1.4. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
НА МИКРООРГАНИЗМЫ
И ПРАКТИЧЕСКОЕ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
К числу основных физических факторов, воздействующих на микроорганизмы как в естественной среде обитания, так и в искусственно созданных условиях, относятся: температура, свет, электричество, высушивание, различные виды излучения, осмотическое давление и др.
О влиянии температуры на микроорганизмы обычно судят по их способности расти и размножаться в определенных температурных границах. Для каждого вида бактерий определена такая оптимальная граница. В зависимости от пределов этой температуры бактерии разделены на следующие три физиологические группы: психрофильные (от греч. psichros — холодный, phileon — любить), мезофильные (mesos — средний) и термофильные (termos — теплый).
Психрофильные микроорганизмы (психрофилы) — преимущественно обитатели северных морей, почвы, сточных вод (светящиеся бактерии, некоторые железобактерии и др.). Температурные границы психрофилов: минимум — около 0°С, оптимум — 15–20, максимум — 30–35°С.
Мезофильные бактерии — наиболее обширная группа. Сюда относятся большинство сапрофитов и все патогенные микроорганизмы. Температурный минимум — 10°С, оптимум — 30–37, максимум — 40–45°С.
Термофильные бактерии часто и в большом количестве встречаются в природе — почве, воде, теплых минеральных источниках, а также в пищеварительном тракте животных и человека. Их температурный минимум — 35°С, оптимум — 50– 60, максимум — 70–75°С.
Способность некоторых неспорообразующих бактерий существовать в горячих источниках при температуре 40–93°С и выше послужила основанием для выделения этих организмов в новую группу экстремально-термофильных бактерий. Возможность существования термофилов при высокой температуре обусловлена особым составом липидных компонентов клеточных мембран, высокой термостабильностью белков и ферментов, а также клеточных ультраструктур.
Высокие и низкие температуры по-разному влияют на микробы. При низких температурах микробная клетка переходит в состояние анабиоза, в котором она может существовать длительное время. Так, эшерихии сохраняют жизнеспособность при –190°С до 4 мес., холерный вибрион при –45°С до 2 мес., возбудитель листериоза при –10°С до 3 лет. Низкие температуры приостанавливают гнилостные и бродильные процессы. На этом принципе основано хранение продуктов в ледниках, погребах и холодильниках. В микробиологической практике широко применяется длительное хранение культур микробов, иммуноглобулинов, антибиотиков, живых вакцин в высушенном виде из замороженного состояния (–76°С). Данный метод называется лиофилизацией (от греч. lуо — растворять, phileo — люблю).
При лиофилизации свободная вода и вода, непрочно связанная с гидрофильными веществами клеток, подвергается замораживанию, и затем происходит сублимация льда, т. е. его переход из твердого состояния в парообразное, минуя жидкую фазу. После этого остается сухая пористая масса, которая при добавлении к ней воды легко суспендируется. Повторное замораживание и оттаивание неблагоприятно воздействуют на микроорганизмы и может стать причиной их гибели при лиофилизации.
Высокая температура, в особенности нагревание паром под давлением, губительно действует на микробы. Чем выше температура предела максимума, тем быстрее погибают вегетативные формы микроорганизмов, так, при 60°С — через 30 мин, при 70°С — через 10–15, при 80–100°С — через 1 мин. В основе бактерицидного действия высоких температур лежит разрушение ферментов каталазы, оксидаз, дегидраз за счет денатурации (свертывание) белков и нарушения осмотического барьера. Воздействие высокой температурой — самый распространенный, удобный и надежный способ стерилизации, т. е. обеспложивания (sterilis — бесплодный), уничтожения различных микробов и их спор в разнообразных объектах. Существуют разные способы стерилизации: прокаливание на огне, кипячение, стерилизация сухим жаром в печах Пастера (сухожаровые шкафы), стерилизация паром под давлением в автоклавах, без давления в аппарате Коха, тиндализация (дробная стерилизация
при 56–58°С), пастеризация — метод, предложенный Пастером с целью сохранения питательной ценности молока, вина, различных консервов, которые постепенно нагревают до 80°С за 30 мин, а затем быстро охлаждают до 4–8°С. При пастеризации погибают вегетативные формы микробов, споры же сохраняются, но быстрое охлаждение и хранение продукта при 4–5°С препятствует их прорастанию и последующему размножению микробов.
Стерилизации подвергают перевязочный материал, хирургические инструменты, различные растворы. Система мер, полностью предотвращающих проникновение микроорганизмов в макроорганизм при ранении, хирургических вмешательствах, называется асептикой. Уничтожение микроорганизмов в ранах при помощи химических средств (растворы хлора, йода, пероксид водорода, калия перманганата, этакридина лактата, метиленового синего, бриллиантового зеленого, азотнокислого серебра и др.) называется антисептикой (от греч. anti — против, septikos — гнилостный).
Многие виды микроорганизмов надолго сохраняют жизнеспособность после высушивания, хотя расти и размножаться в этих условиях не могут. В высохшей мокроте больных туберкулезом возбудитель остается вирулентным до 10 мес., споры бацилл сибирской язвы сохраняются свыше 60 лет, плесневых грибов — до 20. Высушивание сопровождается обезвоживанием цитоплазмы и денатурацией белков и бактерий.
Дегидратация (обезвоживание) вегетативных форм бактериальных клеток преимущественно вызывает их гибель. Некоторые микроорганизмы, особенно морские и пресноводные, а также патогенные виды быстро погибают при высыхании, т. е. они не могут существовать без воды или соков животного организма. Споры, конидии, артроспоры или хламидоспоры — все это покоящиеся клетки, специально адаптированные к длительному пребыванию без воды.
В природе микроорганизмы часто оказываются в условиях недостаточной влажности — в сухой почве, на высушенных растениях, а в зимний период микробные клетки теряют часть воды в результате замораживания. Высушивание используют для консервирования кормов (сена, соломы), овощей, фруктов, лекарственных трав.
Гидростатическое давление как фактор окружающей среды также влияет на жизнедеятельность микроорганизмов. Чувствительность бактерий к нему неодинакова. Бактерии, устойчивые к высокому давлению, называют барофильными (от греч. baros — тяжесть). Они существуют при давлении в 105 Па (выделены из образцов, взятых со дна океанов, с глубины 5 тыс. м); споры бацилл сохраняются при давлении 2Ч106 Па. Режим повышенного давления (103–106 Па) в сочетании с высокой температурой (120°С) используют в автоклавах в целях обезвреживания (стерилизации) материалов, содержащих возбудителей инфекционных болезней.
Большое влияние на рост микроорганизмов оказывает осмотическое давление среды, определяемое концентрацией растворенных в ней веществ. Оно выполняет важную функцию в метаболизме микробной клетки. Внутри бактерий осмотическое давление соответствует давлению 10–20%-ного раствора сахарозы. В среде с более высоким осмотическим давлением наступает плазмолиз (потеря воды и гибель клетки), а в среде с низким осмотическим давлением — плазмоптиз (вода поступает внутрь клетки, и клеточная стенка может разорваться). Явления плазмолиза и плазмоптиза используют в промышленности и в быту при консервировании продуктов (огурцы, помидоры, капуста и др.).
Осмотическое давление клетки у грамположительных бактерий составляет 3Ч106 Па, у грамотрицательных — 4Ч105–8Ч105 Па.
Следовательно, в растворах с высоким осмотическим давлением (около 9Ч106–107 Па — 15–20%-ный раствор NaCl) созданы
условия, препятствующие росту бактерий и ряда других организмов. Микроорганизмы, которые могут активно размножаться при высоком осмотическом давлении, называются осмофильные или галофилы (любящие соль). Их ферменты активны только при повышенном содержании хлорида натрия, ионы натрия необходимы галофилам для усвоения из окружающей среды питательных веществ. Некоторые галофилы размножаются при высокой 20–30%-ной концентрации хлорида натрия (роды Halobacterium, Micrococcus, Sarcina), например, в солончаковых почвах, рассолах для соления рыбы, мяса (обычно вызывают порчу этих продуктов).
В настоящее время в микробиологии возникло новое направление — баробиология, изучающее роль гидростатического
давления как экологического фактора, оказывающего влияние на распространение и активность микроорганизмов в глубине морей и океанов.
Различные виды излучения. Степень бактерицидного дей- ствия излучения на микробы зависит от вида лучевого излуче- ния, дозы и длительности экспозиции.
Действие видимого излучения (света). Видимый, рассеян- ный свет (длина волн 300–1000 нм) угнетает жизнедеятельность микроорганизмов, но в более слабой степени, чем прямые сол- нечные лучи. В связи с этим культивирование микроорганиз- мов на искусственных питательных средах осуществляют в тем- ноте, в термостатах, где поддерживается оптимальная для раз- множения микробов температура. Видимый свет положительно влияет только на пигментообразующие бактерии, которые ис- пользуют световую энергию для фотосинтеза и при этом актив- но образуют пигмент — микробная культура окрашивается в красный, зеленый и другие цвета.
Микроорганизмы, не образующие пигменты, можно сделать чувствительными к искусственному свету, если окрасить их метиленовой синью, эозином и др. Это явление названо фотосенсибилизацией, а действие — фотодинамическим.
Прямые солнечные лучи убивают все микроорганизмы, кро- ме пурпурных и зеленых серобактерий, развитию последних солнечный свет благоприятствует. Свет напрямую не разруша- ет бактериальную клетку, как химические вещества. Бактерицидное действие света связано с образованием гидроксильных радикалов и других высокореактивных веществ, действующих губительно на микробную клетку. В ряде исследований при об- лучении микробов отмечена инактивация ферментов.
Микробы-сапрофиты более устойчивы к воздействию све- та, чем патогенные. Это объясняется тем, что они, чаще под- вергаясь действию прямых солнечных лучей, становятся более адаптированными к ним. Патогенные же микроорганизмы весь- ма чувствительны к действию света. Так, под действием пря- мых солнечных лучей культуры пастерелл гибнут через 7– 12 мин, а возбудители туберкулеза — через 45–50 мин.
Гигиеническое значение воздействия солнечного света ог- ромно, оно представляет собой один из факторов самоочище- ния воздуха, рек и верхних слоев почвы.
Ультрафиолетовое излучение (УФИ) с длиной волн 400– 300 нм является химически активным, 330–295 нм — биологически активным, а 295–200 нм — бактерицидно активным. Механизм действия УФИ заключается в том, что в цепях ДНК между остатками тимина образуются ковалентные связи, что приводит к частичному или полному подавлению репликации ДНК, а также повреждению рибонуклеиновых кислот (особенно мРНК).
При облучении микроорганизмов УФИ с длиной волны 320– 400 нм возможна фотореактивация, т. е. восстановление жизнеспособности микроорганизмов.
УФИ широко применяют для санации воздуха в животноводческих помещениях, в лабораториях и промышленных цехах (бродильная промышленность, производство антибиотиков), в боксах для создания асептических условий. Для дезинфекции воздуха предназначены лампы низкого давления, типа БУВ-15, БУВ-30, БУВ-30П, БУВ-60П и ДБ-60. На основе использования ультрафиолетовых и инфракрасных ламп для животноводческой практики применяют установку ИКУФ-1. Промышленностью выпускаются также бактерицидные облучатели с одной или двумя лампами БУВ-30 или БУВ-60П, последние широко применяются в животноводстве и птицеводстве для дезинфекции воздуха помещений.
Ионизирующее излучение. Рентгеновское излучение — электромагнитное излучение с длиной волны 0,006–10 нм, гаммаизлучение (g) — коротковолновое излучение, бета-излучение (b) или катодное излучение (высокоскоростные электроны), альфаизлучение (a) или высокоскоростные ядра гелия и нейтроны оказывают слабое инактивирующее действие на микроорганизмы. Бактерицидность наиболее сильнодействующего g-излучения слабее, чем УФИ, — гибель бактерий наступает только при облучении высокими дозами от 44 до 280 тыс. рентген. Бактерии обнаружены в воде атомных реакторов, где величина радиоактивного облучения достигает 2–3 млн рентген. Микроорганизмы, находящиеся на расстоянии 3–5 см от источника облучения (кобальтовая пушка — свинцовый шар, внутри которого помещен Со60), погибают через 5–6 ч, на расстоянии 10 см — через 48 ч.
Механизм действия рентгеновского излучения заключается в поражении ядерных структур, в частности нуклеиновых
кислот цитоплазмы, т. е. поражается генетический аппарат микробной клетки, что приводит к ее гибели или мутации. Неблагоприятное воздействие ионизирующих излучений усиливается в присутствии кислорода.
Ионизирующую радиацию как метод холодной стерилизации применяют для уничтожения микробов на инструментах, в перевязочном материале, биопрепаратах (при этом не снижается их качество, так как не происходит денатурации составных ингредиентов, как при тепловой стерилизации).
Лазерное излучение используют в основном для уничтожения пигментообразующих бактерий (синегнойная палочка и др.). Под его влиянием все биологические объекты претерпевают необратимые изменения (денатурация белка и др.), поскольку при энергии излучения в 1 Дж и размере светового пучка 1,5 мм в точке фокуса излучения на глубине 100 мкм создается температура 60°С. Бактерии погибают при следующем режиме: длина волны — 694,3 нм, энергия — 200 Дж и длительность облучения — 10–3 с.
Электричество. Ток малой и высокой частоты убивает микроорганизмы. Особенно сильное бактерицидное действие оказывают токи ультравысокой частоты. Они приводят в колебание молекулы всех элементов клетки, вследствие чего происходит быстрое и равномерное нагревание всей массы независимо от температуры окружающей среды. Установлено, что длительное воздействие токов высокой частоты приводит к электрофорезу некоторых компонентов среды. Соединения, образующиеся при этом, инактивируют микробную клетку.
Ультразвук (волны с частотой около 20 тыс. Гц) используют для стерилизации пищевых продуктов и дезинфекции предметов. Механизм его бактерицидного действия заключается в том, что в цитоплазме микроорганизмов, находящихся в жидкой среде (вода, молоко), образуется кавитационная полость, которая заполняется парами жидкости, в пузырьке возникает давление в 106 Па, что приводит к дезинтеграции цитоплазматических структур. Возможно, что в образующихся кавитационных полостях озвученной среды возникают высокореактивные гидроксильные радикалы, которые парализуют жизнедеятельность микроба.
Аэроионизация. Аэроионы, несущие положительный или отрицательный заряд, возникают в результате искусственной
или естественной ионизации воздуха. Более сильное влияние на бактерии оказывают отрицательно заряженные ионы, действуя уже в средних концентрациях (5Ч104 в 1 см3 воздуха). Положительные аэроионы задерживают рост бактерий лишь в больших концентрациях (106). Сила действия ионов зависит от дозы — числа аэроионов на 1 см3 воздуха, длительности экспозиции, расстояния от источника ионов. Аэроионизацию используют для обезвреживания цехов предприятий, жилых помещений, а также в медицинской и ветеринарной практике.
Химические факторы. Химические вещества могут тормозить или полностью подавлять рост микроорганизмов. Если химическое вещество подавляет рост бактерий, но после устранения его воздействия их рост возобновляется, то это явление называют бактериостаз (бактериостатическое действие), т. е. происходит задержка роста микроба, а не его гибель.
При бактерицидном действии химический агент вызывает гибель клеток. Бактерицидное действие химических веществ имеет огромное значение, и его учитывают при использовании химического вещества в качестве дезинфектанта. Эффективность дезинфицирующих средств зависит от многих факторов: биологических особенностей микроорганизмов, концентрации раствора, экспозиции, температуры и окружающей среды.
Противомикробные вещества по химическому строению и механизму бактерицидного действия можно подразделить на следующие группы: окислители, галогены, соединения металлов, кислоты и щелочи, поверхностно-активные вещества, спирты, красители, производные фенола и формальдегида.
Окислители. К этой группе принадлежат перекись водорода и перманганат калия. Данные соединения, выделяя активный атомарный кислород, вызывают цепную реакцию свободно-радикального перекисного окисления липидов, что ведет к деструкции мембран и белков микроорганизмов.
Галогены — это хлор, йод и их препараты: хлорная известь, хлорамин Б, 5%-ный спиртовой раствор йода, йодинол, йодоформ. Их бактерицидное действие связано со способностью отщеплять активные галогены — хлор и йод, которые, замещая водородные атомы у атомов азота, денатурируют белки цитоплазмы микроорганизмов, а также, выделяя атомарный кислород, оказывают значительное окисляющее действие.
Соединения тяжелых металлов — это соли свинца, меди, цинка, серебра, ртути, металлоорганические соединения серебра — протаргол, колларгол. Они оказывают противомикробное действие. В зависимости от концентрации и свойств катиона они вызывают местный вяжущий, раздражающий и прожигающий эффекты на ткани микроорганизма.
Антимикробное действие соединений тяжелых металлов обусловлено ослаблением активности ферментов, содержащих сульфгидрильные группы, а также образованием с белками альбуминатов: R – СООН + AgN03 ® R – COOAg + HNО3. Посеребренные предметы, песок при контакте с водой придают ей бактерицидные свойства по отношению ко многим видам бактерий.
Механизм бактерицидного действия заключается в адсорбации положительно заряженных ионов металла на отрицательно заряженной поверхности бактерий и изменении проницаемости их цитоплазматической мембраны, в результате чего происходит гибель микробной клетки.
Кислоты и щелочи. В основе бактерицидного действия кислот и щелочей лежат дегидратация микроорганизмов, изменение рН питательной среды, гидролиз коллоидных систем и образование кислотных и щелочных альбуминатов.
Кислоты в концентрированных растворах коагулируют белки микробной клетки, изменяют концентрацию Н-ионов в растворах и оказывают окисляющее действие. На практике их применяют для уничтожения микробов на объектах окружающей среды (серная, соляная, уксусная кислоты), создания определенной величины рН в питательных средах (соляная кислота), при изготовлении и консервировании пищевых продуктов (уксусная, лимонная), так как кислая реакция среды (кислотность) неблагоприятна для развития гнилостных микроорганизмов.
Бактерицидность щелочей зависит от диссоциации и концентрации гидроксильных ОН-ионов. Наиболее часто в ветеринарной практике применяют NaOH (гидроксид натрия) и KОН (гидроксид калия), гашеную известь (гидроксид кальция), натрия карбонат (Na2CО3), натрия гидрокарбонат (сода). Бактерицидное действие проявляется при сравнительно невысокой концентрации щелочей, так, гибель вегетативных форм микроорганизмов наступает под влиянием 2–3%-ного, спор бацилл — 4–5%-ного растворов.
Поверхностно-активные вещества. Катионные детерген ты (церигель, дегмицид, этоний, декаметоксин и роккал) пред ставляют собой соединения четвертичных аммонийных осно ваний, содержащих радикалы с длинной цепью углеродных атомов. Анионные детергенты нарушают проницаемость и ос мотическое равновесие микробной клетки, что и приводит к ее гибели. К ним относится зеленое мыло.
Спирты. Практический интерес из этой группы соедине ний представляет спирт этиловый (С2Н5ОН). Антимикробная активность его обусловлена способностью отнимать воду и свер тывать белок. Бактерицидное действие оказывает уже 20% ная концентрация спирта, но наиболее эффективен 70% ный спирт. Более высокие концентрации спирта (80–90%) в белковой сре де образуют плотные белковые сгустки, внутри которых могут сохраняться живые бактерии.
Бактерицидность спиртов зависит от их молекулярной мас сы по мере ее возрастания: метиловый ® этиловый ® пропи ловый ® бутиловый ® амиловый и т. д.
Красители. Обладают свойствами подавлять рост бактерий. Они действуют медленно, но более избирательно. К ним отно сятся бриллиантовый зеленый, этакридина лактат, флавакри дина гидрохлорид, метиленовый синий и др. Бриллиантовый зеленый, соединяясь с белком, липидами или мукополисаха ридами бактериальной клетки, приводит к ее гибели. Акридин блокирует у бактерий жизненно необходимые для обмена ани онные группы катионами акридина. Метиленовый синий, вы полняя роль акцептора и донора ионов водорода, изменяет те чение окислительно восстановительных реакций и нарушает жизнеспособность микробной клетки. Эти средства особенно эффективны при кокковых инфекциях.
Фенол, крезол и их производные. Эффективность действия препаратов этой группы обусловлена их способностью легко про никать через фосфолипиды клеточных мембран, денатурировать белок цитоплазмы и подавлять функцию кофермента (дифосфо пиридин нуклеотида), участвующего в дегидрировании глюко зы и молочной кислоты, что сопровождается глубокими нару шениями метаболизма и гибелью патогенных микробов. Белок не препятствует противомикробной активности фенола, что дает ему преимущество перед другими дезинфектантами.
Формальдегид (бесцветный газ). В практике применяют 40%-ный водный раствор формальдегида (формалин). Растворенный в воде формальдегид губительно влияет на вегетативные и споровые формы бактерий, вызывает дегидратацию поверхностных слоев, легко проникает в бактериальную клетку, вступает в связь с аминогруппами белков, денатурирует их.
Химические вещества (хлор и хлорсодержащие вещества, гидроксид натрия, фенолы, формальдегид) широко используют для дезинфекции и химической стерилизации. Дезинфекция — уничтожение только патогенных микроорганизмов в окружающей среде, а не всех микробов вообще, находящихся на объекте. Качество дезинфекции оценивают бактериологическим методом. В качестве тест-микробов используют кишечную палочку (Е. coli) или золотистый стафилококк (Staph. aureus) в зависимости от инфекции, при которой проводится дезинфекция.
После дезинфекции берут с помощью ватно-марлевых тампонов пробы смывов с разных поверхностей обработанных объектов, помещают их в раствор нейтрализатора дезсредства, а затем засевают (вносят) на питательные среды. Дезинфекцию считают удовлетворительной при отсутствии роста тест-микробов в питательных средах.
Действие биологических факторов проявляется, прежде всего, в антагонизме микробов, когда продукты жизнедеятельности одних микробов вызывают гибель других. Антагонистические свойства наиболее выражены у актиномицетов, споровых бацилл (Вас. brevis, Вас. subtilis) и др.
Явление антагонизма микроорганизмов было открыто в 1887 г. французским ученым Л. Пастером. Одним из первых, кто на практике применил микробный антагонизм, был И. И. Мечников, который предложил использовать продукты, содержащие молочнокислые бактерии, с целью подавления гнилостной микрофлоры кишечника.
Антибиотики (от греч. anti — против, bios — жизнь) — биологически активные вещества, образуемые в процессе жизнедеятельности грибов, бактерий, животных, растений, а также созданные синтетическим путем, способные избирательно подавлять рост и убивать микроорганизмы, грибы, риккетсии, крупные вирусы, простейшие и отдельные виды гельминтов. Они отнесены к разряду «химиотерапевтических средств» и предназначены для избирательного действия на возбудителей заболеваний, находящихся во внутренних органах и тканях (кровь, лимфа, межтканевая жидкость) больных животных и людей.
Начало учению об антибиотиках было положено в 1929 г., когда английский ученый А. Флеминг доказал, что фильтрат бульонной культуры плесневого гриба Penicillium notatum об" ладает антибактериальными свойствами в отношении стафило" кокков и некоторых других грамположительных микроорга" низмов. Однако извлечь пенициллин из культуральной жидко" сти плесневого гриба удалось лишь в 1940 г. группе английских химиков (Э. Чейн, Г. Флори и Э. Эбрахем). В России пеницил" лин был получен З. В. Ермольевой в 1942 г. Открытие пени" циллина послужило толчком для широких поисков антибио" тических веществ. В настоящее время их насчитывается бо" лее 2 тыс., выделенных из различных источников.
В животноводстве антибиотики применяют с лечебной це" лью, для стимуляции роста и развития животных и птиц.
По происхождению антибиотики можно разделить на пять групп.
1. Антибиотики, образуемые грибами и лишайниками. Гри" бы и лишайники являются продуцентами активных антибиоти" ков. Так, из культуральной жидкости Penicillium notatum выде" лен пенициллин, Cephalosporium acremonium — цефалоспорин, Aspergillus fumigates — фумагиллин, Penicillium urticae — гри" зефульвин, Trichothecium roseum — трихотецин. Лишайники продуцируют усниновую кислоту, обладающую сильным анти" биотическим действием. К натриевой соли усниновой кислоты особенно чувствительны дифтерийные палочки.
2. Антибиотики, образуемые актиномицетами, нашли наи" более широкое применение в практике. Из культуральных жид" костей актиномицетов были выделены многие антибиотики: Streptomyces greseus — стрептомицин, Str. fradiae — неомицин, Str. Canamyceticus — канамицин, Micromonоspora — гентами" цин, Str. Aureofaciens — хлортетрациклин, Str. venezuelae — хлорамфеникол, Str. erythreus — эритромицин, Str. fradiae — тилозин, Str. bevoris — леворин, Str. spheroides — новобиоцин, Str. mediterranei — рифамицин, Str. neursei — нистатин.
3. Антибиотики, выделенные из бактерий. Группа антибио" тиков бактериального происхождения менее обширна и имеет
меньшее практическое значение, так как эффективность их значительно ниже, чем у антибиотиков грибного и актиномицетного происхождения. Продуценты антибиотиков —разнообразные бактерии. В большинстве своем это сапрофиты, обитающие в почве и обладающие ярко выраженной антимикробной активностью. К ним относятся грамицидин, колицин, пиоционин, субтилин, полимиксин и др. Некоторые из этих антибиотиков токсичны при парентеральном введении, поэтому их применяют местно.
4. Антибиотики животного происхождения. Биологически активные вещества, образуемые животными тканями, обладают не только антибиотическим действием, но и активизируют защитные силы макроорганизма, что позволяет применять их для профилактики и лечения ряда заболеваний. К ним относятся эритрин, выделяемый из эритроцитов различных животных; экмолин, полученный из тканей рыб; лизоцим — полисахарид, полученный из яичного белка. Клетки некоторых тканей продуцируют интерферон, угнетающий жизнедеятельность многих возбудителей вирусных инфекций.
5. Антибиотики растительного происхождения. Многие растения выделяют летучие и нелетучие биологически активные вещества — фитонциды, способные обеспечить устойчивость растений к различным болезням. Фитонциды были открыты Б. П. Токиным в 1928 г. Наибольшими антибиотическими свойствами обладают фитонциды лука, чеснока, хрена, горчицы, алоэ, плодов можжевельника, почек березы, листьев черемухи, листьев эвкалипта и некоторых других растений. Они инактивируют ряд жизненно важных ферментов и подавляют жизнедеятельность сарцин, стафилококков, стрептококков, кишечной палочки, протея и других микроорганизмов.
Некоторые фитонциды выделены в чистом виде: аллицин — из чеснока (Allium sativum), подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий; рафанин — из семян редиса (Raphanus sativus), действует на грамположительные и грамотрицательные бактерии в разведении 1:100; иманин — из зверобоя пронзеннолистного (Hypericum perforatum), применяют при лечении инфицированных ран и тяжелых ожогов.
Под влиянием некоторых фитопатогенных грибов ткани пшеницы, ржи, кукурузы образуют антибиотические вещества — фитоалексины, обладающие антибиотическим действием
по отношению к фитопатогенным грибам. Так, клетки гороха (Pasum sativum) продуцируют пизатин, клетки фасоли (Phaseolus vulgaris) — фазеолин.
В настоящее время широко применяются высокоэффектив- ные антибиотики, полученные биосинтетическим путем. Одна- ко некоторые особенности химического строения антибиотиков ограничивают их терапевтический эффект. Поэтому путем на- правленного синтеза созданы полусинтетические препараты, которые, сохраняя основные преимущества известных антибио- тиков, приобрели новые дополнительные свойства: изменение физико-химических констант, устойчивость к действию фер- ментов, продуцируемых резистентными штаммами микроорга- низмов, расширение спектра действия.
Единицы измерения противомикробной активности антибиотиков. Биологическая активность антибиотиков основана на подавлении роста чувствительного тест-микроба (золотистого стафилококка №209 для пенициллина, Вас. subtilis, E. coli для стрептомицина). Для этой цели используют метод диффузии в плотные питательные среды (метод бумажных дисков) или в жидких средах (метод серийных разведений). Противомикроб- ная активность измеряется тем наименьшим количеством ан- тибиотика, которое оказывает противомикробное действие, и выражается либо в единицах действия — ЕД, либо в единицах массы. Так, за единицу пенициллина принимают 0,6 мкг чис- той кристаллической соли, за единицу стрептомицина — 1 мкг чистого сухого препарата и т. д.
Антибиотики обладают характерными свойствами — четко выраженной избирательностью и специфическим механизмом противомикробного действия. Каждый антибиотик имеет оп- ределенный антимикробный спектр действия: одни действуют на немногие виды микроорганизмов (пенициллин, грамицидин), а другие имеют широкий спектр антимикробного действия (ле- вомицетин, тетрациклин, полимиксин, гентамицин и др.).
Антибиотики близкого химического строения обычно име- ют сходный антимикробный спектр и механизм действия. По механизму действия на микроорганизмы их разделяют на не- сколько основных групп.
1. Антибиотики, ингибирующие синтез бактериальной стен- ки (пенициллины, цефалоспорины, бацитрацин, ванкомицин).
2. Антибиотики, нарушающие функцию цитоплазматической мембраны (полипептиды, полиены, грамицидин).
3. Антибиотики, разрушающие рибосомальные субчастицы и сдерживающие синтез белка (тетрациклины, хлормицетины, амино-гликозиды, макролиды).
4. Антибиотики, избирательно подавляющие синтез нуклеиновых кислот:
- ингибиторы синтеза РНК (актиномицин, гризеофульвин,
канамицин, неомицин, новобиоцин и др.);
- ингибиторы синтеза ДНК (брунеомицин, саркомицин).
Антибиотик лишь воздействует на возбудителя заболевания, окончательная ликвидация инфекционного процесса происходит в результате мобилизации защитных механизмов макроорганизма.
Учитывая, что в основе лечения с применением антибиотиков лежит сложная иммунобиологическая реакция, важно знать их иммунодепрессивные свойства. Прежде чем назначать тот или иной антибиотик, ветеринарный специалист должен знать его свойства, способ введения, спектр и механизм противомикробного действия, срок циркуляции в организме животного и пути выведения из него, а также показания к применению. При несоблюдении этих правил могут возникнуть тяжелые последствия — токсикозы, морфофункциональные изменения в желудочно-кишечном тракте, нейротоксическое, нефротоксическое и гепатотоксическое действия, угнетение функции эндокринной и кроветворной систем.
Не следует слишком увлекаться антибиотикотерапией, так как продолжительный прием этих препаратов может вызвать развитие суперинфекций — болезней, связанных с нарушением нормальных взаимоотношений между обитателями живого организма. В таких случаях угнетается не только возбудитель инфекции, но и нормальная микрофлора организма. Одновременно начинает размножаться нечувствительная к антибиотику микрофлора, вызывая дисбактериоз, кандидозы, сопровождающиеся гастроэнтеритами, колитами и др.
Устойчивость микробов к антибиотикам. Целый ряд микробов под влиянием антибиотиков, особенно при неправильном их применении, утрачивает чувствительность к ним и образует антибиотикорезистентные формы. Устойчивость к антибиотикам
возникает в результате нарушения трансляции генетической информации и изменения синтеза полипептидной цепи, пониженной проницаемости цитоплазматической мембраны и клеточной стенки, образования ферментов, инактивирующих антибиотики.
У таких микробов снижается физиологическая роль мишени, активизируется синтез фермента, способного инактивировать антибиотик, и изменяется антигенная структура, что приводит к усилению их вирулентности (например, стафилококки). В таких случаях применение антибиотиков с лечебной целью становится бессмысленным.
С целью предотвращения возникновения антибиотикоустойчивых микробов при лечении животных необходимо комбинировать антибиотики или использовать их в сочетании с другими химиотерапевтическими средствами (сульфаниламиды, нитрофураны, производные оксихинолина) и применять препараты, повышающие иммунологическую реактивность организма.
Бактериофаги называют вирусами бактерий. Данное явление изучали Н. Ф. Гамалея (1898), Ф. Творт (1915), Ф. Д’Эрелль (1917). В результате исследований было принято решение называть агента, разрушающего бактерии, — бактериофагом (от греч. phagos — пожирающий). Бактериофаг способен инфицировать бактериальную клетку, репродуцироваться в ней, образуя многочисленное потомство, и вызывать ее лизис, сопровождающийся выходом фаговых частиц в среду обитания бактерий.
Бактериофаги широко распространены в почве, воде, экскрементах больных и здоровых животных, человека. Они обнаружены более чем у 100 видов бактерий (С. Я. Гайдамович, 1982).
Бактериофаги поражают бактерии определенной группы. Хозяевами бактериофагов являются многие микробы, в частности эшерихии и сальмонеллы, стафилококки и стрептококки, микобактерии, листерии, коринебактерии и другие микроорганизмы. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой обусловлено следующими факторами: § наличием рецепторов, на которых может фиксироваться фаг; § наличием в клеточной оболочке и цитоплазме ферментов,
способствующих проникновению нуклеиновой кислоты —
вещества, из которого строятся гены;
- наличием в клетке ферментов, материалов и энергетических
ресурсов, обеспечивающих синтез компонентов фага и формирование частиц фага (вирионов).
В зависимости от этого процесс взаимодействия фага с клеткой протекает по типу продуктивной инфекции, или лизогении. Различают вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги при проникновении в клетку бактерий размножаются в ней и вызывают лизис. Умеренные фаги не вызывают лизиса, а остаются в состоянии лизогении.
По степени специфичности фаги разделяют на три группы: полифаги лизируют родственные бактерии, монофаги — бактерии одного вида, фаговары — определенные варианты данного вида бактерий.
Процесс взаимодействия фага с клеткой состоит из последовательной смены отдельных стадий.
Первая стадия — адсорбция фага и прикрепление его при помощи отростков белкового хвоста к клеточной стенке бактериальной клетки на специфических рецепторных участках (белковые и липидные). Фаг узнает их концевыми нитями своих отростков и прочно прикрепляется.
Вторая стадия — проникновение. После адсорбции ДНК фага через дистальный конец отростка продвигается сквозь рыхлые слои клеточной стенки, которые разрушаются под действием фагового лизоцима.
Третья стадия — биосинтез фаговой нуклеиновой кислоты РНК и белков капсида, которые участвуют в биосинтезе ДНК фага. Латентный (скрытый) период, который длится около 15 мин.
Четвертая стадия — морфогенез фага. Данный процесс заключается в заполнении фаговой нуклеиновой кислотой пустотелых фаговых капсид и формировании зрелых вирионов (частиц фага).
Пятая стадия — выход вирусных (фаговых) частиц из разрушенной бактериальной клетки за счет фагового лизоцима, накапливающегося в процессе репродукции фага. Количество зрелых вирионов у разных клеток различно — от единиц до нескольких тысяч. Вирионы высвобождаются и вновь внедряются в новые незараженные бактерии. Процесс повторяется вновь.
При контакте умеренного бактериофага с микробной клеткой она не лизируется и становится носителем бактериофага.
Это явление получило название лизогении, а бактериальные культуры, обладающие этим свойством, называют лизогенны ми. Различают монолизогенность и полилизогенность.
Бактериальная культура, образующая один вид фага, назы! вается монолизогенной. Бактериальная культура, имеющая не! сколько видов фагов, называется полилизогенной. Фаг, способ! ный лизогенировать клетку!хозяина, называется умеренным. При лизогении бактериофаг находится в состоянии профага, при котором бактериальная клетка не погибает. Профаг представля! ет собой геном вируса, ассоциированный с бактериальной хро! мосомой. Профаг, в отличие от генома вирулентного фага, вос! производится как часть бактериальной ДНК и синхронно с ней реплицируется. Сохранение умеренных фагов в форме профагов широко распространено у сальмонелл (В. Я. Ганюшкин, 1988).
Изменение свойств бактериальной культуры под влиянием фага получило название конверсии. Данный феномен заключа! ется в приобретении лизогенными бактериями способности про! дуцировать токсины, изменять морфологию бактерий или их антигенные свойства. Наиболее изучена фаговая конверсия при образовании соматических антигенов у штаммов Salmonella, принадлежащих к группе Е (В. Я. Ганюшкин, 1988).
Методы выделения и титрования фагов. Субстратом для выделения фагов обычно служат испражнения животных, гной ран, сточные воды, молоко, старые культуры. Суспензии фильт! руют через мелкопористые фильтры. Затем его вносят в соот! ветствующие молодые культуры бактерий. При наличии фага в испытуемом материале бактерии растворяются, жидкость про! светляется, а на поверхности агара на месте нанесения фильт! ратов образуются «стерильные пятна».
Бактериофаг проверяют на чистоту, специфичность, а так! же определяют его титр. Титром бактериофага называется то наибольшее разведение, которое способно вызвать лизис куль! туры соответствующих бактерий.
Применение бактериофага. В связи с высоким специфиче! ским действием бактериофаги нашли широкое и разнообразное применение в ветеринарной практике. Их используют для те! рапии и профилактики целого ряда инфекционных болезней (гнойные инфекции, сальмонеллез и колибактериоз молодня! ка сельскохозяйственных животных, пуллороз цыплят и др.).
В микробиологической практике бактериофаги используют для дифференциации бактериальных культур (сибиреязвенных, стафилококковых, рожистых, сальмонеллезных и др.). С помо! щью фага возможна индикация патогенных бактерий в окру! жающей среде (в воде, выделениях животных, пищевых про! дуктах) с помощью реакции нарастания титра фага.
Биологическая промышленность выпускает лечебные био! препараты из фагов в жидкой форме против сальмонеллеза и колибактериоза телят, сибирской язвы и др.