No module Published on Offcanvas position

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ а-АМИЛАЗЫ МУКИ ВИСКОЗИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

(Метод предложен Типплзом. Он модифицирован и аппробирован в условиях хлебопекарного производ­ства Н. П. Козьминой и Н. Н. Фихтенгольц).

Сущность метода состоит в определении изменения вяз­кости раствора крахмала под действием ферментной вы­тяжки из испытуемой муки. Величина, обратная времени достижения раствором крахмала половины первоначальной вязкости, приведенная к 100 г сухого вещества муки, при­нимается за активность α-амилазы в условных единицах.

Вязкость определяют на вискозиметре Оствальда ВПЖ-4 (ГОСТ 10028—67) с диаметром капилляра 0,5—1 мм. Подготовка к определению состоит из калибровки виско­зиметра, приготовления субстрата и ферментного экстракта из муки. Вискозиметр калибруют по водным растворам глицерина (20; 25; 30; 35; 40 и 45%-ной концентрации), вязкость которых соответственно равна 1,542; 1,810; 2,157; 2,600; 3,181 и 3,967 Па • с.

В качестве субстрата используют 1,5%-ный клейсте­ризованный раствор крахмала. Для экстрагирования фер­ментов из муки исйользуют водный раствор хлорида нат­рия и ацетата кальция.

Техника определения следующая. Для приготовления экстракта фермента берут навеску муки р, соответствую­щую 1 г при влажности W, равной 14% [р = 86/(100—W)], количественно переносят ее в колбу, содержащую немного чистого, промытого соляной кислотой, речного песка, и добавляют 50 мл раствора для экстрагирования фермента. Колбу помещают в водяную баню при температуре 45° С на 1 ч. Через каждые 15 мин содержимое колбы тщательно перемешивают. По истечении времени экстрагирования суспензию центрифугируют 0 мин при частоте вращения 8000-9000 мин-1.

Параллельно с приготовлением экстракта определяют вязкость крахмального субстрата: смешивают 4 мл раствора для экстрагирования с 6 мл раствора клейстеризован- ного крахмала и вносят 6 мл полученной смеси в вискози­метр. Предварительно вискозиметр закрепляют на штативе и помещают в водяную баню при 45° С. Через 30 мин оп­ределяют время истечения субстрата из вискозиметра. Для этого содержимое вискозиметра подтягивают выше верхней метки и отмечают время прохождения жидкости от верхней метки до нижней. Так проводят 5—10 замеров, а затем по калибровочной кривой вискозиметра определяют вязкость крахмального клейстера.

Для определения активности фермента смешивают 4 мл экстракта с 6 мл раствора крахмала и 6 мл полученной смеси по возможности быстро переносят в вискозиметр, находящийся в водяной бане при температуре 45° С. За­секают время начала действия фермента. Через небольшие промежутки времени (в зависимости от предполагаемой активности фермента) проводят замеры продолжительности истечения испытуемого раствора из вискозиметра, и по ка­либровочной кривой вискозиметра находят его вязкость. Измерения продолжают до достижения раствором половин­ной вязкости исходного раствора крахмала.

Если время достижения испытуемым раствором поло­винной вязкости окажется слишком мало, определение сле­дует повторить с разведенным экстрактом, а если оно будет больше 2 ч, экстракт фермента готовят из большего коли­чества муки. По полученным данным строят график в коор­динатах «Продолжительность действия фермента», с,— «Вязкость пробы», с. По экспериментальным точкам прово­дят прямую, по которой находят продолжительность фер­ментативной реакции до достижения половинной вязкости исходного раствора крахмала, после чего рассчитывают активность α-амилазы.

Если, например, исходная вязкость клейстеризованного раствора крахмала была 3,2 Па • с, то, следовательно, по­ловинная вязкость составит 1,6 Па • с. Замер после 60 с фер­ментации крахмала показал время истечения раствора, рав­ное 36,5 с, что по калибровочной кривой вискозиметра соот­ветствует вязкости 2,5 Па • с. После 120 с время истечения стало 33,5 с,т. е. вязкость раствора составила 1,9 Па • с, а через 180 с после начала ферментироваиия время истечения было 29 с, что соответствует вязкости 1,2 Па • с. Эта вели­чина ниже половинной вязкости исходного раствора. Построив по полученным данным вязкости прямую в систе­ме координат «Продолжительность действия фермента» — «Вязкость пробы» (рис. 8) находят, что время достижения половинной вязкости t равно 145 с.

Активность α-амилазы А, усл. ед., вычисляют по урав­нению

лтооооол.png

где υ1— количество раствора для экстрагирования фер­мента, мл; t- время достиже­ния половинной вязкости, с; υ2 — количество экстракта, взятое для осахаривания пробы, мл; р — навеска му­ки, г; W — влажность му­ки, %.

Подставив числовые ве­личины,

А = 1 • 50 • 100/(145•4•1• 0,86) = 10 усл. ед.

рис8.png

Реактивы.

  1. натрия и 0,2 г ацетата кальция в 1 л дистиллированной воды. .
  2. Буферный раствор pH 4,6 • 164 г безводного ацетата натрия и 120 мл ледяной уксусной кислоты на 1 л дистил­лированной воды.
  3. 1,5%-ный клейстеризованный раствор крахмала. 200мл дистиллированной воды доводят до кипения и медленно при перемешивании вносят 3,75 г крахмала. Кипение под­держивают в течение 4 мин. Закрыв стакан часовым стеклом, раствор охлаждают в водяной бане при температуре 25° С в течение 1 ч. Полученный клейстер количественно перено­сят в мерную колбу на 250 мл, добавляют 5 мл буферного раствора pH 4,6 и содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой. Раствор крахмала готовят еже­дневно.