферментативные штаммы, такие, как Pe­diococcus, используют гликолитический путь, приводя­щий к образованию пировиноградной кислоты, которая, действуя как акцептор водорода, превращается в молочную кислоту. Этот процесс катализируется дегид­рогеназой молочной кислоты. Полагают, что помимо этого пути гомоферментативные штаммы используют гексозомонофосфатный и, возможно, фосфокетолазный путь в том случае, когда развиваются на пентозах (рис. 1).

Гетероферментативные штаммы не имеют фермен­тов альдолазы и гексозоизомеразы, необходимых для осуществления гликолитического механизма, поэтому превращение гексоз и пентоз этими штаммами происхо­дит По .фосфокетбл'азйому пути. Ключевой реакцией е этом' механизме, является расщепление пентозо-5-фос- фата до ацетилфосфата й глицеринового альдегида, катализируемое фосфокетолазой. Фруктоза является лучшим, чем глюкоза, ’ субстратом для роста гетеро-

Рис. 1. Фосфокетолазный путь превращения углеводов.

ферментативных штаммов и в том случае, когда при­сутствуют оба сахара, действует как акцептор водорода и восстанавливается до маннита.

Мальтоза также легко используется бактериями, причем имеются штаммы, которые, потребляя мальто­зу, не могут использовать глюкозу [254]. Следовательно, превращение мальтозы идет не по пути ее гидролити­ческого расщепления на две молекулы глюкозы. Уста­новлено, что у этих штаммов отсутствует фермент мальтаза и превращение мальтозы катализируется ферментом мальтофосфорилазой, под влиянием которо­го из половины молекулы мальтозы образуется р-глю- козо-1-фосфат, а вторая половина молекулы выделяет­ся в среду в виде глюкозы:

Мальтоза + (РО₄)^3—         (3-Глюкозе-1-фосфат + Глюкоза.

Этот путь образования фосфорилированной молеку­лы глюкозы имеет определенную биологическую целе­сообразность, поскольку в нем не происходит потреб­ления макроэргических соединений типа АТФ. Возмож­но, что образование в результате реакции из мальтозы глюкозы способствует симбиотическому развитию дру­гих видов и штаммов бактерий, предпочитающих глю­козу.

Пентозы также могут служить субстратом для ро­ста молочнокислых палочек, но после некоторого пери­ода адаптации.

В работе [54] было показано, что три штамма Lactobacillus, выделенные из пива, обладали способ­ностью образовывать на пептонной среде с различными углеводами небольшое количество кислоты только лишь на арабинозе, в то время как на дрожжевой воде с различными сахарами и спиртами эти бактерии обра­зовывали кислоту на многих веществах [18].

Встречающиеся в пиве лактобациллы проявляют широкую вариабельность свойств [129].

Наиболее широко и часто встречающийся в пиве вид — это L. pastorianus. Шимвэлл [208] отмечает, что до настоящего времени биологическая стойкость пива является синонимом, его резистентности к развитию именно этого микроорганизма. L. pastorianus открыт Пастером и впервые выделен в чистую культуру и опи­сан Ван-Лаэром в 1892 г.

Морфология микроорганизма зависит от среды и условий культивирования. Так, высокий процент спирта в пиве приводит к образованию более длинных палочек, при выращивании на сусле или сусло-агаре микроорга­низм иногда растет в виде довольно коротких палочек. На поверхности твердых сред образует неправильной формы ризоидные колонии (рис. 2), не растет или поч­ти не растет на средах животного происхождения. Максимальная температура для роста 38° С. В неохме- ленном сусле при pH 5,4 погибает через 5 мин при тем­пературе 54° С, в пиве при pH 4,2 — через 5 мин при температуре 49° С.

Повышенное содержание хмеля задерживает рост L. pastorianus. Спирт проявляет сильное бактерицид­ное действие только в концентрации около 8%.

В пиве встречаются следующие виды кокковидных молочнокислых бактерий, относящихся к роду Pedio- coccus: Р. damnosus, Р. damnosus var. viscosus, P. dam- nosus var. diastaticus, P. damnosus var. limnosus, t. c. все эти виды являются вариантами одного основного вида — Р. damnosus (синонимы: Streptococcus damno­sus, Р. perniciosus, Р. cerevisiae, Р. sarcinoformis). Пе- диококки встречаются главным образом в пиве низового брожения и очень редко — в пиве верхового брожения. Оптимум температуры для роста 21—25° С, однако пе- диококки способны развиваться и при более низкой температуре.

Рис. 2. Микроколонии L. pastorianus на сусло-агаре.

Кокки могут находиться в виде одиночных клеток, а также в парах, тетрадах, коротких цепочках или в виде скоплений. Разные штаммы различаются по спо­собности превращать глюкозу, фруктозу, мальтозу и сахарозу: так, Р. damnosus var. diastaticus способен использовать декстрины и крахмал, но в отличие от других штаммов не образует диацетила. Образование значительного количества диацетила является особен­но характерным признаком педиококков. Пиво при сильной инфицированности этими микроорганизмами приобретает медовый аромат («сарцинное заболева­ние») .

Варианты viscosus и limnosus вызывают ослизнение пива при развитии на глюкозе, фруктозе, сахарозе или мальтозе.

Все штаммы молочнокислых бактерий образуют в пиве шелковистую муть, повышают его кислотность и ухудшают вкус и аромат за счет выделения продуктов метаболизма. Помимо некоторых вариантов Р. damno- sus штаммы L. pastorianus var. brownii могут также вызвать ослизнение пива в результате образования экстрацеллюлярной слизи, которая содержит комплекс­ный гетерополимер, состоящий из глюкозы, маннозы, белка и нуклеиновой кислоты. Полагают, что слизеоб­разующие штаммы случайно возникают из штаммов, лишенных этой способности, и, наоборот, из слизеобра­зующих штаммов в результате мутации могут появ­ляться штаммы, не способные к образованию слизи.

Грамотрицательные бактерии. Уксуснокислые бактерии. В зависимости от интенсивности и глу­бины окислительных процессов уксуснокислые бакте­рии могут быть разделены на два рода — Acetomonas и Acetobacter.

К роду Acetomonas (прежнее название Gluconobac- ter) относятся уксуснокислые бактерии с ограниченной окислительной способностью: они окисляют этанол только до уксусной кислоты. Отличительной морфоло­гической особенностью подвижных видов этого рода является полярное жгутикование. Бактерии имеют вид коротких палочек, единичных, в парах или цепочках, некоторые виды подвижны. Размеры клеток (0,4— 0,8) Х( 1,0—2,0) мкм.

Виды Acetomonas могут быть отнесены к глюко­филам: они хорошо растут на глюкозе, но плохо или совсем не растут на лактате, довольно требовательны к составу питательной среды для роста [209].

К роду Acetobacter принадлежат уксуснокислые бактерии с более сильной окислительной способностью: они окисляют этиловый спирт до СО₂ и Н₂О и могут быть отнесены к лактофилам, так как хорошо растут на лактате. Эти виды неприхотливы к составу пита­тельной среды, и их покоящиеся культуры обладают способностью использовать глютаминовую кислоту. Морфологически они аналогичны Acetomonas, но большей частью подвижны и имеют перитрихиальное жгутикование.

Некоторые штаммы Acetobacter для превращения глюкозы используют гексозомонофосфатный путь и цикл трикарбоксильных кислот. У других штаммов пе­ред началом этого пути может происходить окисление глюкозы до глюконата, после чего глюконокиназа обра­зует глюконат-6-фосфат. У третьих штаммов способ­ность к фосфорилированию полностью утеряна и глю­коза окисляется через глюконат до 2- или 5-оксоглю- коната или даже до дикетоглюконата или у-пирона.

У видов Acetomonas гексозомонофосфатный путь может функционировать, но отсутствуют некоторые ферменты цикла трикарбоксильных кислот (например, дегидрогеназа изолимонной кислоты), поэтому глюкоза обычно окисляется только до глюконовой кислоты.

Потребности в источнике азота у бактерий обоих родов уксуснокислых бактерий различны: штаммы Ace­tobacter могут хорошо развиваться на аммонийном азоте, штаммы Acetomonas требуют присутствия неко­торых аминокислот (глютаминовой, пролина или аспа­рагиновой) или соответствующих кетокислот, участ­вующих в реакциях трансаминирования.

Уксуснокислые бактерии малочувствительны к низ­кому значению pH и к фитонцидному действию хмеле­вых смол и их изомеризованных продуктов. Эти свой­ства, а также неприхотливость в отношении используе­мых питательных веществ приводят к широкому, пов­семестному распространению уксуснокислых бактерий в пивоварении. Именно эти бактерии наряду с Lactoba­cillus являются наиболее частой причиной изменения кислотности и вкуса пива и появления в нем мути, а иногда и пленки на поверхности пива в бутылке.

Сообщалось [136] о выделении некоторыми штамма­ми (например, Acetobacter rancens) токсина, убиваю­щего дрожжевые клетки. В то же время при низкой концентрации уксуснокислых бактерий, инфицирующих пиво, отмечалось их постепенное отмирание и отсут­ствие роста в пиве.

Следовательно, для проявления отрицательного влияния этих бактерий на прозрачность, вкус и кислот­ность пива большое значение имеет величина вносимой инфекции (степень инфицированности). Уксуснокислые бактерии, так же как и молочнокислые, характеризуют­ся большим разнообразием свойств, поэтому определе­ние видовой принадлежности часто затруднено.

В 1912 г. в Англии был выделен штамм, вызываю­щий повышение вязкости пива,— Acetobacter viscosum. В последующем были обнаружены A. capsulatum и A. turbidans, дающие сильную муть в пиве в присут­ствии небольших количеств кислорода. Особенностью A. turbidans является то, что при температуре 13° С, когда растет он медленнее, чем при комнатной темпе­ратуре, возникает более интенсивное помутнение гото­вого продукта.

Широко распространены в задаточных дрожжах и пиве виды A. aceti, A. acetosum, A. suboxydans. A. mo­bile выделен из бутылочного пива, где он развивается очень быстро, вызывая помутнение и образование тон­кой пленки на поверхности, позже — порошковидного осадка. Может расти в условиях ограниченного содер­жания кислорода и подобно A. turbidans должен счи­таться факультативным аэробом; в пиве образует ук­сусную кислоту.

Вид A. acidum-polymyxa характеризуется сильным образованием слизи при росте в сусле с pH 4,5, т. е. при пониженной кислотности, или в сусле с добавле­нием этилового спирта.

Уолкер и Кулка [240] поставили многочисленные экс­перименты для выявления особенностей развития в пиве различных видов ускуснокислых бактерий. Они устано­вили, что при развитии видов A. aceti, A. capsulatum, A. acidum-polymyxa, A. mobile и A. turbidans тип, вкус и аромат пива полностью портятся, оно сильно мутнеет. Некоторые виды (A. ascendes, A. acetigenus, A. visco­sum), давая сильное помутнение, вкус пива не портят.

По мнению этих исследователей, наиболее опасны­ми для пива уксуснокислыми бактериями являются ви­ды A. acidum-polymyxa, A. mobile, A. turbidans и A. viscosum, так как они способны развиваться в пиве с низким содержанием воздуха так же легко, как и в пиве, имеющем избыток воздуха. Затем идут A. aceti и A. capsulatum.

Поскольку виды A. acetosum, A. capsulatum, A. su­boxydans и A. viscosum не используют уксусную кис­лоту, они должны быть отнесены к роду Acetomonas.

При пастеризации погибают все штаммы уксусно­кислых бактерий. Так, A. turbidans погибает при нагре­вании пива в течение 5 мин при 54° С или 10 мин при 52° С. Этот штамм наиболее устойчив к действию спир­та (переносит концентрацию 10% спирта), для осталь­ных штаммов содержание 6% спирта является пре­дельным.

Бактерия Obesumbacterium proteus [210]. Этот микроорганизм (раньше его относили к роду Flavobacterium) обладает способностью развиваться конкурентно с активно почкующимися дрожжами.

О. proteus имеет вид коротких толстых палочек, не­подвижных, часто соединенных в цепочки. Клетки мо­гут варьировать по своей форме. Размеры клеток (0,8—1,2) X (1,5—4,0) мкм.

Бактерия является факультативным анаэробом с оптимумом pH 6,0, рост часто отсутствует, если pH 4,5 и ниже. Использует для своего развития различные моно- и дисахариды, крахмал не гидролизует, требует наличия многих аминокислот (аспарагиновая, глютами­новая, цистин, треонин, лейцин, аргинин, гистидин и глицин). Некоторые штаммы могут расти в присутствии только глютаминовой кислоты и аргинина. Необходимы для роста урацил и аденин. Не требуют для развития витаминов группы В.

Скорость развития бактерий зависит от интенсивно­сти почкования культурных дрожжей. Рост бактерий происходит в первые 24 ч после начала брожения и идет особенно интенсивно в том случае, когда отме­чаются длительная лаг-фаза и медленное разбражива- ние сусла дрожжами. В результате интенсивного раз­вития микроорганизма пиво приобретает запах пастер­нака (запах обусловлен образованием дпметилсуль- фида).

Быстрое размножение дрожжей и падение при этом pH сбраживаемого пива подавляют развитие О. pro­teus. Если задаточные дрожжи сильно инфицированы О. proteus, pH пива остается высоким и уменьшения популяции бактерий так сильно, как обычно отмечает­ся, не происходит. В этом случае бактерии могут сох­раняться в разлитом пиве.

Бактерия Zymomonas anaerobia (преж­нее название рода Achromobacter). Этот микроорганизм отличается сильной подвижностью. Клетки средней дли­ны, размером (1,0—1,5) X (2,0—3,0) мкм, имеют 1—5 по­лярных жгутиков. Строгий анаэроб, растущий при ши­роком диапазоне pH (3,5—7,5). Оптимум температуры 30° С, но может расти и при более низкой температуре. Использует глюкозу и фруктозу, иногда сахарозу, но не может потреблять мальтозу. Это, а также то, что для

Рис. 3. Путь превращения углеводов микроорганизмами (по Энтнеру — Дудорову).

обильного роста организма требуется широкий набор аминокислот, липоевая кислота и биотин, обусловлива­ют сравнительно редкое появление в пиве Z. anaerobia. Если же условия благоприятствуют развитию этой бак­терии, она может испортить пиво в течение нескольких часов.

Бактерии группы кишечной палочки. Эти бактерии в сусле и пиве представлены рядом видов факультативных анаэробов, относящихся к родам Klebsiella (прежнее название Aerobacter) и Escherichia. Эти роды включают очень много видов, широко рас­пространенных в почве, на растительных остатках и в воде, имеют вид коротких палочек, иногда почти шаро­образной формы, по Граму окрашиваются отрицательно, спор не образуют. Оптимум pH для роста 5,0—7,5, при pH 4,0 и ниже рост прекращается.

Подобно бактерии Obesumbacterium proteus бакте­рии группы кишечной палочки очень быстро растут в сусле и образуют большое число различных метаболи­тов, влияющих на вкус и аромат пива, которое стано­вится сладковатым с фруктовым привкусом или приоб­ретает запах вареной капусты [136]. В результате жиз­недеятельности может образоваться и сероводород. Эти бактерии обладают разнообразной биохимической ак­тивностью. Например, превращение глюкозы может ид­ти гликолитическим и гексозомонофосфатным путями, а также с использованием механизма Энтнера—Дудорова (рис. 3).

Пировиноградная кислота, образующаяся в этих ре­акциях, в кислых условиях может давать молочную и уксусную кислоты, этанол, СО2 и водород.

Бактерии рода Klebsiella обладают способностью конденсировать две молекулы пировиноградной кисло­ты, образуя ацетоин и СО₂. Ацетоин, являясь акцепто­ром водорода, дает 2,3-бутандиол.

Клетки бактерий Klebsiella короткие, единичные, не­подвижные, размер их (0,5—0,8) X (1,0—2,0) мкм. Бак­терии могут размножаться как в сладком, так и в ох­меленном сусле даже при температуре 40° С, увеличи­вая за 7 ч число клеток в миллионы раз, могут сохра­няться и в готовом пиве.

Наличие бактерий группы кишечной палочки явля­ется показателем санитарного состояния производства и соблюдения персоналом правил личной гигиены [31], поскольку эти бактерии обычно живут в кишечнике здо­ровых людей и животных, являясь типичными предста­вителями фекальных бактерий.

Бактерии группы кишечной палочки могут попасть в пиво в результате использования недостаточно чистой воды, из воздуха, от загрязненных рук и одежды рабо­чих, с возвратной тарой и т. д. Наличие бактерий этой группы характеризуется двумя взаимозаменяемыми по­казателями:

• коли-титром — наименьшим объемом жидкости, в котором обнаруживается хотя бы одна бактерия. Для воды коли-титр по ГОСТу должен быть не ниже 300. Для пива коли-титр не регламентируется, но он не дол­жен значительно отличаться от коли-титра водопровод­ной воды;
• коли-индексом—количеством бактерий в 1 л жид­кости.

Дикие дрожжи. В пивоваренных материалах часто обнаруживаются клетки различных видов диких дрож­жей. Вайлес [249] выделил 27 штаммов дрожжей, в том числе из хмеля 12, из задаточных дрожжей 11. Оказа­лось, что порчу пива вызывают 11 штаммов, выделен­ных из различных источников.

Наиболее часто встречаются дикие виды Saccharo- myces cerevisiae, Pichia membranaefaciens, Torulopsis sp. и Candida sp., реже — Hanseniaspora, Kloeckera, Rhodotorula.

Бреди [94] исследовал дикие дрожжи, инфицирую­щие культурные дрожжи, на ряде пивоваренных заво­дов. Всюду были обнаружены Pichia membranaefaciens, Candida mycoderma, Torulopsis colliculosa и T. incons- picula [18], реже встречались дрожжи родов Candida, Debaryomyces, Hansenula и Rhodotorula. Разводку за­даточных дрожжей высевали на специальную среду, со­держащую лизин в качестве единственного источника азота. На этой среде виды Saccharomyces не росли, ос­тальные виды образовывали колонии. На 10 млн. клеток культурных дрожжей приходилось 1—30 клеток диких дрожжей, в одном случае — 410 клеток.

Фин и Гусева [75] из 35 образцов пива выделили в чистую культуру 38 штаммов дрожжей, половина из ко­торых была представлена культурными дрожжами. Рас­пределение выделенных штаммов диких дрожжей пред­ставлено в табл. 8.

Таблица 8 Таксономия диких дрожжей, выделенных из пива

Из данных табл. 8 видно, что большинство выделен­ных дрожжей принадлежит к роду Saccharomyces. Пор­ча пива, обусловленная дикими дрожжами, может про­являться в помутнении, образовании пленки на поверх­ности и в изменении вкуса и аромата. Sacch. diastaticus, способные сбраживать декстрины, обладают глюкоами­лазной активностью и расщепляют а-1,4-связи в нераз- ветвленных молекулах мальтодекстринов. Хроматогра­фический анализ показал, что при инфицировании S. diastaticus в пиве увеличивается содержание высших спиртов и эфиров (в мг/л): этилацетата 38, пропилово­го спирта 40, изоамилацетата 7,6 (контрольное пиво со­держало соответственно 9, 11, 5 и 1,5 мг/л) [158].

Было найдено, что S. cerevisiae var. turbidans могут вызвать помутнение бочкового пива даже в том случае, если на 1,6-10⁸ клеток культурных задаточных дрожжей приходится всего одна клетка их.

Дрожжи Pichia и Candida могут окислять этанол.

Помутнение пива, вызываемое дикими дрожжами, обусловлено тем, что эти дрожжи медленнее оседают и плохо отделяются при фильтрации; некоторые дикие дрожжи не погибают даже при пастеризации.

Полагают, что имеются существенные различия меж­ду культурными и дикими дрожжами в образовании эфиров, высших спиртов, дикетонов и других продуктов, имеющих большое значение для формирования вкуса и запаха пива [149]. Однако в этом направлении требу­ются дальнейшие исследования.