Дрожжи виноградных ягод
По данным многих исследователей, дрожжевая флора ягод винограда, собранных стерильно, очень бедна. На ягодах чаще и в большем количестве обнаруживаются неспороносные бактерии и плесневые грибы, чем дрожжи. Так, М. Мавлани, определявшая микрофлору ягод винограда в Узбекистане, и В. П. Журавлева – в Туркмении показали, что наибольшую часть микрофлоры ягод составляют бактерии, не образующие спор [61, 103]. Большинство штаммов бактерий принадлежало к родам Pseudomonas, Micrococcus и Chromobacterium. По данным японских исследователей, на ягодах винограда, особенно в период созревания, преобладают плесневые грибы родов Penicillium и Aspergillus [186].
Ж. Риберо-Гайон и Э. Пейно приводят данные подсчета количества дрожжей (методом посева на плотную среду) в соках, полученных из винограда, взятого стерильно с куста, в соках из винограда, собранного сборщиками и доставленного для переработки, и в соках, собранных при выходе из дробилкигребне-отделителя (табл. 22) [154].
Таблица 22
Дрожжи на ягодах винограда распределены очень неравномерно. Если срезать несколько здоровых гроздей и размельчить их с соблюдением асептики, то может иногда даже не возникнуть брожение из-за отсутствия дрожжей. Значительно возрастает их количество на ягодах поврежденных и особенно после дробления винограда, так как на оборудовании для переработки винограда сок находится в аэробных условиях, благоприятных для быстрого размножения дрожжей.
Почти все авторы, определявшие количество дрожжей, находящихся на винограде в момент наступления полной зрелости, отмечали малое число дрожжей-сахаромицетов и преобладание апикулятусов.
Т. Кастелли показал, что в южных районах Италии больше на винограде распространены апикулятусы, образующие споры– Hanseniaspora apiculata, а в северных – Kloeckera apiculata, не образующие спор. Эта разница в распределении на винограде дрожжей-сахаромицетов зависит от климатических условий. Чем жарче климат, тем больше распространены спорогенные формы, как наиболее стойкие по отношению к колебаниям температуры и влажности воздуха.
Японские ученые Ю. Симатани и П. Нагата [186] выделяли с ягод винограда в период их созревания дрожжи Kloeckera apiculata, Candida mycoderma, Candida crucei, Pichia membranaefaciens, Pichia fermentans, Torulopsis famata. Дрожжи-сахаромицеты не были выделены.
На виноградниках Грузии, по данным Г. В. Арабидзе, основную часть дрожжевой флоры спелых ягод составляют Hanseniaspora apiculata – 50% и Torulopsis – до 18%. Дрожжи вида Sacch. vini не были обнаружены.
С поверхности ягод винограда, выросшего в районе Бордо, за несколько дней до сбора выделялось 100 000 клеток на 1 г винограда. Преобладали дрожжи Rhodotorula и Kloeckera apiculata.
Таким образом, исследования дрожжевой флоры виноградных ягод, проведенные в разных странах, показывают, что количество дрожжей на ягодах к моменту сбора для переработки может быть самым различным (от единичных клеток до 105 на 1 г винограда).
Дрожжей-сахаромицетов обнаружить на ягодах обычно не удается, так как преобладают дрожжи других семейств и родов.
Дрожжи винодельческих заводов
Условия производства вин далеки от стерильных. На оборудовании, в стеклянных трубопроводах, в емкостях для сбраживания сусла и хранения вина всегда есть живые микроорганизмы, которые при переработке винограда попадают в сусло и вино.
Нами определялось на трех винодельческих заводах Крыма количество живых микроорганизмов (дрожжей, плесневых грибов, уксуснокислых и молочнокислых бактерий) на внутренней поверхности эмалированных стальных сборников и стеклянных трубопроводов, а также разливочных автоматов путем посева проб последней порции промывной воды на элективные питательные среды и подсчета выросших колоний. Результаты анализов показали, что даже после дезинфекции 0,5%-ным раствором катапина (четвертичного аммониевого соединения) часть дрожжей оставалась живой (табл. 23).
Таблица 23
При определении обсемененности микроорганизмами вымытых и стоящих пустыми железобетонных емкостей, не облицованных изнутри стеклянной плиткой, а покрытых слоем винного камня, обнаружено, что основной микрофлорой в них были плесневые грибы родов Peniciliium и Aspergillus и дрожжи, причем преобладали пленчатые дрожжи родов Pichia и Candida. При посевах на питательные среды смывов с поверхностей емкостей установлено, что в 85% проб содержались живые плесневые грибы и в 81% проб — живые дрожжи. Уксуснокислые и молочнокислые бактерии были обнаружены соответственно в 44 и 33% проб (табл. 24).
Таблица 24
По данным В. П. Журавлевой [61], в микрофлоре оборудования и тары винодельческих заводов преобладают дрожжи-сахаромицеты, реже встречаются пленчатые дрожжи родов Pichia, Hansenula, Candida, а также плесневые грибы и бактерии.
Ж. Риберо-Гайон и Э. Пейно [154] приводят результаты идентификации 132 штаммов дрожжей, выделенных в винподвалах с оборудования, тары, инвентаря, и показывают, что они распределяются следующим образом (табл. 25).
Таблица 25
Из данных, приведенных в табл. 24 и 25, видно, что оборудование и емкости винодельческих заводов являются источниками дрожжей, плесневых грибов, уксуснокислых и молочнокислых бактерий, попадающих в виноградное сусло и вино. Количество микроорганизмов зависит от санитарного состояния оборудования и емкостей. На винодельческих заводах необходимо строго следить за тем, чтобы сразу после освобождения от сусла или вина емкости и оборудование тщательно промывались водой и их поверхности не служили питательным субстратом для размножения различных групп микроорганизмов.
Нами была определена обсемененность микроорганизмами виноматериалов, хранящихся в железобетонных емкостях. Было проанализировано 85 проб столовых виноматериалов. В 68% проб в 1 мл вина содержалось от 10 до 1000 ив 11% проб – от 10 000 до 1 млн. живых клеток дрожжей. Микрофлора столовых виноматериалов, хранящихся в железобетонных емкостях, характеризуется данными, приведенными в табл. 26.
Таблица 26
В винах, поступающих на розлив в бутылки, тоже содержатся микроорганизмы. При розливе вина в бутылки на обычных нестерильных линиях нами обнаружено от 10 до 500 живых дрожжевых клеток в 1 мл вина. Аналогичные данные получены Э. Пейно и С. Сапи-Домерк о содержании живых микроорганизмов в винах, разливаемых в бутылки в районе Бордо.
Дрожжи являются основной причиной биологических помутнений столовых вин, разлитых в бутылки [172, 246]. Определение систематического положения дрожжей, выделенных из помутневших столовых вин, позволило обнаружить в них дрожжи родов Saccharomyces, Brettanomyces, Pichia, Hansenula, Candida. Среди сахаромицетов наиболее часто выделяются из помутневших вин дрожжи вида Sacch. oviformis как наиболее спиртовыносливые и приспособленные к жизнедеятельности в винах.
Достаточно бывает присутствия нескольких живых дрожжевых клеток в 1 мл вина, разливаемого в бутылки с доступом воздуха, чтобы в нем спустя некоторое время возникло дрожжевое помутнение. Применяемые дозы сернистой кислоты для стерилизации готовых к розливу столовых сухих и полусладких вин, разрешенные в нашей стране ГОСТ 7208–70 «Вина виноградные», не обеспечивают их биологической стабильности. Поэтому для ее достижения необходимо применять дополнительную обработку (горячий розлив, бутылочную пастеризацию, стерилизующую фильтрацию и стерильный розлив или введение дополнительных консервантов).
Дрожжевая флора спонтанно бродящего виноградного сусла и вина
Виноградное сусло в отличие от пивного, стерилизованного и сбраживаемого на селекционированных дрожжах, часто забраживает самопроизвольно (спонтанно) на естественной микрофлоре. Результаты брожения бывают различными, что является одной из причин подробного изучения состава дрожжевой флоры виноградного сока на различных этапах брожения во многих винодельческих районах.
Исследования микрофлоры виноградного сусла показали, что в свежеотжатом сусле могут быть представители разных групп микроорганизмов, попавшие в сусло при переработке винограда с поверхности ягод, гребней и оборудования. Большую часть микрофлоры составляют плесневые грибы (76–90%), дрожжи (9–22%) и значительно меньшую – неспоровые и споровые бактерии, актиномицеты и микобактерии [61].
Высокая кислотность виноградного сока (pH 2,7–3,8) создает неблагоприятные условия для жизнедеятельности большинства групп микроорганизмов, и поэтому в сусле они обычно не размножаются.
Наиболее кислотовыносливыми являются дрожжи и плесневые грибы. Дрожжей в свежеотжатом соке обычно бывает меньше, чем плесневых грибов, но дрожжи способны быстрее размножаться во всей массе жидкости. Накопив определенную биомассу, дрожжи перестраивают свой обмен на анаэробное использование сахаров и вызывают забраживание сусла. Спиртовое брожение обедняет сусло кислородом и приводит к накоплению в среде спирта. Анаэробные условия и спирт неблагоприятны для размножения и жизнедеятельности плесневых грибов, поэтому создаются элективные условия для жизнедеятельности дрожжей.
Среди дрожжей различных семейств, родов и видов существуют сложные конкурентные взаимоотношения и в связи с этим наблюдается изменение состава дрожжевой флоры в процесс спонтанного брожения виноградного сусла. В анаэробных уело виях прекращается размножение пленчатых дрожжей. Слабобродящие дрожжи постепенно уступают место дрожжам с более высокой спиртообразующей способностью, С повышением концентрации спирта значительное количество конкурентов гибнет и к концу брожения остаются жизнедеятельными только спиртовыносливые виды дрожжей. Однако продукты обмена всех дрожжей, участвовавших в брожении сусла, оказывают влияние на качество вина.
До недавнего времени считалось, что в процессе спонтанного спиртового брожения виноградного сусла принимают участие всего лишь 2–3 вида дрожжей.
В начале брожения преобладают апикулятусы, составляющие 90–95% всей микрофлоры. После накопления в бродящем сусле 2–4% об. спирта состав дрожжевой флоры меняется. Винные дрожжи Sacch. ellipsoideus продолжают размножаться, а апикулятусы прекращают свою жизнедеятельность и постепенно отмирают. Основное брожение и дображивание проходит на дрожжах Sacch. ellipsoideus.
Классическая схема спонтанного брожения сусла, согласно которой апикулятусы начинают брожение, а эллиптические дрожжи его завершают, дополняется в последнее время новыми сведениями благодаря усовершенствованиям классификации дрожжей и подробному изучению дрожжевой флоры во многих винодельческих районах различных стран.
Особенно подробно проведено изучение эколого-географического распространения дрожжевых организмов, продуктов их обмена и роли отдельных видов дрожжей в брожении сусла в таких винодельческих странах, как Италия и Франция.
В Италии под руководством Т. Кастелли изучена дрожжевая флора виноградников южных и северных районов страны, расположенных у моря и на высоте 700 м. Обследовано более 600 виноградарских местностей Италии, Сардинии и Сицилия. Было исследовано 500 проб различных соков и выделено около 6000 штаммов дрожжей (329).
На рис. 29 показано, что в пробах бродящего сусла из винограда различных местностей Италии наряду с Kloeckera apiculata и Sacch. ellipsoideus находятся дрожжи других родов и видов в разных количественных соощошениях.
Рис. 29. Дрожжи, преобладающие в некоторых образцах бродящего сусла [329]:
I – в зоне Умбрия; II – Кьянти; III – Апулия; IV – Пичено; V – Пьемонт;
1 – Sacch. ellipsoideus; 2 – Sacch. bayanus; 3 – Kl. magna; 4 – Sacch. rosei; 5 – Sacch. Chevalierl; 6 – Cand. pulcherrima;
7 – Sacch. uvarum; 8 – Kl. apiculata; 9 – другие виды.
Многие виды дрожжей, такие как Sacch. rosei, Sacch. bayanus, Sacch. uvarum, Candida pulcherrima, Kloeckera magna, встречаются настолько часто, что нельзя отрицать их участие в процессе спонтанного брожения.
Сравнение результатов изучения дрожжевой флоры северных и южных районов Италии показало, что чем жарче климат, тем более распространены спорогенные формы, более устойчивые к колебаниям температуры и влажности воздуха. Климат оказывает влияние на качественный состав микрофлоры, на распространение определенных видов дрожжей. Кроме того, в южных районах происходит селекция дрожжей разных видов с более высокой спиртообразующей способностью, чем в северных, в связи с более высоким содержанием сахара в сусле. Труды итальянских исследователей расширили наши представления о составе дрожжевой флоры спонтанно бродящего виноградного сусла и внесли существенный вклад в изучение этого вопроса.
Во Франции С. Домерк было проведено подробное исследование дрожжей в департаменте Жиронда [246]. Изучался состав дрожжевой флоры винограда и сусла в начале, середине и в конце брожения в районах производства красных и белых вин. Всего было выделено 2023 штамма дрожжей из 96 проб. Из них 58 проб были взяты в районах производства красных вин и 38 – в районах производства белых вин. Дрожжи при определении систематического положения были отнесены к 11 родам и 28 видам. Из них дрожжи аспорогенные принадлежали к пяти родам, включающим восемь видов (Kloeckera apiculata, Kl. africana, Kl. jensenii, Torulopsis bacillaris, T. famata, Brettanomyces vini, Candida pulcherrima, Rhodotorula mucilaginosa), и спорогенные – к шести родам, включающим 20 видов (Saccharomyces ellipsoideus, Sacch. oviformis, Sacch. chevalieri, Sacch. bayanus, Sacch. fructum, Sacch. carlsbergensis, Sacch. uvarum, Sacch. florentinus, Sacch. steineri, Sacch. heterogenicus, Sacch. acidifaciens, Sacch. elegans, Sacch. veronae, Saccharomycodes ludwigii, Torulaspora rosei, T. delbriieckii, Hansenula anomala, Pichia fermentans, P. membranaefaciens, Debaryomyces hansenii).
Наблюдалось большое разнообразие дрожжей в спонтанно сброженных соках. До начала брожения виноградного сусла районов производства красных вин апикулятусы и другие неспорообразующие дрожжи в изолированных штаммах дрожжей составляли 84%, а в конце брожения они не были обнаружены. Дрожжей вида Sacch. ellipsoideus до брожения было 13%, в середине, когда было сброжено 50% сахаров от исходного содержания,– 62% и в конце, через 3 мес от начала процесса брожения – 74%, Sacch. oviformis к концу брожения было 6%; спорообразующие дрожжи других видов и родов были обнаружены в небольшом количестве – от 1 до 7%.
В районах производства белых вин в сусле до брожения наряду с дрожжами Kloeckera apiculata, которые составляли только 36%, находились дрожжи Torulopsis bacillaris –23% и Sacch. ellipsoideus – 31%. По ходу брожения сусла микрофлора менялась. Неспорообразующие дрожжи Kloeckera apiculata и Torulopsis bacillaris уступали место спорообразующим дрожжам рода Saccharomyces. Через 3 мес после начала забраживания сусла дрожжи вида Sacch. ellipsoideus составляли 50% и вида Sacch. oviformis – 38%. Сахаромицеты других видов были обнаружены в незначительном количестве. Более высокое содержание дрожжей вида Sacch. oviformis в конце брожения при производстве белых вин, чем при производстве красных, наблюдавшееся С. Домерк в винах Франции, незакономерно. Э. Минарик [283], определявший состав дрожжевой флоры молодых вин Чехословакии, не обнаружил существенных видовых различий сахаромицетов в белых и красных винах.
С. Домерк была изучена также спиртообразующая способность 1782 штаммов дрожжей разных родов и видов, выделенных в районах производства белых и красных вин. При сбраживании высокосахаристого сусла 353 изученных штамма апикулятусов образовали спирта только от 3 до 6% об., 1015 штаммов Sacch. ellipsoideus – от 8 до 20% об., причем большинство штаммов (60%) – от 12 до 15% об. Наибольшая спиртообразующая способность обнаружена у дрожжей вида Sacch. oviformis: из 92 изученных штаммов 50, т. е. более половины, образовали спирта от 17 до 19% об.
Изучение видового состава дрожжевой флоры при спонтанном брожении сусла в условиях виноделия западных районов Грузии показало, что в начале брожения преобладали апикулятусы, а в середине брожения – сахаромицеты видов Sacch. vini и Sacch. uvarum. Дрожжевая флора осадков вин состояла из сахаромицетов, среди которых около 83% принадлежало к Sacch. vini, количество Sacch. oviformis достигало 10% [15].
Н. М. Трофименко, изучавшая дрожжевую флору Молдавии, установила, что род Saccharomyces представлен там в основном видами Sacch. uvarum и Sacch. vini. Некоторые штаммы вида Sacch. uvarum дают вино хорошего качества и вызываемое ими брожение сусла протекает без пенообразования [195].
Определение систематического положения 331 штамма дрожжей, выделенных нами из дрожжевых осадков после спонтанного сбраживания виноградного сусла в пяти винсовхозах Закарпатской области Украинской ССР, показало, что 97% их принадлежало к четырем родам семейства Saccharomycetaceae: Saccharomyces – 90,7%, Pichia – 4,5%, Zygosaccharomyces – 0,9%, Debaryomyces – 0,9%; 3% культур составили дрожжи сейейства Saccharomycodaceae рода Saccharomycodes. Род Saccharomyces был представлен в сброженном виноградном сусле Закарпатья следующими видами: Sacch. vini – 88,0%, Sacch. oviformis – 8,3%, Sacch. paradoxus – 3,3% и Sacch. chevalieri – 0,3% [203J.
Изучение состава дрожжевой флоры винограда, бродящего сусла и вина проводилось в винодельческих районах Калифорнии, Чехословакии, Болгарии, Испании, Японии, Новой Зеландии и многих других стран.
Данные исследований дрожжевой флоры в винодельческих районах различных стран показали, что из самопроизвольно сбраживаемого виноградного сусла можно выделить дрожжи, принадлежащие к различным семействам, родам и видам (2023 штамма дрожжей, выделенных в Жиронде, отнесены к 11 родам и 28 видам; 1014 культур района Малых Карпат в Чехословакии отнесены к 7 родам и 25 видам). Дрожжевая флора сусел одного и того же района неодинакова [283].
Дрожжи разных семейств, родов и видов обладают разными свойствами: скоростью размножения, бродильной активностью, спиртообразующей способностью, холодо-, термо-, спирто-, сульфитовыносливостью, образуют разные вторичные и побочные продукты брожения, оказывающие влияние на вкусовые качества получаемых вин. Поэтому при сбраживании сусла на спонтанной микрофлоре неизбежны случайности, и наряду с возможностью получения вин полностью выброженных и высокого качества есть всегда опасность получения недобродов, виноматериалов с меньшим содержанием спирта при полном сбраживании сахара и вин низкого качества.
Дрожжевая флора плодово-ягодных сусел и вин идентична микрофлоре виноградных сусел и вин: в начале самопроизвольного брожения преобладают апикулятусы, а затем дрожжи-сахаромицеты. Главное различие состоит в том, что в плодово-ягодных соках, особенно в яблочных, часто размножаются дрожжи вида Schizosaccharomyces acidodevoratus, которые разлагают яблочную кислоту и вызывают нежелательный для плодово-ягодного виноделия процесс кислотопонижения.