Люминесцентный метод. Обычно количество мертвых клеток учитывают микроскопированием препа­ратов дрожжей, окрашенных метиленовой синью в бу­ферном растворе. Перспективными для практического применения являются методы люминесцентной микроско­пии, так как они гораздо чувствительнее обычных методов окраски.

М. Н. Мейселем предложен способ выявления дрожже­вых клеток с использованием флуоресцирующего краси­теля примулина. Последний, проникая в мертвые клетки и накапливаясь в них, вызывает ярко-желтую люминисценцию. Для определения используют микроскоп МЛ-2.

1 г прессованных дрожжей или 1 мл дрожжевого моло­ка размешивают в 100 мл дистиллированной воды. В про­бирку отбирают 15 мл полученной дрожжевой суспензии, добавляют 3 мл раствора примулина концентрацией 1 : 20 000 — 1 : 40 000 и окрашивают в течение 3—5 мин. Затем дают суспензии отстояться или центрифугируют. Надосадочную жидкость осторожно сливают, а осадок разводят стерильной водой.

Мертвые клетки подсчитывают под микроскопом при люминесцентном освещении. Они ярко окрашены в желтый цвет. Живые клетки видны лишь в виде теней.

После этого то же поле зрения просматривают в усло­виях фазового контраста, подсчитывая живые и мертвые клетки. Подсчет производят в 10 полях зрения. Коли­чество мертвых клеток Х,%, определяют по формуле

X = N_M • 100/(N_ж + N_м),

где N_M и N_ж — количество клеток соответственно мертвых и живых.

Флуориметрический метод. В Ленинградском от­делении ВНИИХП совместно с Ленинградским филиалом ВНИИ медицинского приборостроения разработан метод определения количества мертвых клеток на флуориметре марки ФБ-1. Этот метод позволяет устано­вить процентное содержа­ние клеток в данной пробе без подсчета их на столике микроскопа. Принцип ме­тода заключается в реги­страции свечения флуорохрома примулина, связан­ного с мертвыми клетками при предварительном удалении из суспензии свободного красителя. От количества мертвых клеток в пробе зависит интенсивность свечения взвеси, регистрируемой микроамперметром прибора.

Флуориметр ФБ-1 (рис. 14) снабжен ассиметрично расположенным и вынесенным из-под общего кожуха осветителем. Источником возбуждения служит лампа СВД-120А, фильтр УФС-6 выделяет область возбуждения длиной волны 365 нм, скрещенным является фильтр ЗМ-1.

Методика определения процентного содержания мертвых клеток в дрожжах и дрожжевом молоке такова. 1 г прес­сованных дрожжей или 1 мл дрожжевого молока размешивают в 100 мл водопроводной воды. В две пробирки вносят по 15 мл полученной суспензии. Одну пробирку помещают на 10 мин в кипящую водяную баню, чтобы убить все клет­ки. Затем в обе пробирки добавляют по 3 мл раствора примулина концентрацией 1 : 10 000 и окрашивают в течение 5 мин. Для удаления свободного красителя исследуемые суспензии центрифугируют 5 мин при 6 000 мин^-1. Надосадочную жидкость осторожно сливают, а осадок дрожжей как убитых нагреванием, так и не подвергавшихся кипяче­нию, разводят в 15 мл воды. Пробами заполняют кюветы, помещают их в кассету, которую вставляют в шахту на го­ризонтальной панели прибора, и флуориметрируют, ре­гистрируя показания микроамперметра прибора.

Количество мертвых клеток в пробе X, %, определяют по формуле

X=(I_ж:I_м) 100,

где I_м и I_ж— интенсивность свечения соответственно про­бы с убитыми клетками и непрокипяченной взвеси.

Измерения повторяют 5 раз. Продолжительность опре­деления одной пробы не превышает 1 ч.

Приведенный выше метод может быть применен также при оценке качества сушеных дрожжей. Полученные дан­ные хорошо согласуются с результатами подсчета при по­мощи люминесцентного микроскопа МЛ-2.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ДРОЖЖЕЙ

В КТИПП модифицирован метод Лейлян-Фоль- гарда применительно к анализу хлебопекарных дрожжей. Сущность его заключается в гидролизе казеина известным количеством ферментной вытяжки дрожжей и определении величины расщепления белка по уменьшению количества соляной кислоты, связываемой оставшимся непрогидро­лизованным казеином.

Оставшийся нерасщепленным казеин количественно оса­ждают сульфатом натрия. Выпадая в осадок, казеин увле­кает соответствующее количество соляной кислоты. Осадок отфильтровывают и 10 мл фильтрата титруют 0,1 н. раство­ром NaOH. Разность между количеством раствора 0,1 н. NaOH, израсходованного на титрование в опыте и контроле, принимают за меру протеолитической активности анализируемого объекта.

Ход определения следующий. К 6 г дрожжей добав­ляют 2 мл воды и растирают с кварцевым песком в тече­ние 5 мин в маленькой фарфоровой ступке, охлажденной на льду. Полученную массу переносят в центрифужную пробирку, смывая ее 4 мл воды.

После центрифугирования в течение 5 мин при частоте вращения 7000 мин^-1 10 мл надосадочной жидкости добав­ляют к 20 мл 5%-ного щелочного раствора казеина и тер- мостатируют в течение 1 ч в водяной бане с температурой 30° С. Затем гидролиз казеина прерывают добавлением 20 мл 0,1 н. раствора НС1 в 7,5%-ном Na₂S0₄ и немедленно фильтруют до полной прозрачности. 10 мл фильтрата титру­ют 0,1 н. раствором NaOH в присутствии двух капель 0,5%-ного спиртового раствора крезол-рота до красного окрашивания.

Параллельно ставят контрольный опыт, в котором 20 мл 0,1 н. раствора НС1 в 7,5%-ном Na₂S0₄ добавляют к 20 мл щелочного раствора казеина до внесения ферментного центрифугата дрожжей. По разности титрований в опыте и конт­роле вычисляют протеолитическую активность ферментов дрожжей.