Одним из новейших и перспективных методов разде­ления белков является метод электрофореза в твердых средах. Преимущество его состоит в том, что разделение белков по заряду комбинируется с молекулярноситовым эффектом геля. Указанный процесс можно рассматривать как результат трех факторов: заряда молекул, молекуляр­ной массы и формы молекул.

Полиакриламидный гель легко может быть получен в виде мелко-, средне- или крупнозернистого геля, т. е. вели­чина пор геля может быть различной.

Электрофорез в полиакриламидном геле проводят в ап­парате вертикального электрофореза, выпускаемом заводом «Реанал» Венгерской Народной Республики.

Аппарат (рис. 3) состоит из двух камер — верхнего и нижнего буферных резервуаров из оргстекла 1 и 3, в центре которых находятся графитовые электроды 4, подключае­мые в процессе работы к источнику постоянного тока. Резервуары соединяются стеклянными трубками 6 (12 шт.), которые крепятся в верхнем резервуаре с помощью нарезных зажимных колец, обеспечивающих герметич­ность. В трубки помещают предварительно приготовлен­ный гель 5 и наносят на его поверхность исследуемые об­разцы 7. Резервуары на­полняют электродным бу­ферным раствором 2.

При наложении напря­жения белки, содержа­щиеся в образце, переме­щаются через гель с раз­личной скоростью, в ре­зультате чего образуются зоны (диски) различных белковых фракций. По окончании электрофореза гелевые столбики вытал­кивают из трубок и погру­жают их в раствор кра­сителя для белков. После удаления избытка краски на бесцветном гелевом столбике отчетливо видны окрашен­ные белковые зоны.

Техника определения следующая. Трубки укрепляют в специальном штативе и в каждую из них вносят пипет­кой по 2 мл мономерного раствора. На поверхность раствора (во избежание проникновения воздуха и образования менис­ка) при помощи тонкого капилляра наслаивают 8-кратно разбавленный раствор А толщиной 5—6 мм.

Полимеризация завершается в течение получаса. Окон­чание ее можно определить по резкой границе, образовавшей­ся между поверхностью геля и слоем жидкости над ним.

С поверхности геля жидкость удаляют при помощи полоски фильтровальной бумаги и капилляром наносят на нее 0,2 мл раствора образца, смешанного в соотношении 1 : 1 с 40%-ным раствором сахарозы. Оставшееся в трубках пространство заполняют при помощи капилляра электрод­ным буфером, тщательно следя за тем, чтобы избежать смешивания его с раствором образца. Подготовленные таким образом трубки присоединяют к верхнему резервуару и каждый резервуар заполняют 1 л буферного рас­твора.

Аппарат подключают к стабилизированному источнику постоянного тока, учитывая необходимое расположение полюсов. При буферном растворе с pH 8,9, т. е. при pH выше изоэлектрической точки большинства белков, для созда­ния возможности движения белков через гель необходимо электрод нижнего резервуара подключить к аноду, а верх­него — к катоду.

Силу тока регулируют таким образом, чтобы она была равна 3—5мА на одну трубку, т. е. при 12 трубках не пре­вышала 60 мА. Продолжительность электрофореза состав­ляет 1—5 ч.

По окончании электрофореза трубки вынимают из ап­парата и с помощью тонкого шпателя извлекают гель. Гелевые столбики погружают в раствор краски на 5— 10 мин, после чего их сначала промывают водой, а затем промывным раствором, многократно меняя последний. Про­мывка ускоряется интенсивным перемешиванием.

Из отмытых от избытка краски гелевых столбиков выре­зают окрашенные полосы, соответствующие белковым фрак­циям, элюируют из них краску пятью миллилитрами 0,1 н. раствора гидроксида натрия и определяют оптическую плотность с помощью фотоэлектроколориметра или спектро­фотометра. Оптические плотности всех фракций суммируют. Полученную сумму ∑D принимают за 100% белка и вычис­ляют содержание в нем каждой отдельной фракции Ф_i, %, по уравнению

где D_i^ф— оптическая плотность элюата данной фракции.

Общее количество белка в пробе определяют аналогич­ным опытом с препаратом кристаллически чистого белка известной концентрации.

Можно также определить количество белка в каждой фракции методом Кьельдаля.

Реактивы.

1.  Раствор А: трис (гидроксиметил)-аминометан— 36,6 г; 1 н. раствор соляной кислоты — 48 мл; тетраметил­этилендиамин — 0,23 мл. Объем доводят до 100 мл дистил­лированной водой.
2.  Раствор В: N, N'-метилен-бис-акриламид —0,735 г; акриламид — 28 г. Объём доводят до 100 мл дистиллиро­ванной водой и раствор фильтруют.
3. Раствор С (свежеприготовленный): персульфат ам­мония — 0,140 г. Объем доводят до 100 мл дистиллирован­ной водой.

Примечание. Растворы А и В могут храниться в темных склянках в холодильнике несколько недель. Раствор С следует еже­дневно, готовить заново.

4. Мономерный раствор для мелкопористого геля (pH 8,9); 1 объем раствора А (3,5 мл); 2 объема раствора В;1 объем воды; 4 объема раствора С.
5. Электродный буферный раствор: трис (гидроксиметил)-аминометан —1,2 г; глицин — 5,76 г. Объем доводят до 2 л дистиллированной водой.
6. Раствор краски: краситель амидочерный 10Б—10 г. Объем доводят до 1 л 7%-ным раствором уксусной кислоты и фильтруют.
7. Промывная жидкость: ледяная уксусная кислота— 70 мл. Объем доводят до 1 л дистиллированной водой.
8. 40%-ный раствор сахарозы.
9. Раствор, содержащий чистые кристаллические бел­ки. Например, альбумин и инсулин (500 мкг/мл).