ТЕМА 1

Задачи бактериологической лаборатории,

техника безопасности при работе

с микроорганизмами. Правила взятия,

консервирования и транспортировки

патологического материала. Световой

микроскоп, особенности микроскопирования

при использовании иммерсионной системы.

Основные формы бактерий

Цель занятия: ознакомить студентов с устройством бакте

риологической лаборатории кафедры, ее оборудованием и с правилами техники безопасности; представить общую схему проведения бактериологической диагностики; дать возможность изучить устройство светового микроскопа и освоить методику микроскопии готовых окрашенных препаратов с применением иммерсионной системы; ознакомиться с основными формами бактерий.

Материальное обеспечение: комплект микроскопов, люми

несцентные лампы для освещения, иммерсионное масло, папки с набором готовых окрашенных препаратов, приготовленных из микроорганизмов, имеющих различную морфологию, таблицы: «Ход лучей в сухой и иммерсионной системе», «Основные формы бактерий».

Оборудование микробиологической лаборатории.

1. Микроскопы — оптические, люминесцентные, осветительные приборы.

2. Термостаты, в которых автоматически поддерживается температура, оптимальная для выращивания микроорганизмов в диапазоне от 28 до 43°С.

3. Электрический сушильный шкаф и автоклав, предназначенные для стерилизации лабораторной посуды, питательных сред и спецодежды.

4. Холодильники и морозильные камеры, используемые для хранения питательных сред, музейных бактериальных культур, биопрепаратов, а также исследуемого материала.

5. Центрифуги, предназначенные для осаждения микроорганизмов, эритроцитов, для отделения прозрачного экстракта из исследуемого продукта.

6. Дистиллятор, необходимый для получения дистиллированной воды, на которой готовят физиологический раствор, питательные среды, рабочие растворы красок; автоматические водяные бани, аналитические и торзионные весы, колба Бунзена с вмонтированным фильтром Зейтца, керамические фильтры Шамберляна, Беркефельда и вакуумный насос.

7. Лабораторная посуда: колбы, бактериологические, серологические и уленгутовские пробирки, чашки Петри, автоматические пипетки, стеклянные градуированные и пастеровские пипетки, мерные цилиндры. Мелкие металлические инструменты: бактериологические петли, пинцеты, скальпели, ножницы.

Техника безопасности в микробиологической лаборатории.

1. Заходить в лабораторию и работать там можно только в спецодежде.

2. В лабораторию нельзя вносить посторонние вещи и продукты питания.

3. За каждым студентом закрепляется рабочее место и микроскоп.

4. Без разрешения преподавателя нельзя включать электроприборы.

5. Студент должен поставить в известность преподавателя при загрязнении предметов окружающей среды инфицированным материалом для проведения немедленной дезинфекции.

6. После окончания работы весь исследуемый материал, а также использованные бактериальные культуры, инструменты необходимо поместить в контейнеры и отдать преподавателю для стерилизации в автоклаве.

7. Уходя из лаборатории, необходимо снять спецодежду, тщательно вымыть руки, в случае надобности обработать их дезраствором.

8. Каждый студент должен расписаться в специальном журнале о знании правил техники безопасности при работе с микроорганизмами.

Принципы организации и оборудование бактериологических лабораторий.

В бактериологических лабораториях проводят исследование патологического материала с целью диагностики инфекционных болезней на туберкулез, бруцеллез, сибирскую язву, рожу свиней и др.

В каждой лаборатории должны быть предусмотрены:

1) боксы для работы с отдельными группами бактерий или вирусов;

2) помещения для серологических исследований, приготовления питательных сред, стерилизации и мойки посуды; виварий с отдельными боксами для здоровых и подопытных животных.

В бактериологической лаборатории должено быть оборудовано место для окраски микроскопических препаратов с набором анилиновых красителей, реактивов, спиртовок, сливных чаш, фильтровальной бумаги, банок с дезинфицирующим раствором и т. д.

Правила взятия, консервирования и транспортировки патологического материала.

При отборе и обработке патологического материала для пересылки в лабораторию необходимо придерживаться следующих правил:

• учитывать патогенез болезни и тропизм возбудителя;
• использовать стерильные инструменты и посуду;
• доставлять его в максимально сжатые сроки;
• отбирать материал до начала лечения антимикробными препаратами.

В лабораторию могут быть направлены:

• для прижизненной диагностики: кровь, сыворотка крови,

кал, моча, молоко, экссудаты, гной, соскобы с кожи и др.;

• для посмертной диагностики: паренхиматозные органы,

лимфоузлы, мышцы, сердце целиком с кровью, головной

мозг, трубчатая кость, абортированный плод и др.;

• пробы из объектов внешней среды: воды, почвы, фуража;

клещи, насекомые, грызуны и др.

Трупы мелких животных, а также поросят, ягнят, телят лучше посылать целиком во влагонепроницаемой таре.

Трубчатые кости, посылаемые на исследование, должны быть целыми, с неповрежденными концами, обернутыми в марлю или полотно, смоченное дезинфицирующей жидкостью (5%-ным раствором карболовой кислоты).

Кровь берут в пробирки или колбы из яремной вены с со- блюдением стерильности. Кал берут из прямой кишки стеклян- ной трубочкой с оплавленными краями, один конец трубочки закрывают ватно-марлевой пробкой. После взятия кала трубку опускают в пробирку с физиологическим раствором. Мочу у животных берут с помощью катетера.

Перед отбором молока сосок вымени дезинфицируют 70%- ным спиртом, сдаивают 100–150 мл молока в банку с дезрас- твором, а последующие порции в количестве 30 мл — в стериль- ные сосуды.

Соскобы со слизистых оболочек и кожи берут стерильным скальпелем в стерильную посуду с пробкой. Абортированный плод первой половины беременности направляют целиком. От плодов второй половины беременности берут паренхиматозные органы или плод направляют целиком.

Кусочки селезенки, почек, печени с желчным пузырем бе- рут, используя стерильные инструменты и стерильную посуду.

Желудок и кишечник перевязывают лигатурой с обоих кон- цов и помещают в отдельную посуду. Мозг для исследования направляют целиком.

При упаковке патологического материала необходимо ис- ключить загрязнение его посторонней микрофлорой из внеш- ней среды.

Патологический материал должен быть доставлен в лабо- раторию в течение первых 24 ч после его взятия. Если эти усло- вия трудно выполнить, то материал необходимо консервиро- вать 30%-ным водным раствором глицерина или 10%-ным вод- ным раствором хлористого натрия или раствором глицерина с хлористым натрием (глицерина — 250 мл; хлористого натрия — 5 г; дистиллированной воды — 750 мл).

Доставка патологического материала в лабораторию осуще- ствляется нарочным. На взятый патологический материал, на- правляемый в лабораторию, составляется сопроводительное письмо с подробным перечнем направляемого материала, пред- положительный диагноз, адрес и подпись ответственного лица.

Лабораторная диагностика проводится в три этапа.

1. Микроскопические исследования патологического материала позволяют обнаружить наличие в нем возбудителя, изучить его морфологические особенности и тинкториальные свойства.

2. Бактериологические исследования проводят для выделения чистой культуры возбудителя и изучения его культурально-биохимических свойств, а в ряде случаев — антигенной структуры.

3. Биопробу или заражение лабораторных животных проводят для выделения чистой культуры и определения вирулентности выделенного возбудителя.

Проведенные исследования используют при идентифика ции возбудителя (определение вида) и позволяют поставить бактериологический диагноз.

Световой микроскоп, его устройство и правила работы.

Оптические микроскопы позволяют исследовать микроорганизмы в проходящем свете. Такие микроскопы состоят из механической и оптической частей.

Механическая часть включает штатив с предметным столиком и тубус. Предметный столик с помощью винтов может перемещаться в горизонтальной плоскости. Он имеет две клеммы, прижимающие предметное стекло к столику. Тубусодержатель может перемещаться с помощью макро-и микровинта, предназначенных соответственно для грубой и точной фокусировки изучаемого объекта. Микровинт относится к наиболее уязвимым деталям микроскопа, поэтому с ним нужно обращаться особенно осторожно. Полный оборот микровинта поднимает или опускает тубус на 0,1 мм.

В верхней части тубусодержателя находится револьверное устройство, вращающееся вокруг своей оси, в отверстия которого ввинчены объективы. В верхний конец тубуса вставляется окуляр.

Оптическая часть состоит из объективов, окуляров и осветительного аппарата.

Окуляр вставляется в верхний конец тубуса. Он состоит из двух линз в оправе, между которыми помещена диафрагма. На окуляре имеются цифровые обозначения (´7, ´10, ´15), показывающие степень увеличения изображения.

Объективы представляют собой систему оптических линз. Только одна линза — фронтальная — выполняет функцию уве- личения, остальные — корректирующие. На объективах име- ются обозначения, показывающие увеличение, даваемое объ- ективом (´8, ´40 и ´90):

1) ´8 — объектив применяют для наведения света и поиска объекта;

2) ´40 — объектив применяют для изучения строения мик- роскопических грибов, дрожжей и подвижности бактерий в препарате «висячая капля»;

3) ´90 — иммерсионный объектив применяют для изучения бактерий с применением иммерсионного масла.

Объективы, дающие увеличение в 8 и 40 раз, называются сухими, так как при работе с ними между объективом и препа- ратом находится слой воздуха, коэффициент преломления кото- рого равен 1,0, а коэффициент преломления стекла равен 1,52. Данная разница приводит к тому, что часть боковых лучей пре- ломляется и отклоняется, не попадая в объектив, но освещение при этом не ухудшается, так как диаметр линз 8-и 40-кратных объективов достаточно велик.

Иммерсионным называется объектив, при работе с которым между препаратом и объективом помещают каплю иммерсион- ного масла. Иммерсионное масло имеет оптический коэффици- ент преломления (1,51), близкий к коэффициенту преломления стекла, благодаря этому световые лучи, проходя через однород- ную среду, не отклоняются от своего направления, попадают на линзу объектива и создают хорошее освещение.

В рассматриваемом микроскопе 90-кратный объектив яв- ляется иммерсионным, который применяется при изучении бак- терий.

Общее увеличение, которое дает микроскоп, равняется про- изведению степени увеличения объектива на показатель окуля- ра. В учебном процессе удобнее применять 10-кратный окуляр, дающий оптимальный обзор поля зрения. Следовательно, при изучении под 90-кратным иммерсионным объективом и 10-крат- ным окуляром микроорганизмы будут увеличены в 900 раз.

Четкость получаемого изображения зависит от разрешающей способности микроскопа, т. е. способности раздельно рассмат- ривать две близко расположенные точки, расстояние между

которыми равно половине длины световой волны. Рассматриваемый нами микроскоп имеет разрешающую способность около 0,2–0,3 мкм. Из этого следует, что микроорганизмы величиной менее 0,2 мкм в данном микроскопе не видны.

Осветительный аппарат состоит из конденсора, зеркала и ирисовой диафрагмы. Он предназначен для наилучшего освещения объекта. С помощью зеркала лучи света, исходящие от источника света, направляются в конденсор, концентрирующий лучи в своем фокусе. Поверхность зеркала с одной стороны плоская, с другой — вогнутая. При естественном освещении лучше применять вогнутую поверхность, при искусственном освещении (например, с осветителем) — плоскую.

Конденсор с ирисовой диафрагмой представляет собой систему оптических линз и служит для концентрации отраженных зеркалом лучей света. При опускании конденсора при помощи винта вниз поле зрения микроскопа затемняется, при поднятии — освещается. Ирисовая диафрагма помещается под конденсором, служит для регулирования потока света, которое осуществляется с помощью рычажка: расширяет или сужает диаметр отверстия, пропускающего свет к конденсору.

Выпускаются также дополнительные приспособления, которые позволяют максимально использовать все возможности микроскопа и значительно расширяют диапазон применения: фазовоконтрастные приспособления, осветители, окуляр-микрометр и объектив-микрометр для измерения размеров микроорганизмов.

Правила работы со световым микроскопом.

1. Установить наилучшее освещение поля зрения микроскопа, для этого необходимо:

• поставить объектив ´8 на высоте 1 см от уровня предметного столика;
• поднять конденсор до уровня предметного столика;
• направить плоское зеркало в сторону осветителя.

2. Установить препарат на предметном столике, закрепив клеммами.

3. Нанести каплю иммерсионного масла в центр препарата.

4. Заменить объектив ´8 на ´90.

5. Под контролем глаза осторожно опустить объектив ´90 в масло.

6. Наблюдая в окуляр, медленно поднимать объектив микровинтом до появления какого-либо изображения.

7. Установить четкое изображение с помощью микровинта, вращая его на пол-оборота в ту или иную сторону.

После окончания работы необходимо привести микроскоп в порядок:

1) поднять макровинтом тубус микроскопа;

2) убрать препарат;

3) снять салфеткой масло с ´90 объектива и установить ´8 объектив;

4) опустить конденсор;

5) положить салфетку под объектив и опустить тубус микроскопа.

Основные формы бактерий.

Микроорганизмы представляют собой мельчайшие живые организмы, невидимые невооруженным глазом, размеры которых колеблются в широких пределах — от 0,2 до 10 мкм и более (1 мкм составляет 1/1000 долю мм).

Форму и другие особенности бактериальных клеток изучают при помощи микроскопа чаще всего в убитом окрашенном состоянии, реже — в живом в неокрашенном виде.

Форма бактерий — этот первый таксономический признак, который учитывается при идентификации. По форме клеток бактерии подразделяются на шаровидные (кокки), палочковидные и извитые.

Шаровидные бактерии. Кокки имеют форму правильного шара, эллипса, боба и ланцета. В зависимости от взаимного расположения клеток после деления различают: § микрококки (Micrococcus) делятся в разных плоскостях и

после деления клетки разъединяются, располагаются одиночно или беспорядочно. Относятся к сапрофитам, обитают

в почве, воде и воздухе; § стафилококки (Staphylococcus) делятся в трех взаимноперпендикулярных плоскостях, поэтому располагаются гроздьями или беспорядочно. Среди них встречаются патогенные и

условно-патогенные бактерии, такие как Staph. aureus; § диплококки (Diplococcus) образуют попарно соединенные

кокки;

• стрептококки (Streptococcus) — кокки, расположенные в

виде цепочки; среди патогенных встречаются возбудители

мыта лошадей, скарлатины; в молочной промышленности

имеют значение молочнокислые стрептококки, применяю-

щиеся для приготовления кисломолочных продуктов;

• тетракокки (Tetracoccus) делятся в двух взаимноперпен-

дикулярных плоскостях и располагаются по четыре, в боль-

шинстве своем сапрофиты;

• сарцины (Sarcina) — кокки, образующие правильные па-

кеты по 8–16 клеток.

Палочковидные бактерии (Bacterium) — самая большая группа прокариот, которая делится на два вида:

• палочки, не образующие споры (истинные вегетативные

бактерии);

• образующие споры — бациллы (Bacillus). Палочки, у кото-

рых диаметр споры превышает ширину вегетативной клет-

ки, называют клостридиями (Clostridium).

Извитые бактерии делятся на:

• вибрионы — бактерии, тело которых представляет непол-

ный завиток в виде запятой (холерный вибрион);

• спириллы — бактерии, тело которых состоит из нескольких

крупных завитков;

• спирохеты — бактерии, тело которых состоит из множест-

ва плотно уложенных завитков вокруг центральной осевой

нити, невидимых в световой микроскоп (возбудители леп-

тоспироза, сифилиса).

План работы.

1. Ознакомиться с лабораторией кафедры микробиологии и расписаться в журнале о знании правил техники безопасности.

2. Подготовить посуду, консерванты, инструменты и мате- риалы для отбора проб патологического материала.

3. Изучить устройство микроскопа и освоить правила рабо- ты с ним.

4. Изучить микрокартину готовых окрашенных препаратов с применением иммерсионной системы микроскопа. Ознакомить- ся с различными формами бактерий; зарисовать микрокартину.

5. В ходе работы уяснить значение конденсора, диафрагмы и других частей осветительного аппарата, с этой целью провес-

ти микроскопию с опущенным конденсором; с поднятым конденсором; с прикрытой диафрагмой.

6. Освоить правила работы с иммерсионной системой микроскопа. Провести микроскопию окрашенного препарата, применить 90-кратный объектив с иммерсионным маслом и без масла — найти разницу.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Перечислите основные правила техники безопасности при работе в бактериологической лаборатории с исследуемым материалом.

2. Назовите методы исследований, применяемые при микробиологической диагностике инфекционных болезней животных.

3. С какой целью применяется световой микроскоп?

4. В чем заключается разница в ходе лучей в сухой и иммерсионной

системах микроскопа?

5. Назовите основные формы бактерий.