В этом разделе будет вкратце рассмотрена классификация царства протистов, к которому относятся все живые существа с очень простой биологической организацией в сравнении с растениями и животными. К царству протистов принадлежат все одноклеточные, а также многоклеточные организмы, построенные из клеток только одного типа. Напротив, растения и животные отличаются большим разнообразием типов клеток. В конце настоящего раздела мы приведем примеры растительных и животных клеток, которые могут быть выращены на твердой или жидкой питательной среде.
В табл. 1.1 показано деление царства протистов на удобные для наших целей таксоны. Последние различаются рядом характеристик: источниками и способом получения энергии и питательных веществ, скоростями роста и выделения продуктов жизнедеятельности, способами самовоспроизведения, способностью к передвижению и средствами для его осуществления. Все эти факторы очень важны с точки зрения практического использования протистов. Не последнюю роль в классификации различных типов организмов играют морфологические различия, т. е. различия в их форме и структуре. Морфология микроорганизма влияет на скорость массопередачи питательных веществ и может также в существенной степени определять динамические свойства суспензий, содержащих этот организм. Все приведенные выше данные свидетельствуют о том, что каждый из перечисленных в табл. 1.1 таксонов микроорганизмов следует рассматривать отдельно.
Таблица 1.1. Классификация организмов царства протистов
Искусство биологической классификации называется таксономией. В этой классификации основной единицей является вид; организмы одного вида характеризуются высокой степенью близости морфологических и биохимических свойств и в то же время существенно отличаются по этим свойствам от организмов близких видов. Биологический вид обозначается двумя латинскими словами, первое из которых начинается с прописной буквы и обозначает род организма, а второе (часто носящее описательный характер) – собственно вид. Например, кишечная палочка – очень подробно изученная бактерия, обнаруженная в кишечнике человека, – называется Escherichia (наименование рода) coli (наименование вида). Латинское название выделяется курсивом; если из контекста ясно, о каком роде идет речь, то наименование рода обычно сокращается до первой буквы, например, Е. coli.
В целях систематизации видов и родов организмов разработана иерархическая система таксономии, в которой родственные роды объединены в семейства, близкие семейства образуют отряды, объединяющиеся в свою очередь в классы; далее классы сгруппированы в отделы, или типы, и, наконец, близкие отделы объединены в царства. Например, в табл. 1.1 указаны царство протистов, отдел грибов и класс дрожжей. Часто, однако, различия в свойствах микроорганизмов выражены не слишком отчетливо и подробная классификация становится в известной степени искусственной и произвольной; особенно это относится к бактериям и дрожжам.
1.3.1. Бактерии
Как мы уже упоминали в ходе предварительного изучения прокариот, бактерии представляют собой относительно небольшие организмы, обычно заключенные в жесткую оболочку. У многих видов бактерий наружная сторона клеточной стенки покрыта упругой, вязкой оболочкой, называемой капсулой или слизистым слоем. Бактерии представляют собой одноклеточные организмы; морфологически они могут быть разделены на три основные группы (рис. 1.6). Большинство бактерий не способно поглощать световую энергию, может самопроизвольно передвигаться и размножается путем деления на две дочерние клетки, хотя из всех этих правил известно множество исключений.
Существует большое число подотделов бактерий; некоторые основные типы бактерий и их характерные особенности перечислены в табл. 1.2. В столбце «реакция Грама» имеется в виду реакция бактерий на относительно прямой и быстрый цветной тест. В этом тесте клетки сначала окрашивают красителем кристаллическим фиолетовым, затем обрабатывают раствором иода и промывают спиртом. Клетки, сохраняющие после такой обработки голубой цвет красителя, называют грамположительными; потеря окраски свидетельствует о принадлежности бактерий к грамотрицательному типу. Многие характеристики бактерий хорошо коррелируют с этой цветной реакцией, отражающей существенные различия в структуре их оболочек.
При промышленном использовании микроорганизмов особенно важен вопрос, обязательна ли подача кислорода в питательную среду (гл. 8, 12 и 14). В аэробных процессах для питания микроорганизмов подают кислород, обычно в виде воздуха. К числу таких процессов относятся практически важные микробиологические способы производства уксуса, некоторых антибиотиков и добавок к кормам для животных. Одна из основных трудностей в разработке таких процессов связана с ограниченной растворимостью кислорода в типичных для этих систем водных средах (гл. 8). В анаэробных процессах, например, в производстве некоторых спиртов или при переработке органических отходов, микроорганизмы функционируют в отсутствие кислорода.
РИС. 1.6. Три формы бактерий.
В промышленном применении и в контроле бактериального заражения не менее важна способность бактерий образовывать в неблагоприятных условиях так называемые эндоспоры. Последние представляют собой «спящую» форму клетки, в которой они без вредных для себя последствий переносят воздействие повышенной температуры, радиации и ядохимикатов. Когда споры оказываются в пригодной для их жизнедеятельности среде, они превращаются в нормально функционирующие клетки. В отличие от споровой формы это нормальное, биологически активное состояние клеток часто называют вегетативной формой. Как свидетельствуют приведенные в табл. 1.2 данные, существуют две основные группы спорообразующих бактерий. Аэробные бактерии рода Bacillus чрезвычайно широко распространены в природе и легко адаптируются в любых условиях. Для нормально развивающихся в анаэробных условиях вегетативных форм некоторых видов Clostridium кислород летален, однако споры этих бактерий устойчивы к действию кислорода. Другие бактерии, вегетативные формы которых быстро погибают при 45 °С, образуют споры, выдерживающие кипячение в воде в течение нескольких часов. Отсюда следует, что если мы хотим убить микроорганизмы нагреванием (тепловой стерилизацией), то для уничтожения спорообразующих бактерий необходимы более высокие температуры – обычно кипячение под давлением в автоклаве при температурах выше 120 °С.
Таблица 1.2. Некоторые основные типы бактерий и их отличительные особенности
Мы не будем рассматривать здесь сине-зеленые водоросли (цианобактерии), не имеющие большого промышленного значения. Следует отметить, однако, что активно участвующие в кругообороте азота цианобактерии важны в общем кругообороте веществ в водных экосистемах (гл. 14).
1.3.2. Дрожжи
Дрожжи составляют один из важных классов отдела грибов. Грибы, как и бактерии, широко распространены в природе, хотя обычно они живут в почве в относительно менее влажных по сравнению с бактериями регионах. Грибы не способны усваивать энергию солнечного света и, как правило, существуют изолированно в виде отдельных одноклеточных организмов. Хотя для большинства грибов характерна довольно сложная морфо.11огия, дрожжи легко отличить по внешнему виду- обычно они представляют собой отдельные небольшие клетки длиной от 5 до 30 мкм и шириной от 1 до 5 мкм.
Дрожжи могут размножаться бесполым и половым путями; схема бесполого размножения (посредством почкования и деления) изображена на рис. 1.7. При почковании на родительской клетке сначала начинает расти небольшой отросток; отделение дочерней клетки от родительской происходит не сразу, благодаря чему становится возможным образование колоний дрожжевых клеток, состоящих из нескольких поколений. В результате деления из одной клетки образуются две новые. Половое размножение осуществляется путем слияния двух гаплоидных (имеющих одинарный набор хромосом) клеток, которое сопровождается разрушением пограничной стенки и образованием диплоидной (имеющие два набора хромосом) зиготы. Ядро в диплоидной клетке может претерпевать одно или несколько делений, в результате которых образуются аскоспоры; каждая из аскоспор в конце концов становится индивидуальной новой гаплоидной клеткой, которая может затем размножаться посредством почкования, деления или половым путем. Аскоспоры, представляющие собой в данном случае закономерный результат размножения этих организмов, не следует путать с рассмотренными выше эндоспорами, образующимися в качестве защитной реакции на враждебную среду.
РИС. 1.7. На приведенных в нижней части рисунка фотографиях изображен процесс бесполого размножения клетки дрожжей путем почкования. (Числа обозначают время процесса в минутах.) Как схематически показано в верхней части рисунка, в жизненном цикле дрожжей определенную роль играет и половое размножение.
В производстве спиртных напитков дрожжи представляют собой единственный промышленно используемый тип микроорганизмов. Помимо производства пива и вина анаэробные дрожжи применяются для получения в промышленных масштабах технического спирта и глицерина. Дрожжи используются также при выпечке хлеба и в качестве белковых добавок к кормам для животных (см. гл. 12).
1.3.3. Плесени
Плесени – это высшие грибы, обладающие вегетативной структурой, называемой мицелием. Как показано на рис. 1.8, мицелий представляет собой сильно разветвленную систему трубок. Внутри этих трубок находится подвижная цитоплазма, содержащая множество ядер. Мицелий может состоять из нескольких типов родственных клеток. Длинные, тонкие нити клеток мицелия называют гифами. В некоторых случаях мицелий может быть очень плотным. Учитывая необходимость подачи кислорода для нормальной жизнедеятельности плесеней, это обстоятельство может вызвать большие затруднения в их культивировании, поскольку мицелий может оказывать существенное сопротивление массопередаче. Эта проблема, как и необычные гидродинамические свойства суспензий мицелия, будут подробнее рассмотрены в гл. 4 и 8.
РИС. 1.8. Структура мицелия плесеней. Условия в центре плотного мицелия
и в его периферийных участках могут существенно различаться.
Как и другие, плесени не содержат хлорофилла и обычно не способны передвигаться. Как правило, плесени размножаются спорами половым или бесполым путем. Свойства спор играют большую роль в классификации грибов.
С промышленной точки зрения наиболее важны плесени Aspergillus и Penicillium (рис. 1.9). К числу основных продуктов метаболизма этих микроорганизмов относятся антибиотики (продукты жизнедеятельности, убивающие некоторые микроорганизмы или подавляющие их рост), органические кислоты и биологические катализаторы.
РИС. 1.9. Гифы Aspergillus и Penicillium двух промышленно важных плесеней.
Один из штаммов Aspergillus niger в нормальных условиях продуцирует щавелевую кислоту (НО2ССО2Н), но если питательная среда обеднена фосфатами и ионами некоторых металлов, например, меди, железа и магния, то преимущественно образуется лимонная кислота НООССН2С (ОН) (СООН) СН2СООН. Эта особенность лежит в основе промышленного биохимическоrо способа производства лимонной кислоты. Таким образом, плесень А. niger может служить интересным примером различия в подходах к разработке и оптимизации биохимических и небиологических процессов. В биологических системах путем сравнительно небольшого изменения состава питательной среды иногда может быть достигнута значительно большая селективность.
Этот пример, как и приведенный ниже пример пенициллина, показывает, насколько для специалиста в области биохимической технологии важно знать строение клеток, их метаболизм и функции; другие многочисленные подтверждения этого положения мы найдем в последующем изложении. Без учета основных свойств клеток и происходящих в них процессов все умение инженера-технолога, проявляемое при разработке, проектировании и анализе различных промышленных биохимических процессов, может оказаться совершенно бесполезным, поскольку при этом не будут приниматься во внимание ключевые биологические свойства изучаемой системы.
Второе фундаментальное различие между микробиологическими и небиологическими процессами можно проиллюстрировать на примере производства пенициллина. Основные успехи в производстве пенициллина были достигнуты благодаря получению высокопродуктивных мутантов исходного штамма Penicillium путем ультрафиолетового облучения его спор (рис. 1.10). Мутации могут вызываться различными агентами и часто приводят к увеличению выхода нужного продукта метаболизма на несколько порядков. Рассматриваемая в гл. 6 технология рекомбинантных ДНК позволяет получать генетически видоизмененные варианты некоторых организмов иным, целенаправленным и строго контролируемым путем. Таким образом стало возможным, в частности, наладить производство некоторых продуктов жизнедеятельности животных организмов (белков) с помощью простых бактерий. Эти примеры говорят о той большой роли, которую играет в биохимической технологии генетика. В настоящее время генетике уделяется большое внимание как в высших учебных заведениях и научных учреждениях, так и в промышленных исследовательских центрах биологического направления. Практическая важность разработки генетически модифицированных организмов (или, в других случаях, сохранения исходной генетической природы организма) свидетельствует о необходимости тесного сотрудничества инженеров, биологов и биохимиков в ходе планирования и критической оценки промышленных биохимических процессов. История развития производства пенициллина является примером разработки новых методов, включая культивирование в чрезвычайно толстом слое, экстракцию больших количеств лабильных соединений растворителями, стерилизацию больших объемов воздуха при высоких скоростях потока и выделение мутантных микроорганизмов, продуцирующих большие количества пенициллина.
РИС. 1.10. Повышение выхода пенициллина за 30-летний период исследований, Разработка методов получения
особых мутантных штаммов плесени привела к экспоненциальному росту выхода за прошедшие 25 лет.
Аналогичная тенденция характерна и для производства антибиотика стрептомицина.
Прежде чем закончить этот раздел, посвященный бактериям н грибам, следует кратко упомянуть об актиномицетах- группе микроорганизмов, которые обладают свойствами как грибов, так и бактерий. Эти микроорганизмы широко применяются в производстве очень важных антибиотиков. Хотя формально актиномицеты относят к бактериям, по способности образовывать длинные, чрезвычайно разветвленные гифы они напоминают грибы. Процессы производства антибиотиков с использованием актиномицетов и плесеней также имеют много общего. Актиномицеты сближает с бактериями их восприимчивость к заражению одними и теми же вирусами и к вирусным заболеваниям. Вирусы мы вкратце рассмотрим ниже, в гл. 6.
1.3.4. Водоросли и простейшие
Эти относительно большие эукариоты обладают сложным и высокоупорядоченным строением. Эвгленовые водоросли, например, передвигаются с помощью жгутиков, у них нет жесткой оболочки, но имеется чувствительное к свету пятно, называемое глазком. Последнее реагирует на свет и заставляет клетки двигаться к более освещенному месту, что немаловажно для жизнедеятельности этой водоросли, усваивающей, как и большинство других водорослей, световую энергию. Многие диатомовые (другой вид водорослей) имеют наружные двустворчатые оболочки (панцири) разнообразной формы, состоящие в основном из кремнезема. Эти панцири широко используются в промышленности в качестве фильтрующего материала.
Повышенный интерес к водорослям обусловлен их потенциальной ценностью в качестве продукта питания или как добавки к пищевым продуктам. В Японии, например, в настоящее время работает несколько промышленных установок, на которых водоросли культивируют именно для этих целей. Кроме того, в Азии в довольно широких масштабах в пищу употребляют морские водоросли. Последние не являются микроорганизмами и построены из множества однотипных клеток. Как и более простые сине-зеленые водоросли, водоросли-эукариоты выполняют важную функцию в круговороте веществ на земле (гл. 14).
В известном смысле водоросли можно рассматривать как примитивные растения; точно так же простейших, не способных усваивать солнечную энергию, можно считать примитивными животными. Естественная среда обитания, морфология и активность простейших изменяются в довольно широких пределах. Некоторые трипаносомы, например, являются переносчиками серьезных заболеваний, включая африканскую сонную болезнь, или трипаносомиаз. С другой стороны, простейшие Trichonympha населяют кишечник термитов и помогают им переваривать древесину. Амебы не обладают какой-либо определенной формой и постоянно меняют свои внешние очертания, в то время как для солнечников (Heliozoa) характерно наличие внутреннего скелета и определенной формы.
Хотя простейшие в настоящее время не используются в промышленном масштабе ни для производства клеточной массы, ни для синтеза продуктов их жизнедеятельности, они наряду с микроорганизмами играют большую роль в биологической очистке сточных вод (гл. 14). С точки зрения микробиолога эти процессы, широко применяющиеся во всем мире в городах и на больших промышленных предприятиях, поразительно сложны. Бытовые и промышленные сточные воды представляют собой сложную смесь, в состав которой входят различные питательные вещества и самые разнообразные микроорганизмы; поэтому для обработки стоков необходимо также большое число различных про-листов. Эти организмы конкурируют в потреблении питательных веществ, уничтожают друг друга и взаимодействуют многими другими путями, характерными для небольшой экологической системы. Подробнее вопросы взаимодействия между различными видами будут рассмотрены и проанализированы в гл. 13.
1.3.5. Растительные и животные клетки
Многие вакцины и другие биохимикаты продуцируются в ходе роста животных клеток в реакторах, т. е. при выращивании клеток вне организма животного. Совершенствование методов культивирования тканевых клеток и разрабатываемые в последние годы методы генетической трансформации животных и растительных клеток открывают новые многообещающие пути для их значительно более широкого промышленного использования. Тканевые клетки можно выращивать почти в таких же реакторах, какие используются для культивирования микроорганизмов; по этой причине кинетика роста как тканевых, так и микробных клеток и применяющиеся для этой цели биохимические реакторы будут рассмотрены в одних главах (гл. 7 и 9 соответственно). Ниже мы вкратце обсудим важнейшие типы клеток высших организмов, культуры которых могут быть выращены в технологической аппаратуре независимо от организма животного или растения, от которого эти клетки были отобраны.
Если часть ткани животного (обычно полученную путем разрушения межклеточных связей) поместить в соответствующую питательную среду, то большинство типов клеток, в частности клетки крови, погибнут в течение нескольких дней, недель или месяцев. Другие клетки в этих условиях размножаются и дают так называемую первичную линию клеток. Часто эти клетки удается пассировать, т. е. перенести в свежую питательную среду, где снова происходит размножение клеток, приводящее ко вторичной линии клеток. Некоторые вторичные клетки, выдерживающие, по всей вероятности, неограниченное число пассажей, называют стабильной, перманентной или установившейся линией клеток.
Многие линии клеток получены из эпителиальных тканей (кожного покрова и тканей, окружающих органы и ограничивающих полости организма), соединительных тканей, крови и лимфы ряда животных, в том числе человека, хомяка, обезьяны и мыши. На рис. 1.11 приведена электронная микрофотография клетки LA-9, выделенной из фибробластов мыши и растущей на твердом носителе. Примеры линий клеток, их источники и обозначения приведены в табл. 1.3. Как отмечено в таблице, источником некоторых линий клеток являются злокачественные опухоли (карциномы) различных тканей. Злокачественный рост клеток крови и лимфы обычно называют лейкемией.
РИС. 1.11. Полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа микрофотография
культуры клеток LA-9, выращенных на твердом носителе. Обычно эти клетки
из фибробластов мыши имеют ширину около 15 мкм и длину 75-90 мкм.
Культуры некоторых тканевых клеток можно выращивать в виде суспензии в жидкой среде, но для роста большинства линий клеток необходимо их закрепление на твердой поверхности, что налагает серьезные ограничения на масштабы промышленного производства вакцин и других биологических продуктов на основе культур животных клеток. Метод культивирования на микроносителях, который мы подробнее рассмотрим в гл. 9, позволил значительно повысить производительность реакторов (в расчете на единицу объема), предназначенных для выращивания культур клеток, растущих только на носителях. Культуры некоторых клеток растительного происхождения можно выращивать также в виде каллюса (нароста недифференцированной ткани растения на твердой питательной среде) или в виде суспензии агрегированных клеток. Поскольку растения продуцируют множество практически важных соединений, в том числе душистые вещества, красители, лекарственные средства и опиаты, использование культур растительных клеток в будущем может оказаться весьма перспективным. Культуры растительных клеток могут также служить весьма специфичными катализаторами ряда ценных реакций. Культуры растительных клеток могут оказаться полезными и в сельском хозяйстве, например, для регенерации целого растения. В то же время будущему широкомасштабному применению культур растительных клеток должно предшествовать более тщательное изучение общей биологии растений, а также особенностей и ограничений процессов культивирования растительных клеток. Следует отметить, что можно культивировать также тканевые клетки насекомых и других беспозвоночных, однако в последующих главах при обсуждении культур тканевых эукариот мы ограничимся клетками животного и растительного происхождения.
Таблица 1.3. Примеры стандартных линий клеток животных и их происхождение
