ТЕМА 4

Биологическое значение образования спор

и капсул, методы их окрашивания.

Изучение подвижности бактерий

Цель занятия: овладеть методами окрашивания спор и кап

сул; изучить способы исследования бактерий на подвижность и методы приготовления препаратов «висячая или раздавленная капля».

Материальное обеспечение: смыв 2–3-суточной культуры

вакцинного штамма сибирской язвы или сенной палочки; набор красок для окраски по методу Златогорова, предметные стекла, предметные стекла с лункой, покровные стекла, петли, вазелин со спичкой, микроскопы, иммерсионное масло; готовые препараты на капсулы, окрашенные по Ольту или Михину; таблицы: «Методика окраски спор по Златогорову», «Методика окраски капсул. Органы движения бактерий».

Биологическое значение образования спор.

Некоторые виды палочковидных бактерий в неблагоприятных условиях внутри материнской клетки образуют споры (эндоспоры). Неблагоприятными условиями для бактерий являются:

• недостаток влаги и питательных веществ;
• избыток продуктов метаболизма;
• старение бактериальной культуры.

Чаще споры образуют почвенные микроорганизмы, поэтому почва является резервуаром спорообразующих бактерий и источником загрязнения продуктов животного происхождения (Bac. anthracis, Bac. subtilis, Cl. perfringens). У бактерий

в стадии споры прекращаются все физиологические процессы, и она переходит в анабиоз. При изменении условий — появлении пищи и влаги — активизируются ферменты и споры прорастают в вегетативную форму, для которой характерны все физиологические проявления жизни: питание, дыхание и размножение.

Одна бактерия образует только одну спору, т. е. это не размножение, а сохранение вида в неблагоприятных условиях.

Все бактерии, образующие споры, называются бациллы. Палочки, у которых диаметр спор превышает ширину вегетативной клетки, принято называть клостридиями (веретенообразные). Бациллы бесконечно долго сохраняются в почве (возбудитель сибирской язвы), устойчивы при обработке кислотами и щелочами, выдерживают кипячение (возбудители столбняка, ботулизма), имеют плотную оболочку и простым методом не прокрашиваются. Поэтому для окраски спор применяют сложные методы окрашивания, основанные на применении горячих концентрированных красок, при этом споры и вегетативные клетки сначала окрашиваются в один цвет. При последующем обесцвечивании кислотой споры, являясь кислотоустойчивыми, сохраняют цвет первой краски, а вегетативные клетки обесцвечиваются, поэтому их окрашивают дополнительно.

Методика окрашивания спор по Златогорову.

1. Готовится мазок из 2–3-дневной бульонной культуры спорообразующих бактерий (сенная палочка B. subtilis, вакцинный штамм B. anthracis).

2. На фиксированный мазок наносится карболовый фуксин и красится при подогревании над пламенем спиртовки 7–10 мин до появления пара. В красный цвет окрашиваются и споры и вегетативные клетки.

3. Препарат обесцвечивают 2%-ным раствором серной кислоты 1–3 с (за это время должны обесцветиться только вегетативные клетки).

4. Далее препарат обильно промывается водой, чтобы прекратить действие кислоты.

5. Обесцвеченные вегетативные клетки дополнительно окрашиваются метиленовой синью 4–5 мин.

Микрокартина: споры — красные, вегетативные клетки — синие.

Наличие или отсутствие споры изучают для определения вида.

Биологическое значение образования капсул.

Некоторые патогенные бактерии, находясь в организме больного, образуют слизистый слой вокруг клеточной стенки. Данный слой называется капсулой, которая имеет консистен- цию геля. Ее наличие отмечают у возбудителей сибирской язвы, диплококковой септицемии. У вирулентных бактерий, находя- щихся в организме животного, капсула является фактором аг- рессии, так как защищает бактерии от воздействия фагоцитов и специфических антител, поэтому заболевание протекает осо- бенно тяжело.

Во внешней среде капсула защищает почвенные бактерии от высыхания и внедрения бактериофагов.

Среди молочнокислых бактерий имеются штаммы, образую- щие капсулу, благодаря чему продукт приобретает слизистую, тягучую консистенцию, эта особенность обычно отражается в названии штамма. У различных бактерий химический состав капсул различен, что позволяет дифференцировать их друг от друга при идентификации. Так, капсульное вещество сибире- язвенной палочки содержит полипептид D-глутаминовой кис- лоты, а диплококковой септицемии — полисахарид.

Вещество капсулы обычно воспринимает красители слабее, чем другие клеточные структуры, поэтому при специальных методах капсула окрашивается в другой цвет, что позволяет выявить ее наличие.

Методика окраски капсул по методу Ольта.

1. На фиксированный препарат-отпечаток, приготовленный из исследуемого материала, наносится 2%-ный водный раствор сафранина.

2. Далее препарат окрашивают при подогревании в пламе- ни спиртовки 2–3 мин, не допуская кипения красителя.

3. Краска смывается водой.

Микрокартина: капсула — желтая, тело бактерий — кир- пично-красное.

Исследование бактерий на подвижность.

Некоторые бактерии имеют органы движения — жгутики, тончайшие нити диаметром 0,02–0,05 мкм, длиной до 10 мкм. Количество и характер расположения жгутиков у бактерий раз- личен. Под световым микроскопом жгутики не видны, так как их размеры лежат за пределами разрешающей способности мик- роскопа, для детального изучения применяют электронный микроскоп. Их наличие можно определить косвенным путем, изучая бактерии в живом состоянии: если они подвижны, ак- тивно пересекают поле зрения, значит, у них есть органы дви- жения. По расположению жгутиков на теле микробной клетки их можно разделить на четыре группы.

1. Монотрихи — бактерии с одним жгутиком на конце; пе- редвигаются прямолинейно.

2. Лофотрихи — бактерии с пучком жгутиков на одном конце.

3. Амфитрихи — пучок жгутиков расположен на обоих по- люсах клетки или два пучка жгутиков по полюсам.

4. Перитрихи — бактерии со жгутиками по всей поверхно- сти тела; передвигаются хаотично.

Извитые формы бактерий — спириллы и спирохеты — не имеют жгутиков и активно передвигаются за счет изменения конфигурации тела.

Методика приготовления препарата «висячая капля».

Выращивают молодую 12–16-часовую бульонную культуру изучаемых бактерий, смазывают вазелином края лунки на спе- циальном предметном стекле, наносят каплю взвеси в центр покровного стекла. Предметное стекло с лункой переворачива- ют и накладывают на покровное стекло так, чтобы оно прилип- ло, а капля оказалась в центре лунки. Затем его осторожно еще раз перевертывают покровным стеклом вверх, чтобы капля висела в центре герметично закрытой лунки. Под 8-кратным объ- ективом находят край капли, в этом состоянии фиксируют предметное стекло клеммами и меняют объектив на 40-крат- ный, а затем и на 90-кратный. Коэффициент преломления (КП) тела микробной клетки незначительно отличается от КП окру- жающей среды, поэтому для более контрастного изображения объекта надо затемнить поле зрения, прикрыв диафрагму и

опустив конденсор на оптимальную высоту. Подвижность хорошо видна уже при 400-кратном увеличении. При активном движении бактерии с помощью жгутиков меняют место положения и пересекают все поле зрения. Старая по возрасту культура малоподвижна, при внимательном изучении можно заметить активность только некоторых ее клеток (не путать с броуновским движением, когда бактерии совершают просто колебательные движения).

Для приготовления препарата «раздавленная капля» в центр обычного предметного стекла наносят каплю исследуемой культуры и накрывают покровным стеклом, при этом необходимо рассчитать объем капли так, чтобы она не вытекала за края покровного стекла. Микроскопию проводят по обычной методике, но прикрыв диафрагму и спустив конденсор.

Имеются и прямые методы обнаружения жгутиков. Например, метод серебрения по Морозову для обнаружения жгутиков основан на искусственном увеличении размеров жгутиков за счет наслоения на них аммиачного серебра. Во время микроскопии видны коричневые бактерии со жгутиками на желтом фоне.

Но на практике в микробиологических лабораториях чаще применяют косвенные методы и выявляют жгутики у бактерий в чистой культуре приготовлением препарата «висячая капля» или «раздавленная капля».

План работы.

1. Приготовить препарат из спорообразующих бактерий (можно окрасить Bac. subtilis — сенную палочку из сенного настоя); окрасить по Златогорову; изучить под микроскопом; обратить внимание на дифференциацию спор от вегетативных клеток по цвету.

2. Провести микроскопию демонстрационного препарата, окрашенного по Ольту, приготовленного из селезенки белой мыши, погибшей от сибирской язвы. Обратить внимание на короткие цепочки из палочек, окруженных капсулой.

3. Провести микроскопию готового препарата, приготовленного из культуры капсулообразующих бактерий (например, слизистый штамм молочнокислых бактерий из кисломолочных продуктов); обратить внимание на наличие капсулы.

4. Освоить методы приготовления препаратов «висячая капля» или «раздавленная капля» из сенного настоя или непатогенной бульонной культуры E. coli.

5. Провести микроскопию препарата «висячая капля» под 8-и 40-кратными объективами с прикрытой диафрагмой и опущенным конденсором.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Какое биологическое значение имеет спорообразование?

2. Как называются бактерии, образующие споры?

3. В чем отличие термина «бацилла» от термина «клостридия»?

4. Какое биологическое значение имеют капсулы бактерий, находящихся в организме?

5. На чем основан принцип окрашивания спор?

6. На чем основаны косвенные методы определения наличия органов движения жгутиков у бактерий?

7. На чем основаны прямые методы обнаружения жгутиков у бактерий?

8. С какой целью изучают наличие споры, капсулы и жгутиков у

бактерий?