Ячменное зерно, так же как и зерна других злаков, содержит определенное количество белков. Содержание белка в зерне ячменя колеблется в широких преде­лах— от 7 до 26%, но для пивоварения применяются специальные сорта с низким содержанием белка (9— 11%), так как с увеличением в зерне белка уменьша­ется содержание крахмала, что приводит к снижению основного экономического показателя производства — выхода экстракта.

Тем не менее белки играют важную роль в техноло­гии пива и оказывают существенное влияние на его качество. Низко- и среднемолекулярные продукты фер­ментативного гидролиза белков, происходящего на ста­диях солодоращения и затирания, — аминокислоты и пептиды — обеспечивают азотистое питание дрожжей и участвуют в сложных процессах метаболизма дрожже­вой клетки.

По мере изучения влияния белков на технологиче­ский процесс и качество готового пива было установле­но, что помимо влияния на коллоидную стойкость бел­ки определяют такие важные свойства пива, как пени­стость и полнота вкуса. Для регулирования этих свойств необходимо знание не суммарного количества белка, а изучение отдельных групп или даже индивидуальных белков.

Термином «белки» или «полипептиды» обозначают группу веществ, различающихся как по строению, так и по свойствам. Как известно, белки являются биоло­гическими полимерами, построенными из цепочек ами­нокислотных остатков, соединенных пептидной связью —СО—NH—. В состав белков входит около 20 ами­нокислот, но каждый белок характеризуется совершен­но индивидуальной структурой, обусловленной числом и последовательностью отдельных аминокислот в нем. Различают 4 уровня структурной организации белков (первичная, вторичная, третичная и четвертичная) [41, 43].

В настоящее время с помощью рентгено-структурно­го анализа, физико-химических и биохимических мето­дов расшифрована структура многих белков на всех уровнях организации. В конце 60-х годов впервые осу­ществлен синтез полипептидной цепи (124 аминокис­лотных остатка), обладающей ферментативной (рибо­нуклеазной) активностью [43].

Белки ячменя, солода, сусла и пива еще не изучены с нужной степенью детализации, и в большей части исследовательских работ, посвященных белкам в пивоварении, речь идет о всей совокупности этих ве­ществ,

Наиболее широко известная классификация белков, предложенная Осборном [152] в 1895 г. и не утратив­шая своего значения до настоящего времени, основы­вается на разделении белков на группы в зависимости от растворимости их в различных растворителях (табл. 13).

Таблица 13 Фракции белка ячменя

Бишоп [152] объединил две первые группы в одну группу водо- и солерастворимых белков. В последую­щем было установлено, что гордеины отличаются от альбуминов и глобулинов высоким содержанием глю­таминовой кислоты и пролина, а также тем, что тесно соединены в зерне с антоцианогенами, от которых их не удается отделить обычными приемами фракциони­рования [41].

Глютелины растворяются только в присутствии вос­становителей, по своему аминокислотному составу, со­держанию глютаминовой кислоты и пролина они при­ближаются к гордеину.

Шьернинг дифференцировал азотсодержащие веще­ства ячменя, солода, сусла и пива посредством фрак­ционного осаждения солями металлов. Лундин и Шро- дерхайм фракционировали азот сусла и пива осажде­нием танином и фосфомолибденовой кислотой [71]. Эти более старые методы фракционирования позволили разделить белки на несколько групп и получить общее представление о количественной стороне превращения исходного белка. Однако исследовать отдельные белки этими методами было невозможно.

Детализация белкового состава ячменя, солода, сус­ла и пива началась в 40-е годы с появлением таких методов, как ультрацентрифугирование, электрофорез, в последующем — ионообменная хроматография, гель­фильтрация, иммуноэлектрофорез, изоэлектрическая фокусировка.

В 1942 г. Квенсел [152], пользуясь методом ультра­центрифугирования, разработанным Сведбергом, разде­лил глобулины ячменя на 4 группы, различающиеся по молекулярной массе и некоторым другим свойствам (табл. 14).

Таблица 14

Характеристика некоторых фракций белков ячменя

Северборн, Даниэльсон и Сведберг [152] нашли p-фракцию глобулинов только в ячмене и не обнаружи­ли его в пшенице, рисе, овсе и других злаках, а- и у- Фракции, наоборот, были обнаружены во всех злаках. Они установили также, что различные фракции глобу­линов локализуются в различных частях семени ячме­ня: у-фракция — в зародыше, а- и [5-фракции — глав­ным образом в алейроновом слое. Согласно Дьюртоф- ту, a-фракция составляет большую часть (50—80%) солерастворимых белков ячменя. Во время солодора- щения количество [1-фракции не изменяется, а — не­сколько уменьшается, у —уменьшается сильно,, а 6- фракция в солоде уже не обнаруживается [ПО].

Исследованиями многих ученых установлена многог компонентность каждой из фракций белков ячменя [71]. Так, Эн а ри [113] и Микола, фракционируя альбумины на колонке с ионообменником (ДЕАЕ — целлюлоза), нашли, что альбуминовая фракция состоит по меньшей мере из 16 компонентов. Многокомпонентной оказалась и фракция гордеинов.

Вальдшмидт— Лейтц разделил фракцию гордеинов на 7—8 отдельных компонентов, которые он обозначил как a-компонент (около */з части общего количества гордеина), [3- и у-компоненты (около ^!/б всего гордеи- на), 6- и е-компоненты, составляющие вместе половину общего количества гордеина. Эти компоненты различа­лись по содержанию глютаминовой кислоты и пролина^- а —33,7%, р и у —39,1%, би е —49% [7*1].

Для изучения водо- и солерастворимых белков яч­меня были применены различные методы, но наиболь­шие успехи достигнуты при использовании иммуно­электрофореза. В этом методе сочетаются два исследо­вательских принципа: подвижность белка в электриче­ском поле, зависящая от его заряда, и специфическая реакция между антигеном (изучаемым белком) и анти­телами, содержащимися в сыворотке крови иммунизи­рованного к этому белку животного. Исследования в этом направлении проводились в Пастеровском инсти­туте во Франции (Грабар, Доссан), Финляндии (Эна- ри, Нумми и др.) и других странах [106, 117].

Специальный подкомитет ЕВС по белкам ячменя отмечает, что иммуноэлектрофорез представляет собой простой по выполнению метод, характеризующийся вы­сокой чувствительностью и хорошей воспроизводи­мостью. Этот подкомитет сделал попытку разработать систему обозначения солерастворимых белков ячменя на основе иммуноэлектрофоретического метода. Для этого в Пастеровском институте вырабатывается стан­дартная сыворотка от кроликов, иммунизированных к солерастворимым белкам ячменя.

Получаемые на электрофореграммах в агарозном геле дуги преципитации (осадок, образующийся при соединении антигена — белка ячменной вытяжки и ан­титела сыворотки) обозначаются буквами латинского алфавита, начиная от белка, ближайшего к аноду [23]. Подкомитет по белкам ячменя считает это первым шагом в деле последующего, более глубокого изучения каждого индивидуального белка по таким критериям, как молекулярная масса, растворимость, физиологиче­ские свойства, химическая структура, аминокислотный состав и концевые группы.

Пользуясь этим методом, Грабар, Доссан, Нумми И др. [106, 117] установили, что в солевой вытяжке из ячменя имеется свыше 20 различных компонентов. Одни из них обладают свойствами альбуминов, другие — гло­булинов.

Между белками ячменя и солода отмечается опре­деленная разница в интенсивности отдельных дуг пре­ципитации, но в основном характер разделения одина­ков. Большая часть белков солода в сусле уже не об­наруживается. При кипячении сусла значительная часть растворенных белков выпадает (свертывается) или раз­рушается, так что в растворе остаются только немногие компоненты.

В готовом пиве можно обнаружить 2—4 иммуноло­гически активных компонента, причем эти компоненты переходят из ячменя, а не образуются в процессе пи­воварения. Они обладают высокой устойчивостью про­тив тепловой коагуляции и длительного пребывания во время выдержки при низкой температуре.

С помощью иммуноэлектрофореза установлена иден­тичность между белками холодной мути и белками пива и сусла: белки мути реагируют с антителами сы­вороток, полученных иммунизацией кроликов к белкам пива и сусла. Установлено, что все антигены мути, за исключением одного компонента, имеются уже в ячме­не. Считают, что он происходит из дрожжей или из солода. Из двух других компонентов один, имеющийся в большем количестве, основной антигенный компонент, по мнению авторов [106], происходит из альбумина ячменя, причем он существует в виде различных по величине молекул—молекулярной массой 15 000— 100 000. По электрофоретической подвижности он отли­чается от своего предшественника в ячмене: белок мути в процессе хранения пива делается кислее и движется несколько быстрее в сторону анода. Это явление объяс­няют происходящей при хранении пива ассоциацией между белками и полифенолами, в результате которой блокируются положительные заряды белковой молеку­лы и изменяется ее электрофоретическая подвижность.

Второй антигенный компонент холодной мути, не­сколько менее подвижный, чем основной, является, не­видимому, продуктом частичного превращения гор­деина.

Предложен новый вариант метода иммуноэлектро- фореза, названный методом количественного попереч­ного иммуноэлектрофореза [132]. В этом методе смесь белков распределяется в одном направлении в геле, затем подвергается иммуноэлектрофорезу в перпенди­кулярном направлении. С помощью этого метода в со­левой вытяжке из ячменя обнаружено 54 иммунохими­чески различающихся белка, в то время как в систему обозначения белков ячменя ЕВС включено только 24 белка.

Метод иммуноэлектрофореза имеет некоторые недо­статки и ограничения. Так, не все белки обладают оди­наковой иммунологической активностью. Антигенная активность белка зависит от наличия в его молекуле значительного количества аминокислот с ароматически­ми радикалами. Кроме того, необходимость получат^ имунную сыворотку усложняет проведение анализа.

Большей разрешающей способностью в выявлении отдельных белков обладает метод изоэлектрической фо­кусировки. Метод основан на разделении белков по их изоэлектрической точке. Наиболее простым, чувстви­тельным и воспроизводимым вариантом метода явля­ется дисковая электрофокусировка в полиакриламид­ном геле. Этим методом в диапазоне pH 3—6 в пиве было найдено 14 различных белков [230].

Нарцисс и Каттейн [171] с помощью этого метода в диапазоне pH 3—10 проследили изменения белков ог ячменя до готового пива. Установлена сильная много- компонентность каждого из изучаемых объектов (экст­ракты из ячменя и солода, сусло, пиво): на денсито­граммах было обнаружено по 20—30 фракций. Отмече­ны также отчетливые различия между объектами ис­следования в качественном и количественном составе белков. Белки ячменя, солода и конгрессного (стан­дартного) сусла фокусировались в более кислой зоне, чем белки пива. Метод позволял отчетливо выявить из­менения белков сусла в процессе его кипячения и уста­новить различия в характере белков между разными образцами ячменя. В процессе солодоращения некото­рых образцов ячменя состав их белков может стано­виться более гетерогенным, число обнаруживаемых бел­ков увеличивается и количество белка повышается. По- видимому, здесь находит отражение процесс новообразования многих ферментных систем, происходящий при солодоращении.

Методы электрофореза и изоэлектрической фокуси­ровки позволяют разделить и идентифицировать раз­личные белки, но они ничего не говорят о молекуляр­ной массе разделяемых белков. Этот вопрос решается другими методами и в первую очередь гель-фильтра­цией. В этом направлении работал ряд исследовате­лей [81, ПО, 163—165]. Подробное исследование в этом направлении провели Нарцисс и Рёттгер [163—165]. В своей работе они использовали принцип мультико- лоночной гель-фильтрации с применением полиакрила­мидных гелей (Biogel). Преимущество применения био­гелей состоит в том, что они в отличие от сефадексов не адсорбируют полифенолы, ассоциированные с белка­ми. Ниже приводится распределение по молекулярной массе азотистых веществ конгрессного сусла (в пере­счете на 12 %-ное сусло) из двух различных солодов.

Пользуясь приведенными данными, фракционный состав азотистых веществ конгрессного сусла можно представить в следующем виде (в мг N/100 мл):

Следовательно, основную массу азотистых веществ конгрессного сусла составляют низкомолекулярные ве­щества (молекулярная масса менее 2600), т. е. амино­кислоты и низшие пептиды. Количество высокомолеку­лярных веществ (молекулярная масса более 30 000) равна 21,87 — 48,75 мг/100 мл (Nx6,25).

Конгрессное сусло, получаемое из различных Соло­дов, может весьма существенно различаться по фрак­ционному составу азотистых веществ: в сусле из второ­го солода в 2 раза больше азотистых веществ с моле­кулярной массой 4 600—12 000, в 4 раза больше бел­ков с молекулярной массой 30000—60000 и почти в 2 раза больше высокомолекулярных белков (>60 000).

Данные табл. 15 (взяты в сокращенном виде из ра­бот [163—165]) позволяют проследить за изменением фракций азотистых веществ в ходе технологического процесса (в мг/100 мл).

Таблица 15

Изменения фракционного состава азотистых веществ сусла в ходе технологического процесса

Фракционный состав азотистых веществ, приведен­ный в табл. 15, будет выглядеть следующим образом (табл. 16).

Таблица 16

Изменения в составе азотистых веществ с различной молекулярной массой от сусла до готового пива

Примечание. В числителе показано содержание азотистых веществ в мг N/100 мл 12%-ного сусла, в знаменателе — в % к общему азоту.

Таким образом, в ходе брожения и дображивания количество азотистых веществ с молекулярной массой ниже 2600 снижается на 28%, с молекулярной массой 2600—4600 изменяется мало, с молекулярной массой 12 000—30 000 и особенно 30 000—60 000 уменьшается существенно, причем последняя фракция изменяется главным образом в ходе дображивания (выдержки), В меньшей степени уменьшается фракция высокомоле­кулярных белков (>60 000). Авторы объясняют это происходящим при низкой температуре во время вы­держки укрупнением белковых молекул среднего раз­мера, что покрывает в какой-то мере уменьшение вы­сокомолекулярной фракции в результате выпадания составляющих ее белков в осадок.

Нарцисс и Рёттгер [164] считают, что для физико- химической стойкости пива основное значение имеет фракция азотистых веществ с молекулярной массой >60 000. Даже незначительное изменение этой фракции сильно влияет на стойкость пива. Содержание высоко­молекулярных веществ этой фракции в пиве, по данным этих авторов, очень мало, около 8 мг в 100 мл пива (1,3X6,25).

Наличие в пиве небольшого количества высокомоле­кулярных азотсодержащих веществ установлено всеми исследователями, занимающимися фракционированием пива, причем величина этих веществ указывается раз­личная. Так, если Нарцисс говорит о веществах с мо­лекулярной массой >60 000, то Вуф и Пирс (2551 на­ходят соединения с молекулярной массой 150000, а Тен Хупен [230]—с молекулярной массой 150 000— 2 000 000.

Наряду с водо- и солерастворимыми белками боль­шой интерес представляют гордеины (проламины) яч­меня, которые содержат много глютаминовой кислоты и пролина. Наличие большого количества пролина мо­жет обусловливать особенности структуры этого белка: уменьшение числа водородных связей, отсутствие спи­ралей. Несмотря на нерастворимость в солевых раство­рах, производные гордеина обнаруживаются в холодной мути, следовательно, они имеются в пиве. По-видимо- му, в процессе затирания, возможно, под влиянием вы­сокой температуры, протеолитических ферментов соло­да и еще каких-то факторов гордеин изменяет свою растворимость и частично переходит в сусло. Сандегрен нашел, что кипяченое сусло после диализа содержало только высокомолекулярный азотистый компонент, ко­торый был назван «альбуминовая фракция», хотя он и не состоял из исходного солодового альбумина. Этот компонент происходил из всех трех фракций солодовых белков, которые расщеплялись в менее высокомолеку­лярные вещества во время затирания и кипячения сусла.

С увеличением содержания белка в ячмене особенно увеличивается фракция гордеинов. Пиво, полученное из высокобелковистого ячменя, как правило, имеет пони­женную коллоидную стойкость, что может быть объяс­нено участием производных гордеинов в образовании, коллоидного помутнения [134].

При изучении высокомолекулярных азотистых сое­динений сусла и пива необходимо принимать во внима­ние происходящую при длительном кипячении сусла термическую денатурацию белков. Под денатурацией белка понимают любую модификацию вторичной, тре­тичной или четвертичной структуры белковых молекул, за исключением разрыва ковалентных связей (29, 41]. В нативном состоянии каждый белок имеет строго оп­ределенную, уникальную структуру, после денатурации этот же белок может иметь различные, неспецифиче­ские структуры, зависящие от типа и степени денатури­рующего воздействия.

Денатурация изменяет почти все свойства белков, иногда очень значительно. Изменяются размеры и фор­ма белковых молекул, электрофоретическая подвиж­ность, вязкость растворов, оптические свойства, харак­тер взаимодействия между молекулами (ассоциация, полимеризация, агрегация), растворимость и др. Обыч­но денатурированный белок имеет пониженную раство­римость. Изменение формы молекул белка при денату­рации приводит к тому, что многие функциональные группы становятся более доступными, например увели­чивается число доступных тиоловых групп. Заметно увеличивается при денатурации способность к образо­ванию комплексов между белками и различными орга­ническими соединениями, что объясняется демаскиро­ванием различных реактивных групп. В результате денатурации изменяется чувствительность белков к ферментам (атакуемость денатурированных белков, как правило, увеличивается), а также может изменяться иммунологическая специфичность белков.

Согласно Жоли [29], изменения, происходящие в бел­ках в процессе старения, можно также считать типич­ной денатурацией. При этом могут появляться компо­ненты с измененными молекулярной массой и электро­форетической подвижностью. При старении белков в них снижается количество SH-rpynn.

Из приведенного следует, что о свойствах белков сусла и пива нельзя судить по белкам ячменя или соло­да, так как термическая денатурация при 2-часовом кипячении сусла существенно изменяет их свойства. Для предотвращения коллоидного помутнения пива осо­бенно важно знание таких последствий денатурации, как изменение растворимости, агрегация молекул, уве­личение числа реактивных групп.

Грабар и Нумми [117] показали, что сыворотка с антителами к полипептидам пива очень слабо реагиру­ет с белками ячменя. Это объясняется тем, что азотсо­держащие вещества в кипяченом сусле и пиве, которые участвуют в этой реакции, являются не истинными белками, а продуктами распада исходных белков яч­меня.

Таким образом, несмотря на то, что по молекуляр­ной массе комплексные азотсодержащие вещества сус­ла и пива приближаются к истинным белкам, однако по ряду причин эти вещества не могут считаться на­стоящими белками и поэтому неправильно применять к ним термин «белки» [92]. Белки сусла и пива пред­ставляют собой денатурированные белки, которые пра­вильнее называть высокомолекулярными полипептида­ми. Хотя это название мало говорит о молекулярной массе веществ, оно все чаще используется в литера­туре по пивоварению вместо термина «белки».