Белки — высокомолекулярные азотсодержащие органические соединения, молекулы которых построены из аминокислотных остатков, соединенных между собой ковалентными пептидными связями. Белки служат основным структурным компонентом всех клеточных мембран и выполняют следующие функции: каталитическую, двигательную, транспортную, защитную, антигенную, гормональную, запасную и др.
Белки составляют 50–80% сухого вещества микробов. Различают два основных класса: протеины и протеиды. Протеины, или простые белки (альбумины, глобулины, гистоны и др.), при гидролизе распадаются только на аминокислоты (тирозин, лейцин, триптофан и др.). Протеиды, или сложные белки, — соединения простых белков (протеинов) с небелковыми группами, нуклеиновой кислотой, полисахаридами, жироподобными и другими веществами. Отсюда различают нуклеопротеиды, гликопротеиды, липопротеиды и др.
Нуклеиновые кислоты представляют собой высокомолекулярные биологические полимеры, построенные из мононуклеотидов. Для них характерно содержание фосфора (8–10%) и азота (15–16%), а также углерода, кислорода и водорода. Нуклеиновые кислоты в бактериальной клетке могут составлять от 10 до 30% сухого вещества, в зависимости от вида бактерий и питательной среды. В большинстве своем они связаны с белками (нуклеопротеиды) и сложными радикалами клеточных структур бактерии. Нуклеиновые кислоты микробных клеток представлены в виде рибонуклеиновой (РНК) и дезоксирибонуклеиновой (ДНК) кислот. РНК преимущественно содержится в цитоплазме в мельчайших ее зернышках — рибосомах, которые осуществляют синтез ферментов. ДНК находится в ядерном веществе бактерий. ДНК — материальный носитель наследственности всех организмов, в том числе микробов. В ее структуре закодирована генетическая информация биосинтеза белков.
Углеводы в бактериях составляют 12–18% от сухого вещества. Это многоатомные спирты (сорбит, маннит, дульцит); полисахариды (гексозы, пентозы, гликоген, декстрин); моносахариды
(глюкозы, глюкуроновая кислота и др.). Углеводы выполняют энергетическую роль в метаболитических процессах микробной клетки.
Липиды — истинные жиры, липоиды — жироподобные вещества. Ряд микробов (риккетсии, дрожжи, микобактерии, грибы) содержат липиды в значительном количестве — до 40%. У микробов других групп количество липидов по сравнению с белками невелико — не более 3–7%. Бактериальные липиды состоят из свободных жирных кислот (26–28%), нейтральных жиров, восков и фосфолипидов. Особого внимания заслуживают фосфолипиды — сложные эфиры высших спиртов и кислот, содержащие азот и фосфор. Они входят в состав токсической фракции ряда микробов.
Липиды играют роль резервных веществ и в ряде случаев могут быть использованы как исходные компоненты для синтеза белков. С ними связана кислотоустойчивость микобактерий. Они же существенно влияют на проницаемость клеточных мембран, формируют систему пограничных мембран, выполняющих различные функции по обеспечению метаболизма микробной клетки.
Химический состав спирохет, актиномицетов, микоплазм, риккетсий, микроскопических грибов в основном сходен с таковым у бактерий.
Вода является основной составной частью бактериальной клетки — 75–85%, на сухое вещество приходится всего 15– 25%. Вода находится в свободном состоянии и в связанном. Связанная вода является структурным растворителем. Свободная служит дисперсионной средой для коллоидов, растворителем для кристаллических веществ, а таже источником водородных и гидроксильных ионов. Например, гидролитические процессы расщепления белков, углеводов и липидов происходят в результате присоединения к ним воды, а синтез белков, пептидов из аминокислот, липидов из высших жирных кислот (ВЖК) и глицерина, крахмала, гликогена из глюкозы сопровождается выделением воды.
Основные химические элементы, содержащиеся в микробной клетке, следующие: кислород, водород, углерод и азот. В бактериях содержится по отношению к сухому веществу углерода — 45–55%, азота — 8–15, кислорода — 30, водорода — 6–8%.
Дрожжи углерода — 49%, азота — 12, кислорода — 31, водорода — 6%; микроскопические грибы углерода — 47%, азота — 5, кислорода — 40, водорода — 6%.
Кроме органогенов в микробных клетках находятся так называемые зольные элементы — минеральные вещества, составляющие от 3 до 10% сухого вещества. Среди них преимущественное значение имеет фосфор, который входит в состав нуклеиновых кислот, липидов, фосфолипидов. Сера содержится в аминокислотах, в метионине, цистине, цистеине. Магний обеспечивает активность ряда ферментов, например протеазы. Микробы без магния не способны проявлять протеолитические свойства. Железо необходимо для осуществления процессов дыхания и энергетического обмена. Кальций, натрий, калий, кремний, хлор тоже есть в микробных клетках. Наличие микроэлементов (молибден, кобальт, бор, марганец, цинк, медь, никель и др.) в микробах обязательно, так как они стимулируют процессы роста и размножения.
Химические элементы образуют в микробных клетках различные органические соединения: белки, углеводы, липиды, витамины.
Ферменты — это специфические органические катализаторы белковой природы, которые, как и белки, могут быть простыми и сложными. Уреаза, пепсин, трипсин, амилаза, рибонуклеаза — простые ферменты, а каталаза, дегидрогеназы, цитохромы, пируватдекарбоксилаза — сложные.
Питание и дыхание в микробной клетке происходят с участием ферментов (энзимов), регулирующих скорость и специфичность обменных химических реакций, протекающих в микроорганизме. Присутствие незначительного количества катализатора ускоряет превращение большого количества субстрата, оставаясь при этом в свободном состоянии. Например, одна часть химозина (сычужного фермента) может свернуть до 12 млн частей молока; 1 г амилазы при определенных условиях может превратить в сахар 1 т крахмала.
Ферменты синтезируются клетками и способны действовать, даже будучи выделенными из нее, что имеет большое практическое значение. Для них характерны термолабильность и высокая специфичность действия, например фермент лактаза гидролизует лактозу, но не действует на родственные дисахариды (мальтозу, целлобиозу).
В микробной клетке может находиться большое количество ферментов, например, у аспергилла до 50. Благодаря этому микроорганизмы в состоянии осуществлять одновременно ряд различных реакций в среде, где они находятся. Принято различать экзо-и эндоферменты.
Экзоферменты не связаны со структурой протоплазмы, легко выделяются в субстрат (гидролитические ферменты), растворимы в питательной среде и проходят через бактериальные фильтры. Эти ферменты участвуют в основном в процессе питания: расщепляют сложные высокомолекулярные вещества (белки, крахмал, клетчатку и др.), т. е. подготавливают питательные вещества к усвоению их микробной клеткой.
Эндоферменты прочно связаны с бактериальной клеткой и действуют только внутриклеточно, осуществляя дальнейшее разложение питательных веществ и превращение их в составные части клетки. К таким ферментам можно отнести, например, дегидрогеназы, оксидазы.
Оптимальная температура для действия ферментов 40–50°С, для некоторых — 58–60°С, при 100°С они разрушаются. На их активность влияет и рН среды. Максимум активности ферментов у бактерий, растущих в кислой среде (ацидофилы), наблюдается при рН 4,8, а в нейтральном и близком к нейтральному значению — при рН 7,2. У бактерий, способных расти в широком диапазоне рН, реакция среды заметно не влияет на активность ферментов.
Название фермента образуется от названия вещества, на которое он действует, путем прибавления окончания — аза, или связано с природой катализируемой им химической реакции. Второй вариант составляет основу современной классификации и номенклатуры ферментов.
В настоящее время известно более 2 тыс. ферментов, которые были выделены в шесть классов.
1. Оксидоредуктазы — ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции. Они играют большую роль в процессах получения биологической энергии. К ним относятся дегидрогеназы (алкоголь: НАД-оксидоредуктаза; сукцинат: ФАД-оксидоредуктаза; аскорбинат: О2-оксидоредуктаза), каталаза, цитохромы, цитохромоксидазы.
2. Трансферазы — ферменты, катализирующие перенос отдельных радикалов, частей или целых атомных групп (не водорода) от одних соединений к другим. Например, ацетилтрансферазы переносят остатки уксусной кислоты (СН3СО), фосфотрансферазы, или киназы, — остатки фосфорной кислоты (Н2РО3). Известны многие другие трансферазы (аминотрансферазы, метилтрансферазы и т. д.).
3. Гидролазы — ферменты, катализирующие реакции гидролиза (расщепления) белков, жиров и углеводов с участием воды. Это протеолитические ферменты (или пептидгидролазы), действующие на белки или пептиды, аминолитические гидролазы глюкозидов, осуществляющие каталитическое расщепление углеводов и глюкозидов (b-фруктофуранозидаза, a-глюкозидаза, a-и b-амилаза, b-галактозидаза и др.), липотические экстразы, катализирующие расщепление и синтез сложных эфиров (липазы, фосфатазы).
4. Лиазы — ферменты, катализирующие отщепление от субстратов определенных химических групп с образованием двойных связей или присоединение отдельных групп или радикалов по двойным связям. Так, пируватдекарбоксилаза катализирует отщепление СО2 от пировиноградной кислоты:
Пируватдекарбоксилаза
2
тиамин (B ) ДФ, Mg
CH COCOOH
CH COH
CO.
1
3
3
2 Пировиноградная кислота
Уксусный альдегид
К лиазам принадлежит фермент фруктозодифосфатлиаза, или альдолаза, расщепляющий шестиуглеродную молекулу фруктозо-1,6-дифосфата на два трехуглеродных соединения. Альдолаза активно участвует в процессе обмена веществ.
5. Изомеразы — ферменты, осуществляющие превращение органических соединений в изомеры. При изомеризации происходит внутримолекулярное перемещение атомов, атомных группировок, различных радикалов и т. п. Изомеризации подвергаются углеводы и их производные, органические кислоты, аминокислоты и т. д. Ферменты этой группы играют большую роль в ряде процессов метаболизма. К ним относятся триизофосфатизомераза, глюкозофосфатизомераза и др.
6. Лигазы (синтетазы) — ферменты, катализирующие процессы синтеза связей за счет энергии распада АТФ, образуют следующие связи: С–О; С–S; С–N; С–С.
В результате образования связей из двух исходных молекул синтезируется новое органическое вещество. Например, аспарагинсинтетаза осуществляет синтез амида аспарагина из аспарагиновой кислоты и аммиака с образованием связи С–N с обязательным участием аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), дающей энергию для этой реакции:
Аспарагинлигаза
Аспарагиновая кислота
NH
АТФ
3
Аспарагин
АДФ
H PO.
3
4
К лигазам принадлежат также карбоксилазы, катализирующие присоединение СО2 к органическим кислотам. Например, фермент пируватдекарбоксилаза катализирует синтез щавелевоуксусной кислоты из пировиноградной кислоты и СО2 с образованием связи С–С.
Образование связи С–С катализирует фермент ацетилкоэнзим А синтетаза. В результате этой реакции образуется активная форма уксусной кислоты — ацетил КоА.
Ацетил КоА синтетаза КФ 6.2.1.1:
HC
KoA
АТФ
O
CH COOH
CH
C
KoA.
3
3
АМФ
P
P
H O
S
2
Ацетил KoA
HS–КоА — это небелковая часть (кофермент) фермента ацетилирования.
По современной классификации каждому ферменту присвоен шифр из четырех цифр: первая обозначает класс, вторая — подкласс, третья — подподкласс и четвертая — порядковый номер фермента в данном подподклассе.
Так, шифр КФ 3.5.1.5 принадлежит карбамидамидогидролазе (уреазе), которая относится к третьему главному классу — гидролазам.
Шифр ацетил КоА синтетазы — КФ 6.2.1.1, т. е. данный фермент относится к шестому классу лигаз, ко второму подклассу (образование С– связи) и к первому подподклассу (место образования связи в карбоксильной группе), последняя цифра — порядковый номер фермента.
Скорость реакций, катализируемых ферментами, различна и зависит от количества и активности ферментов, концентрации субстрата, рН, температуры, присутствия в среде активаторов и ингибиторов.
Активность измеряют в международных единицах (ME). 1 ME соответствует количеству фермента, превращающему 1 мкМ (микромоль) (мг/М; 10–6 М) субстрата за 1 мин в стан!
дартных условиях.
Разнообразные ферменты, синтезируемые клетками мик! роорганизмов, используют в промышленном производстве для приготовления уксусной, молочной, щавелевой, лимонной ки! слот, молочнокислых продуктов (сыр, ацидофилин, кумыс и пр.), в виноделии, пивоварении, силосовании. По ферментативной специфичности бактерий в лабораторных условиях осуществ! ляют дифференциацию их на виды, разновидности.
Все реакции жизнеобеспечения, происходящие в микроб! ной клетке и катализируемые ферментами, составляют обмен веществ, или метаболизм. Промежуточные или конечные ве! щества, образующиеся в соответствующей последовательности ферментативных реакций, в результате которых разрушается или синтезируется ковалентно!связанный скелет конкретной биомолекулы, называют метаболитами.
В метаболизме микроорганизмов непрерывно осуществля! ются два противоположных взаимосвязанных процесса: анабо! лизм и катаболизм, т. е. обмен конструктивный и энергетиче! ский. Анаболизм — это обмен веществ, протекающий с погло! щением свободной энергии при расходовании сравнительно небольшого объема питательного материала; катаболизм — процесс выделения свободной энергии, на что расходуется ог! ромная масса питательного субстрата.
По типу питания живые существа подразделяют на две груп! пы: голозойные и голофитные. Голозойный тип питания ха! рактерен для животных (от высших до простейших), а голо! фитный — для микробов, так как они не имеют органов для принятия пищи и питательные вещества проникают через всю поверхность их тела.
Различают несколько механизмов питания микробных кле! ток. Питательные вещества могут поступать из окружающей среды в микробную клетку через клеточную стенку, капсулу, слизистые слои и цитоплазматическую мембрану. Через эти же структуры выделяются и продукты обмена, т. е. ненужные и вредные для микроорганизмов вещества. В основе механизма такого питания лежит осмотическое явление, основанное на
разнице концентрации питательных веществ в теле микроба и питательном растворе. Таким образом, вода и растворенные в ней питательные вещества поступают в микробную клетку. В ре- зультате биосинтеза в ней накапливается пластический мате- риал коллоидной структуры (белки, углеводы и другие вещест- ва), обусловливающие рост и размножение микроорганизма.
Диффузия питательных веществ в клетку может осущест- вляться благодаря их стереохимическому специфическому пе- реносу. Каждый из этих процессов может протекать как ак- тивно, так и пассивно. При пассивной диффузии питательные вещества переносятся с током жидкости только при условии, что проникающее вещество способно растворяться в клеточ- ной стенке бактериальной клетки. При активной диффузии наблюдается проникновение питательных веществ в нераство- ренном виде.
При стереохимическом переносе питательных веществ (из внешней среды в клетку) роль переносчика выполняет белко- вый компонент — пермеаза. Питательные вещества среды ак- тивно транспортируются в клетку, осуществляя конструктив- ный и энергетический обмены.
В норме у бактериальных клеток коллоиды цитоплазмы благодаря постоянному притоку к клетке воды всегда нахо- дятся в набухшем состоянии, в результате чего цитоплазма бывает плотно прижата к оболочке. Такое явление получило название тургора бактериальной клетки. Величина осмоти- ческого давления у бактерий при этом не превышает 6Ч105 Па,
у микробов, обитающих в морях и океанах, осмотическое дав- ление достигает 6Ч107 Па.
Если бактерию поместить в 15–20%-ный раствор хлорида натрия или сахара (гипертонический раствор), то наступает рез- кое обезвоживание бактерийной клетки и протоплазматическое
содержание ее отходит от оболочки. Такое явление носит на-
звание плазмолиза. Морфологически плазмолиз характеризу- ется возникновением шарообразных светопреломляющих обра- зований в теле клетки. У различных микроорганизмов плазмо- лиз проявляется не в одинаковой степени. К нему особенно устойчивы сенная бацилла, стафилококки, сарцины. Легко под- вергаются плазмолизу бактерии из группы пастерелл, эшери- хий, сибиреязвенная бацилла, холерный вибрион и др.
Противоположный плазмолизу процесс — плазмоптиз — происходит, если бактерии поместить в гипотонический рас- твор хлорида натрия или в дистиллированную воду, которая начинает проникать в бактерийную клетку, при этом ее цито- плазматическое вещество разбухает до крайних пределов и клет- ка приобретает форму шара. Плазмоптиз, как и плазмолиз, вле- чет за собой гибель микробной клетки.
Различают два типа питания микробов: углеродное и азот- ное. По типу углеродного питания микробы принято делить на аутотрофы и гетеротрофы.
Аутотрофы, или прототрофы, (от греч. autos — сам, trophe — пища) — микроорганизмы, способные воспринимать углерод из угольной кислоты (СО2) воздуха. К ним относятся нитрифици- рующие бактерии, железобактерии, серобактерии и др. Ауто- трофы синтезируют воспринятую углекислоту в сложные орга- нические соединения путем хемосинтеза, т. е. окислением хи- мических соединений (аммиак, нитриты, сероводород и др.). Таким образом, аутотрофные микробы обладают способностью синтезировать необходимые им органические соединения из неорганических, таких, как угольная кислота, аммиак, нитри- ты, сероводород и др. Поскольку такие микробы не нуждаются в органических соединениях углерода, входящего в состав тела животных и человека, они не являются болезнетворными. Од- нако среди аутотрофов встречаются микробы, обладающие спо- собностью усваивать углерод из СО2 воздуха и из органических соединений. Такие микробы определены как миксотрофы (мик- со — смесь, т. е. смешанный тип питания). Отдельные виды ау- тотрофных микробов осуществляют питание подобно зеленым растениям за счет фотосинтеза. Так, пурпурные серобактерии вырабатывают особый пигмент типа хлорофилла — бактериопур- пурин, при помощи которого и происходит использование свето- вой энергии (фотосинтез) для построения органических веществ своего тела из угольной кислоты и неорганических солей.
Гетеротрофы (от греч. heteros — другой) в противополож- ность аутотрофным микробам используют углерод главным об- разом из любых готовых органических соединений. К ним от- носятся возбудители различного рода брожений, гнилостные микробы, а также все болезнетворные микроорганизмы — воз- будители туберкулеза, бруцеллеза, листериоза, сальмонеллеза,
патогенные стафилококки, стрептококки, диплококки и ряд других инфекций.
Однако все физиологическое многообразие микроорганиз- мов не укладывается в дифференциацию на аутотрофы и гете- ротрофы. В действительности же при изменении условий сре- ды (например, питания) обмен веществ у микробов может ме- няться. Так, если микроб поместить в другую, необычную для него питательную среду, он начнет вырабатывать адаптивные (приспособительные) ферменты (энзимы). В качестве примера могут служить азотфиксирующие бактерии (аутотрофы), кото- рые на богатых белковых питательных средах перестают ис- пользовать молекулярный азот воздуха и начинают усваивать связанный азот (гетеротрофный тип усвоения азота).
Гетеротрофы включают в себя две подгруппы: метатрофные и паротрофные микроорганизмы. Метатрофы, или сапрофи- ты, живут за счет использования мертвых субстратов. Сапро- фиты (от греч. sapros — гнилой, fhyton — растение) — гнилост- ные микробы. Паратрофы (от греч. parasites — нахлебник) — паразиты, живущие на поверхности или внутри организма хо- зяина и питающиеся за его счет.
В качестве источника углерода гетеротрофы чаще всего ис- пользуют углероды, различные органические кислоты. Наибо- лее полноценными являются сахара (особенно гексозы), много- атомные спирты (глицерин, маннит, сорбит и др.), а также кар- боновые кислоты (например, глюкуроновая) и оксикислоты (молочная, яблочная и др.), которые обычно и включают в со- став искусственных питательных сред для выращивания мик- роорганизмов.
Основным источником азотного питания у аутотрофов слу- жат неорганические соединения азота, т. е. соли азота, а у гете- ротрофов — аминокислоты, которые они используют из белков животного организма, если в нем паразитируют, или получают их готовыми из питательных сред.
По способу усвоения азотистых веществ микробы подразде- ляют на четыре группы.
1. Протеолитические, способные расщеплять нативные бел- ки, пептиды и аминокислоты.
2. Дезаминирующие, способные отщеплять аминогруппы только у свободных аминокислот.
3. Нитритно-нитратные, усваивающие окисленные формы азота.
4. Азотфиксирующие, обладающие свойством питаться атмосферным азотом.
В качестве универсального источника азота и углерода в питательных средах для патогенных микробов применяют пептоны. Потребность микроорганизмов в зольных элементах незначительна. Необходимые для их жизни минеральные соли (сера, фосфор и др.) присутствуют в естественной питательной среде. Серу бактерии получают в основном из сульфатов или органических соединений аминокислот (цистин, цистеин). Серобактерии, например, могут сами ассимилировать даже молекулярную серу. В их теле находится до 80% серы. Фосфор входит в состав нуклеопротеидов и фосфолипидов бактерийной клетки и играет весьма важную роль в ее биосинтетических процессах. Источник питания фосфором — различные фосфорнокислые соли, например тринатрийфосфат (Na3PO4).
Жизненно необходимые элементы — калий, магний и железо — микроорганизмы получают из различных солей. Железо входит в состав гемина (особая органическая группа цитоплазмы) и служит катализатором окислительных реакций. Калий — обязательный элемент в питательной среде, но физиологическое значение его еще полностью не выяснено. Роль кальция в жизни бактерий (за исключением бактерий, участвующих в фиксации азота из воздуха), по-видимому, невелика. Магний активирует различные ферменты бактерий, в частности протеазу. Микроэлементы — бор, цинк, марганец, кобальт и другие — встречаются в бактериях в ничтожных количествах и служат стимуляторами роста микробов.
Факторы роста микробов. В 1901 г. Вильдье в дрожжах обнаружил особое вещество, названное им «биос» — ростовое вещество. В 1904 г. наш соотечественник Я. Я. Никитинский нашел такие же стимуляторы роста в культурах плесневых грибов. В дальнейшем подобные вещества были выявлены у патогенных микроорганизмов и простейших. Одновременно было установлено, что у ряда микробов под воздействием ничтожно малых количеств ростовых веществ существенно увеличивается накопление микробной массы и изменяется обмен веществ. Новейшие данные показали, что по химической
структуре и физиологическому действию стимуляторы представляют собой подлинные витамины или витаминоподобные вещества.
Все изученные бактерии нуждаются в витаминах или ростовых веществах, которые играют главным образом роль катализаторов (ускорителей) биохимических процессов бактерийной клетки. Они же служат структурными единицами при образовании некоторых ферментов. К витаминам, необходимым для развития микробов, принадлежат биотин (витамин Н), витамины группы В: В1 (тиамин), В2 (рибофлавин), В3 (пантотеновая кислота), В4 (холин), В5 (никотинамид), В6 (пиродоксин), В7 (гемин), витамин К и др. Концентрация витаминов в питательной среде выражается в микрограммах (мкг), потребность в них составляет 0,05–40 мкг/мл. Избыток витаминов задерживает рост бактерий.
Кроме витаминов к факторам роста бактерий относятся пуриновые и пиримидиновые основания и их производные (аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил, ксантин и гипоксантин). Например, для гемолитического стрептококка фактор роста это — аденин, для золотистого стафилококка — урацил, возбудителя столбняка — аденин или гипоксантин.
Некоторые микроорганизмы в качестве фактора роста используют аминокислоты, синтезируемые самой микробной клеткой или специально внесенные в питательную среду.
Чтобы охарактеризовать все многообразие способов питания микроорганизмов, были предложены способы, указывающие на источник энергии донора водорода (электронов) и источник углерода.
Организмы, способные использовать в качестве источника энергии свет, называют фототрофными. Те, что получают энергию в результате окислительно-восстановительных реакций с участием субстратов, служащих для них источниками питания, — хемотрофными. Все организмы, использующие в качестве доноров водорода органические соединения, называют ор- ганотрофными, а способные использовать неорганические доноры электронов — литотрофными.
Цианобактерии и пурпурные серобактерии относят к фотолитотрофам, нитрифицирующие бактерии — к хемолитотрофам и основную массу микроорганизмов — к хемоорганотрофам.
Дыхание микробов — это биологический процесс, сопровождаемый окислением или восстановлением различных, преимущественно органических, соединений с последующим выделением энергии в виде аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), необходимой микробам для физиологических процессов жизнедеятельности.
Процесс, в котором атомы или молекулы отдают электроны (е), называют окислением, а обратный процесс — присоединение электронов — восстановлением. Примером этого служит обратимая реакция превращения восстановленного двухвалентного железа в окисленное трехвалентное железо.
2
3
Fe
e
Fe
Восстановленное железо
Окисленное железо
Перенос электрона всегда сопровождается высвобождением энергии, которая немедленно аккумулируется в аденозиндифосфате (АДФ) и аденозинтрифосфате (АТФ) и расходуется в результате жизнедеятельности микробной клетки.
Установлено, что биологическое окисление протекает путем дегидрирования (отщепления водорода) от окисляемого соединения и последующего присоединения его к активному кислороду или же к другому акцептору, если окисление идет в анаэробных (бескислородных) условиях.
Совокупность окислительно-восстановительных ферментных реакций, осуществляющих последовательный перенос водорода с окисляемого продукта на кислород, называют тканевым дыханием, которое представляет собой дыхательную цепь.
Водород отщепляется от окисляемого органического соединения в виде двух протонов (2Н+) и двух электронов (2е), т. е. в виде двух атомов водорода (Н2). В переносе электронов и протонов в реакциях биологического окисления или тканевого дыхания участвуют три главных окислительно-восстановленных фермента.
1. Пиридинзависимые дегидрогеназы с коферментами: НАД — никотинамидадениндинуклеотид; НАДФ — никотинамидаденин-динуклеотидфосфат окисленные; НАД-Н2, НАДФ-Н2 — восстановленные.
2. Флавинзависимые дегидрогеназы с коферментами ФАД; флавинаденин-динуклеотид или ФАМ — флавинаденин-мононуклеотид окисленные; ФАД-Н2 или ФАМ-Н2 — восстановленные.
3. Геминовые ферменты: цитрохромы В, С1, С; цитохромоксидазы А и А3, каталаза и пероксидаза. Коферментом их служит гем.
Цитохромы переносят только электроны (е) за счет железа гема. Обычно оно находится в окисленной форме (Fe3+), а после присоединения электрона переходит в восстановленную форму (Fe2+).
Среди компонентов переноса электронов обнаружен убихинон (коэнзим Q). Восстановленный КоQ–Н2 отдает ионы водорода 2Н+ в окружающую среду (в раствор клетки), а электрон переходит на цитохром и присоединяется к иону железа:
2Fe3+ – 2e ® 2Fe2+.
Далее элетроны от цитохрома В переходят на цитохром С1, затем на цитохром С и на цитохромоксидазу А + A3. С цитохромоксидаз электрон переносится на кислород и превращает его в aктивную форму. Активный кислород восстанавливается активным водородом до Н2О в 90% случаев или до пероксида водорода в 10% случаев. Пероксид водорода — сильнейший яд, который можно разрушить ферментами каталазой или пероксидазой.
При восстановлении одного атома кислорода активным водородом до Н2О образуется три молекулы АТФ — аденозинтрифосфорной кислоты:
НАД
ФАД
B
C
A
A.
3
АТФ
АТФ
АТФ
Биологическое окисление субстрата микроорганизмами происходит по типу прямого окисления или дегидрогенирования.
Прямое окисление осуществляется с помощью оксидаз путем непосредственного окисления вещества кислородом воздуха. Оно присуще большинству сапрофитных микроорганизмов. Например, Bact. metanicum, окисляя метан, получает энергию по следующей схеме:
СН4 + 2О2 = СО2 + 2Н2О + 946 кДж энергии.
У некоторых микробов, поглощающих кислород, реакции окисления неполные, т. е. не доходят до получения конечного продукта — углекислоты. Примером такого неполного окислительного процесса служит дыхание уксуснокислых бактерий, у которых конечным продуктом окисления этилового спирта яв- ляется не углекислота, а уксусная кислота.
СН3СН2ОН + О2 = СН3СООН + Н2О.
Непрямое окисление представляет собой реакцию дегидро- генизации и сопровождается одновременным переносом двух электронов, причем от субстрата отщепляются два протона (Н+). При ферментативном отщеплении водорода от субстрата при помощи дегидрогеназ освобождаются два электрона (энергия) подобно образованию ацетальдегида из этилового спирта:
С2Н5ОН – 2Н+ « С2Н4О + 2е.
Дегидрогеназ у бактерий несколько, они называются по до- нору водорода (например, алкогольдегидрогеназа, лактатдегид- рогеназа), но большинство их переносит водород на один из двух коферментов — никотинамидадениндинуклеотид (НАД+) или никотинамидаденин-динуклеотидфосфат (НАДФ+). Оба кофер- мента легко отделяются от одной дегидрогеназы и связываются с другой дегидрогеназой, переносят водород на другой акцеп- тор. НАД Ч Н (+Н) переносит водород преимущественно на пред- шественников брожения или в дыхательную цепь; НАДФ Ч Н (Н) — участвует в основном в биосинтезе.
Аэробное дегидрирование происходит в присутствии кис- лорода и у таких микробов, как, например, бациллы, акцеп- тором водорода является кислород, в результате чего в зави- симости от набора ферментов образуется вода или пероксид водорода. Для их целей у аэробных бактерий служат цитохром- оксидаза и система геминовых ферментов-цитохромов. Цито- хромоксидаза катализирует конечное связывание водорода с атмосферным кислородом вне клетки. Если цитохромоксида- за переносит две пары водородных ионов, образуется вода: 4Fe2+ + 4Н+ + О2 ® 4Fe3+ + H2О. Если она связывает с кислоро-
дом воздуха только одну пару водородных ионов, то конечный продукт — пероксид водорода: 2Fe2+ + 2Н+ + О2 ® 2Fe3+ + H2О2.
Поскольку пероксид водорода токсичен для бактерий, он мо- ментально разлагается каталазой или пероксидазой. Облигат- ные анаэробы каталазу не содержат, чем частично можно объ- яснить токсичность кислорода для них.
Анаэробное дегидрогенирование осуществляется в отсутствие молекулярного кислорода. Акцепторами водорода служат другие неорганические элементы, например соли азотной, серной кислот, углекислоты, которые превращаются при этом в более восстановленные соединения (аммиак, метан, сероводород). Свойство анаэробов переносить электроны на нитраты, сульфаты и карбонаты обеспечивает в достаточной степени полное окисление органического или неорганического вещества без использования молекулярного кислорода и обусловливает возможность получения ими большего количества энергии, чем при процессе брожения. При анаэробном дыхании выход энергии только на 10% ниже, чем при аэробном. Микроорганизмы, для которых характерно анаэробное дыхание, имеют набор ферментов цепи переноса электронов, но цитохромоксидаза у них заменяется нитратредуктазой (в случае использования нитратов) или аденилилсульфатредуктазой (в случае использования сульфатов).
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЙ
ПОТЕНЦИАЛ
ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ
При изготовлении питательных сред учитывают не только рН среды но и соотношение веществ, отдающих и принимающих электроны. Величину окислительно-восстановительного потенциала обозначают символом rН2 — отрицательный логарифм парциального давления газообразного водорода. Он измеряется потенциометром или на универсальном ионометре в mV и обозначается в единицах. Диапазон rН2 от 0 до 42,6 характеризует все степени насыщения раствора Н и О2. Так, строгие анаэробы растут при низком окислительно-восстановительном потенциале от 0 до 12, факультативные микроорганизмы — от 0 до 20 и аэробы — от 14 до 35. Следовательно, он минимален при насыщении кислородом. Регулируя степень окислительно-восстановительного потенциала, мы создаем благоприятные условия для роста и размножения микроорганизмов.
Методы создания анаэробиоза. Для выделения анаэробных возбудителей инфекционных болезней создают анаэробные условия культивирования, используя несколько методов.
Физический метод заключается в удалении воздуха из эксикатора или анаэростата при помощи масляного вакуумного насоса. Жидкие среды перед посевом для удаления из них воздуха кипятят, т. е. проводят регенерирование среды. Для предотвращения контакта жидкой среды с воздухом на ее поверхность наносят слой вазелинового масла.
Химический метод основан на применении поглотителей кислорода, например пирогаллола с гидроокисью натрия, калия либо гидросульфита натрия с гидрокарбонатом натрия в соотношении 1:1.
Биологический метод (метод Фортнера) основан на выращивании анаэробов в присутствии аэробов (например «чудесной палочки») в одной чашке Петри. Вначале вырастает аэробная культура, а затем, по мере поглощения кислорода из чашки, начинает развиваться анаэробная культура.
Комбинированный метод предусматривает использование двух методов, скажем, физического и химического.
Нередко удается ослабить или полностью нейтрализовать вредное для бактерий действие кислорода, внося в питательную среду восстановитель (аскорбиновую кислоту, тиогликолат, цистеин).
Рост и размножение бактерий. Термин «рост» означает увеличение цитоплазматической массы отдельной клетки или группы бактерий в результате синтеза клеточного материала (например, белка, РНК, ДНК). Достигнув физиологической зрелости, клетка прекращает рост и начинает размножаться. Под размножением микробов подразумевают их способность к самовоспроизведению, увеличению количества особей на единицу объема. То есть размножение — это увеличение числа особей микробной популяции.
Бактерии размножаются преимущественно простым поперечным делением (вегетативное размножение) в различных плоскостях. Например, у стафилококков новые клетки располагаются беспорядочно, в виде кисти винограда; у стрептококков — в виде цепочки; у диплококков — это соединения по парам; у сарцин — в виде пакетов и др. Процесс деления состоит из ряда последовательных этапов. Первый этап начинается формированием в средней части клетки поперечной перегородки, состоящей вначале из цитоплазматической мембраны, которая
делит цитоплазму материнской клетки на две дочерние. Параллельно с этим синтезируется клеточная стенка, образующая полноценную перегородку между двумя дочерними. В процессе деления бактерий важным условием является репликация (удвоение) ДНК, которая осуществляется ферментами ДНКполимеразами. Перед удвоением ДНК происходит разрыв водородных связей и образование двух спиралей ДНК, каждая из которых находится в дочерних клетках. Далее дочерние односпиральные ДНК восстанавливают водородные связи и вновь образуют двуспиральные.
Репликация ДНК и деление клеток происходит с определенной скоростью, присущей каждому виду микроба, что зависит от возраста культуры и характера питательной среды. Например, скорость роста кишечной палочки составляет примерно 16–20 мин; у микобактерий туберкулеза — 18–20 ч. Клетки культуры тканей млекопитающих начинают делиться через сутки. Следовательно, большинство видов бактерий размножаются почти в 100 раз быстрее, чем клетки культуры тканей.
Существуют следующие типы деления клеток бактерий.
1. Клеточное деление опережает разделение, что приводит к образованию «многоклеточных» палочек и кокков.
2. Синхронное клеточное деление, при котором разделение и деление нуклеоида сопровождаются образованием одноклеточных организмов.
3. Деление нуклеоида опережает клеточное деление, обусловливая образование многонуклеоидных бактерий.
Разделение бактерий, в свою очередь, происходит тремя способами.
1. Разламывающее разделение, при котором две индивидуальные клетки, неоднократно переламываясь в месте сочленения, разрывают цитоплазматический мостик и отталкиваются друг от друга, при этом формируются цепочки (сибиреязвенные бациллы).
2. Скользящее разделение, при котором после деления клетки обособляются и одна из них скользит по поверхности другой (отдельные разновидности эшерихий).
3. Секущее разделение, когда одна из разделившихся клеток свободным концом описывает дугу круга, центром которого служит точка ее контакта с другой клеткой, образуя римскую пятерку или клинопись (коринобактерии дифтерии, листерии).
Фазы развития бактериальной популяции. Теоретически допустимо, что если бактериям создать условия непрерывного притока и прогрессивного увеличения массы свежей питательной среды и оттока продуктов выделения, то размножение будет возрастать логарифмически, а гибель — арифметически.
Общую закономерность роста и размножения бактериальной популяции представляют графически в виде кривой, которая отражает зависимость логарифма числа живых клеток от времени. Типичная кривая роста имеет S-образную форму и позволяет различать несколько фаз, идущих в определенной последовательности.
1. Исходная (стационарная, латентная или фаза покоя) представляет собой период от момента посева бактерий на питательную среду до их роста. В этой фазе число живых бактерий не увеличивается, а может даже уменьшиться. Продолжительность — 1–2 ч.
2. Во время фазы задержки размножения бактериальные клетки интенсивно растут, но слабо размножаются, продолжительность около 2 ч и зависит от ряда условий: возраста культуры (молодые культуры приспосабливаются быстрее, чем старые), биологических особенностей микробных клеток (для кишечных бактерий характерен короткий период приспособления, для микобактерий туберкулеза — длительный), полноценности питательной среды, температуры выращивания, концентрации СО2, рН, степени аэрации среды, окислительно-восстановительного потенциала и др. Нередко обе фазы объединяют термином «лаг-фаза» (от англ. lag — отставание, запаздывание).
3. В период логарифмической фазы скорость размножения клеток и увеличение бактериальной популяции максимальны. Период генерации (от лат. generatio — рождение, воспроизведение), т. е. время, прошедшее между двумя последовательными делениями бактерий, постоянное для данного вида, а количество бактерий удваивается в геометрической прогрессии. Это означает, что в конце первой генерации из одной клетки формируются две, в конце второй — обе бактерии, разделяясь, образуют четыре, из полученных четырех формируются восемь и т. д.
Следовательно, после n генераций количество клеток в культуре будет равно 2 n. Продолжительность — 5–6 ч.
4. Во время фазы отрицательного ускорения скорость раз- множения бактерий снижается, число делящихся особей умень- шается, а число погибших увеличивается. Продолжительность около 2 ч. Одна из возможных причин, замедляющих размно- жение бактерий, — истощение питательной среды, т. е. исчез- новение специфических веществ, необходимых для жизнеспо- собности данного вида.
5. В период стационарной фазы максимума число новых бак- терий почти равно числу отмерших, т. е. наступает равновесие между погибшими клетками и вновь образующимися. Продол- жительность — 2 ч.
6. Фаза ускорения гибели характеризуется прогрессивным превосходством числа погибших клеток над числом вновь на- рождающихся. Продолжительность — около 3 ч.
7. Во время фазы логарифмической гибели отмирание кле- ток происходит с постоянной скоростью. Продолжительность — около 5 ч.
8. В период фазы уменьшения скорости отмирания остаю- щиеся в живых клетки переходят в состояние покоя.
У микроскопических грибов различают три типа размноже- ния: вегетативное, бесполое и половое. При вегетативном размно- жении происходит отделение от мицелия его частей, которые, раз- виваясь, образуют новую грибницу. Кроме того, мицелий может фрагментироваться на артроспоры (оидии) и хламидоспоры. Артроспоры — короткие овальные клетки, образующиеся при распа- де гиф, каждая из которых дает начало новой клетке. Хламидоспоры — споры вегетативного размножения грибов, покрытые толстой темноокрашенной оболочкой; образуются при распаде гиф на отдельные клетки. Этот тип размножения также может осуществляться путем почкования мицелия или отдельных кле- ток, например у дрожжевых грибов. Наиболее распространено бесполое размножение при помощи спор.
Созревшие конидии у грибов осыпаются. При созревании спорангиоспор спорангии лопаются и из них высыпаются спо- ры. Попав в благоприятные условия, они прорастают в гифы.
При половом размножении грибов спорообразованию пред- шествует слияние гаплоидных мужских и женских гамет, в
результате чего возникает зигота и наступает диплоидная фаза с полным (парным) набором хромосом. Половой процесс у разных групп грибов протекает различно и имеет свои осо- бенности.
Наиболее распространенный способ вегетативного размно- жения дрожжей (гетеротрофы с окислительным или бродиль- ным типом метаболизма) — почкование, реже — деление. При половом размножении после копуляции двух клеток и при слия- нии ядер зигота превращается в аску, диплоидное ядро делится 2–3 раза и образуется четыре или восемь аскоспор, каждая из которых может прорастать в новую клетку.
Синтез микробных пигментов, фосфоресцирующих и ароматообразующих веществ. Микроорганизмы в процессе жиз- недеятельности синтезируют красящие вещества — пигменты, придающие колониям бактериальных культур разнообразный цвет и оттенки, что учитывают при дифференциации микроор- ганизмов. Различают красные пигменты (актиномицеты, дрож- жи, грибы, «чудесная палочка» — Bact. marcencens), желтые или оранжевые (микобактерии туберкулеза, сарцины, стафилокок- ки), сине-зеленого цвета (синегнойная палочка — Pseudomonos aeruginosa, бактерия синего молока — Bact. syncyaneum), фио- летовые (Chromobacterium veolaceum), черные (некоторые виды грибов, дрожжей, актиномицетов). Образование пигментов происходит в присутствии кислорода при комнатной темпера- туре и освещении. Такие микроорганизмы, развиваясь на пи- щевых продуктах (молоко, сыр, мясо, рыба, масло, творог), изменяют их цвет.
Различают пигменты, растворимые в воде (синегнойная бак- терия, бактерии сине-зеленого молока — пиоцианин, синциа- нин), в спирте (пигменты «чудесной» бактерии, стафилококков и сарцин — красный, золотистый, лимонно-желтый), нераство- римые ни в воде, ни в спирте (черные пигменты актиномицетов, грибов, азотобактера), выделяющиеся в окружающую среду (хромонарные), остающиеся в теле микроорганизмов (хромо- форные).
Физиологическое значение пигментов в жизнедеятельности микроорганизмов до конца не изучено. Точно установлено, что пигментообразующие микроорганизмы более резистентны к действию физико-химических и биологических факторов.