ТЕМА 3

Сложные методы окрашивания.

Окраска по Граму

Цель занятия: освоить методику окраски по Граму; свобод

но овладеть методикой приготовления и окрашивания препарата для микроскопии.

Материальное обеспечение: пробирки со смесью взвеси E. coli

и S. aureus в физрастворе для окраски по Граму; набор красок для окрашивания по Граму; микроскопы, иммерсионное масло, спиртовки, предметные стекла, петли; таблицы «Микрофлора зубного налета», «Окраска по Граму».

Сложные методы окрашивания позволяют установить наличие спор, капсул, внутриклеточных включений, а также окрасить кислотоустойчивые бактерии. Различные виды бактерий имеют разный химический состав и отличаются по строению клеточной стенки, поэтому неодинаково воспринимают окрашивание анилиновыми красками. Избирательное отношение микроорганизмов к различным красителям называют тинкториальными свойствами. По тинкториальным свойствам все бактерии разделены на две группы: грамположительные и грамотрицательные.

Методика окрашивания по Граму.

1. На фиксированный мазок накладывают сухой кусочек фильтровальной бумаги (1´1 см), заранее пропитанный раствором генцианвиолета (модификация А. В. Синева), и наносят 3 капли воды на 2 мин. В результате все бактерии окрашиваются одинаково в фиолетовый цвет. Затем фильтровальную бумагу с генцианвиолетом удаляют.

2. Наносят несколько капель раствора Люголя на 2 мин, затем раствор стряхивают. (Значение этого этапа заключается в том, что только с компонентами грамположительных бактерий ионы йода вступают в прочную связь.)

3. В центр мазка наносят 96%-ный этиловый спирт, который через 40–50 с смывают. В течение этого периода предметное стекло лучше держать в руках строго горизонтально. Так как спирт растекается, его наносят несколько раз, в результате грамотрицательные бактерии обесвечиваются.

4. Бактерии дополнительно окрашивают разведенным фуксином. В красный цвет окрашиваются обесцвеченные бактерии уже через 3 мин, затем краску смывают водой.

5. Высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсионным объективом.

Микрокартина: грамположительные бактерии окрашены в фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в розовый цвет.

Суть окрашивания по Граму заключается в том, что компоненты грамположительных бактерий с генцианвиолетом в присутствии ионов йода образуют прочный комплекс, который при действии спиртом не вымывается через узкие поры в толстом слое пептидогликана, поэтому бактерии остаются фиолетовыми. Грамотрицательные бактерии имеют другой химический состав и строение клеточной стенки, поэтому при воздействии этиловым спиртом генцианвиолет вымывается через широкие поры в клеточной стенке, бактерии обесцвечиваются и, принимая цвет дополнительного красителя, становятся красными.

Отношение бактерий к окраске по Граму изучают для определения вида.

Примечание: шаровидные бактерии почти всегда грамположительные; бациллы и клостридии в молодой культуре всегда грамположительные; бактерии семейства Enterobacteriaceae и извитые формы — грамотрицательные.

План работы.

1. Приготовить препарат из смеси S. aureus и E. coli; окрасить по Граму.

2. Приготовить препарат из зубного налета и окрасить по Граму.

3. Провести микроскопию препаратов под иммерсионной системой; изучить разнообразие морфологических форм; зарисовать микрокартину.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Чем объясняются тинкториальные различия грамположительных

и грамотрицательных бактерий?

2. В чем заключается суть окраски по Граму?

3. Что происходит при воздействии 96%-ным этиловым спиртом?

4. С какой целью изучают отношение бактерий к окраске по Граму?

5. Приведите в качестве примера представителей грамположительных бактерий.