ТЕМА 2

Бактериологические краски.

Методика приготовления препарата

для микроскопии.

Простой метод окрашивания

Цель занятия: ознакомиться с основными анилиновыми

красками, применяемыми в бактериологических лабораториях; овладеть методикой приготовления мазка на предметном стекле и окрашивания его простым методом; научиться дифференцировать основные формы бактерий при микроскопии.

Материальное обеспечение: набор сухих бактериологиче

ских красок в заводской упаковке; набор рабочих растворов красок во флаконах для простого метода окрашивания: метиленовая синь, разведенный фуксин; спиртовки, предметные стекла; микроскопы, иммерсионное масло; бактериологические петли, банки с дезраствором; пробирки с сенным настоем, содержащим Bac. subtilis (непатогенная сенная палочка), и пробирки с непатогенной кишечной палочкой в МПБ; таблицы: «Основные формы бактерий», «Микрофлора зубного налета».

Исследуемым материалом в бактериологии являются:

а) для прижизненной диагностики — кровь, гной, выделения;

б) для посмертной диагностики — кусочки паренхиматозных органов;

в) в санитарной микробиологии — продукты животного происхождения: мясо, молоко, яйца, рыба и т. д.

Все работы ведутся в условиях бокса над пламенем спиртовки, чтобы исключить загрязнение исследуемого материала и окружающей среды. Материал берут в объеме бактериологической петли и наносят на предметное стекло, которое должно

быть чистым и обезжиренным. Капля воды, нанесенная на хорошо обезжиренное стекло, растекается равномерно, на плохо обезжиренном — собирается в капельки.

Бактериологические краски.

Оптическая плотность неокрашенных бактерий незначительно отличается от оптической плотности стекла, поэтому при изучении морфологии бактерий под микроскопом для повышения контрастности их окрашивают анилиновыми красками.

Различают основные и кислые краски. У основных красителей ионом, придающим бактериальной клетке окраску, служит катион, у кислых — анион. Клеточные структуры бактерий, взаимодействующие с красителем, заряжены преимущественно отрицательно и поэтому лучше воспринимают основные красители, к которым относятся: генцианвиолет; кристаллический фиолетовый; красные — основной фуксин, сафранин; метиленовая синь; малахитовый зеленый

Анилиновые краски, применяемые в микробиологии, имеют порошкообразный или кристаллический вид. Они плохо растворяются в воде, поэтому вначале готовят насыщенные спиртовые растворы красок (1:10), из которых затем получают рабочие водные растворы. Для повышения проницаемости красок в клеточную стенку бактерий в некоторые растворы добавляют щелочь, карболовую кислоту (фенол). В бактериологической практике чаще применяют следующие краски: § щелочная метиленовая синь (синька Леффлера); применяется для простого метода окрашивания, она всегда должна

находиться на столе у бактериолога; § карболовый основной фуксин Циля — концентрированная

краска, хранится долгое время; применяется при окрашивании трудно прокрашивающихся бактерий, таких как возбудитель туберкулеза, споры бактерий (краска красного

цвета); § разведенный фуксин (фуксин Пфейффера) — фуксин Циля,

разведенный дистиллированной водой 1:10; применяется

для простого метода окрашивания или как один из компонентов окраски по Граму, краску готовят перед применением и используют в течение одного рабочего дня;

• карболовый генцианвиолет используют как основной краситель при окраске по Граму, в модификации по Синеву

чаще применяют в виде кусочков фильтровальной бумаги,

пропитанных краской и высушенных.

• раствор малахитовой зелени (1%-ный водный), применяемый при окраске бруцелл по Козловскому.

Методика приготовления препарата для микроскопии.

1. Приготовление мазка. Для этого на предметном стекле с обратной стороны карандашом по стеклу обводят круг диаметром 2–3 см. Жидкий исследуемый материал берут петлей и распределяют в области круга, а микробную культуру с поверхности плотной питательной среды снимают бактериальной петлей и растирают на предметном стекле в капле заранее нанесенной воды. Из кусочков паренхиматозных органов делают мазки-отпечатки, для этого местом свежего среза прикасаются к предметному стеклу, делая несколько отпечатков. Обязательное условие — мазок должен быть очень тонким.

2. Высушивание мазка проводится на воздухе, для ускорения процесса можно сушить в теплом потоке высоко над спиртовкой.

3. Фиксация мазка преследует две цели: прикрепить бактерии к предметному стеклу и убить их, так как убитые микробы лучше окрашиваются (а заодно обезопасить бактериолога, так как среди исследуемых бактерий могут быть и патогенные). Фиксацию мазков проводят одним из двух способов:

• физический метод фиксации заключается в медленном трехкратном проведении предметного стекла с мазком через наиболее горячую часть пламени в общей сложности 2–3 с, в

зависимости от толщины стекла (держать мазком вверх);

если при прикосновении стекла к руке ощущается легкий

ожог, значит, цель достигнута — микробы убиты; не следует перегревать мазок, иначе произойдет деформация формы клеток.

• при химическом методе фиксации препарат погружают на

5 мин в метиловый спирт или на 10–15 мин в смесь Никифорова (равные объемы спирта и эфира); этот метод фиксации щадящий, его рекомендуют применять для препаратов,

приготовленных из крови или паренхиматозных органов, а

также из сметаны и сливочного масла, так как эфир обезжиривает препарат.

4. Окраска мазка, которая производится простым или сложным методом.

Простой метод окрашивания.

При данном методе применяется одна краска. Он позволяет установить наличие или отсутствие бактерий в исследуемом материале, а также изучить их морфологию (форму, взаиморасположение).

В качестве исследуемого материала на лабораторном занятии можно использовать взвесь непатогенной культуры кишечной палочки, сенной палочки, находящейся в пробирке с МПБ, или свой зубной налет, взятый спичкой и распределенный на предметном стекле. В микрофлоре зубного налета здорового человека представлены все морфологические группы бактерий, поэтому она является полиморфной: микрококки, стрептококки, стафилококки, извитые и нитевидные формы, молочнокислые палочки, дрожжи и т. д.

Задание студентам: приготовить препарат и окрасить простым методом.

На предметное стекло бактериологической петлей нанести каплю микробной взвеси, распределить очень тонким слоем, высушить на воздухе, зафиксировать и окрасить простым методом.

Методика простого окрашивания заключается в том, что на фиксированный мазок наносят только одну краску — 3–5 капель: § щелочную метиленовую синь на 5 мин; § или разведенный фуксин на 3 мин.

Затем краску смывают водой; препарат высушивают фильтровальной бумагой; наносят одну каплю иммерсионного масла и изучают под микроскопом; микрокартину зарисовать, обратить внимание на разные формы бактерий и обозначить их.

План работы.

1. Приготовить мазок из зубного налета и окрасить простым методом: разведенным фуксином или метиленовой синью.

2. Приготовить мазок из бактериальной культуры и окрасить простым методом: разведенным фуксином или метиленовой синью.

3. Сравнить оба мазка; обратить внимание на разные формы бактерий; зарисовать микрокартину.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Перечислите анилиновые краски, часто применяемые в микробиологии.

2. Что характерно для простого метода окрашивания?

3. Расскажите суть физического и химического методов фиксации

препаратов.

4. С какой целью изучают морфологию бактерий?