ТЕМА 5
Микроскопические грибы:
плесневые грибы и дрожжи.
Их морфологические особенности
Цель занятия: изучить морфологические и культуральные
свойства микроскопических грибов и дрожжей.
Материальное обеспечение: чашки Петри с посевами мик-
роскопических грибов: Penicillium, Aspergillus, Mucor, а также пробирка со взвесью пекарских дрожжей в физиологическом растворе. Микроскопы, микологические крючки, препароваль- ные иглы, предметные и покровные стекла, флакончик со сме- сью воды, спирта и глицерина в равных объемах для приготов- ления препарата из плесневых грибов.
Микроскопические грибы — хемоорганотрофные микроор- ганизмы, эукариоты, не содержащие хлорофилла; относятся к царству Fungi (лат.) или Mycota (греч.), включающему в себя около 120 тыс. видов. Широко распространены в природе — почве, воде, растениях, продуктах питания. Дифференциация плесневых грибов и дрожжей иногда затруднена, так как есть переходные формы, различия между которыми почти неулови- мы. В качестве критерия, отличающего дрожжевую клетку от плесеней, используют способность плесеней образовывать длин- ные, разветвленные нити-гифы.
Вегетативное тело гриба состоит из ветвящихся нитевидных гифов, переплетение которых образует мицелий, или грибницу. Различают субстратный мицелий, находящийся в глубине пита- тельной среды, и воздушный, возвышающийся над средой, час- то несущий специальные органы размножения. По строению мицелия грибы подразделяют на два класса — низшие и высшие.
У низших грибов мицелий несептирован и представлен одной разветвленной клеткой, иногда с несколькими ядрами и без перегородок.
У высших грибов мицелий септирован, в гифах имеются перегородки (септы), разделяющие их на отдельные клетки.
Микроскопические грибы размножаются вегетативными и репродуктивными методами при помощи спор, а также половым способом.
Морфологические и культуральные свойства представителей низших и высших грибов.
Mucor, или головчатая плесень, относится к типичным представителям фикомицетов (низших грибов).
Мицелий мукора состоит из одной разветвленной клетки, от которой вертикально отходят воздушные гифы — спорангиеносцы, заканчивающиеся черными круглыми спорангиями (головками), поэтому его иногда называют «головчатая плесень». После созревания и разрыва спорангия многочисленные эндоспоры заражают все вокруг, попадая на поверхность пищевых продуктов и кормов, покрывая всю поверхность черной пушистой массой, видимой невооруженным глазом. Активный рост прекращается при 5–8°С.
К самым известным представителям микомицетов (высших грибов) относятся грибы родов Penicillium, Aspergillus.
Penicillium — плесень-кистевик, имеющий ветвящийся, септированный мицелий. При микроскопии препаратов из мицелия видны конидиеносцы, имеющие на верхушке мутовки, из которых выходят цепочки конидий (экзоспор). Пенициллы хорошо развиваются при достаточной аэрации и влажности на всех пищевых продуктах и кормах. Пустоты внутри и поверхность продуктов покрываются зеленоватой бархатистой плесенью, вызывающей порчу продукта, придающей привкус плесени.
Aspergillus — леечная плесень, имеет септированный мицелий. При микроскопии видны конидиеносцы, заканчивающиеся булавовидным расширением, окруженным стеригмами, из которых выходят цепочки конидий. Аспергиллы хорошо развиваются на мясных и молочных продуктах, на поверхности которых появляются колонии зеленой плесени.
К представителям микроскопических грибов, являющихся виновниками порчи пищевых продуктов и кормов, относят Cladosporium, Fusarium, Oidium lactis, Alternaria.
Cladosporium. При микроскопии виден септированный ми- целий и конидиеносцы, на питательном субстрате образуют ко- ричневые или черные бархатистые колонии. На воздушных ги- фах мицелия формируются овальные, расположенные в цепоч- ку споры. Хорошо растут при низких температурах и обладают высокой протеолитической активностью. Находясь на поверх- ности мяса, мясных продуктах, эта плесень проникает в толщу мышечной ткани.
Плесень этого рода вызывает внутреннее плесневение мас- ла (образование черных пятен) при наличии внутренних пус- тот. Может вызвать порчу сыра и яичных продуктов.
Среди грибов рода Fusarium есть сапрофиты, которые жи- вут в почве и на растительных остатках, а патогенные парази- ты вызывают заболевания многих видов растений — увядание, гниль корней, плодов, полегание сеянцев древесных и кустар- никовых пород, болезни семян.
При культивировании на питательной среде грибы рода Fusarium образуют войлочный септированный мицелий, обыч- но окрашенный в белый или розовый цвет, питательная среда под колониями имеет вишневый оттенок. На воздушном мице- лии формируются макро-и микроконидии. Макроконидии ве- ретенообразной или серповидной формы, внутри имеют пере- городки и состоят из нескольких крупных клеток, а микроко- нидии — чаще одноклеточные, грушевидной формы.
Oidium lactis на питательной среде образуют белый септи- рованный мицелий. Оидии, в виде овальных клеток, отделяют- ся непосредственно от кончиков мицелия. Молочная плесень имеет вид белого пушистого налета, появляется на поверхно- сти молочных продуктов — сметане, твороге, кефире, в резуль- тате чего происходит снижение кислотности, приводящее к ак- тивизации гнилостных бактерий и порче продукта.
При длительном хранении при низкой температуре могут развиваться схожие с Oidium lactis другие плесневые грибы, такие как Candida и Oospora.
Alternaria. От основных нитей мицелия гриба отходят корот- кие конидиеносцы, заканчивающиеся грушевидными или заост-
ренными многоклеточными конидиями, окрашенными в оливковый, бурый цвет. Плесени этого вида могут развиваться на охлажденном и замороженном мясе, масле и других продуктах.
Особенности культивирования плесневых грибов.
Для выращивания микроскопических грибов применяют специальные питательные среды — Сабуро, Чапека.
При первичном выделении грибов из исследуемого материала в питательные среды для подавления сопутствующей микрофлоры добавляют пенициллин из расчета содержания антибиотика 50 или 100 ед. в 1 мл среды, а стрептомицина — 0,1 г на 1 мл среды. Питательные среды с антибиотиками готовят непосредственно перед использованием, добавляя к расплавленной и охлажденной до 50°С питательной среде растворы антибиотиков. Подозрительный по качеству исследуемый материал (пищевые продукты, корма, зерно) вносят на поверхность питательной среды в чашке Петри, выращивают при 28°С в течение 5–8 дней. Для каждого вида гриба характерны свои культуральные особенности. Являясь строгими аэробами, они образуют на поверхности питательной среды крупные бархатистые, войлочные или кожистые колонии различной пигментации. По мере появления колоний изучают морфологические и культуральные свойства для дифференциации плесневых грибов.
Особенности изучения морфологии плесневых грибов.
Методика: на предметное стекло наносят каплю смеси, состоящей из равных объемов воды, спирта и глицерина. При помощи бактериологической петли и препаровальной иглы в эту каплю вносят часть мицелия изучаемых плесневых грибов, осторожно прикрывают покровным стеклом, находят объект под 8-кратным объективом, а изучают под увеличением в 400–900 раз. Микроскопические грибы не окрашивают, их изучают в нативном виде, поэтому при микроскопии препарата для увеличения контрастности, необходимо опустить конденсор и прикрыть ирисовую диафрагму (режим высоты конденсора и диаметр диафрагмы меняют до появления четкого изображения). При микроскопии препарата обращают внимание на наличие перегородок в гифах, отмечают особенности строения органов спороношения, так как только по ним можно определить родовую и даже видовую принадлежность.
Дрожжи — одноклеточные организмы округлой или удлиненной формы, с двухконтурной оболочкой и дифференцированным ядром. Их размножение происходит почкованием, половым путем, некоторые размножаются при помощи спор. В асках образуется от 4 до 12 спор. Оптимальной является температура 20–30°С, но многие из них способны развиваться при 10°С и вызывать порчу продуктов. Дрожжи широко распространены в природе: почве, растениях, в воздухе, откуда они попадают на пищевые продукты и являются виновниками их порчи. В зависимости от вида дрожжей в продуктах происходит сбраживание углеводов, появляется прогорклый вкус у масла. Некоторые виды дрожжей способны развиваться даже в средах, содержащих 24% NaCl.
В промышленности широко используются дрожжи рода Saccharomyces, который объединяет как «дикие или природные» штаммы, так и культурные, используемые в хлебопечении, в спиртовой и пивоваренной промышленности, сельском хозяйстве и быту. Они характеризуются различными биологическими свойствами, способностью сбраживать различные углеводы, интенсивностью брожения, количеством и концентрацией образуемого спирта.
Род Saccharomyces cerevisiae — крупные дрожжи округлой формы. Их применяют в промышленном производстве этилового спирта, хлебопечении, пиво-и квасоварении. Оптимальная температура брожения 28–30°С. Они неустойчивы к высокой концентрации сахара, соли, спирта в концентрации 12– 14%. В каждом производстве применяют свои, специфические, расы данного вида дрожжей.
S. minor применяют преимущественно при выпечке ржаного теста. Клетки мелкие — 1,5–3 мкм, круглой формы, характерны фигуры почкования по 3–7 клеток. Оптимальная температура развития — 25–28°С. Отличаются кислотоустойчивостью, менее требовательны к источникам витаминного и азотного питания, более спиртоустойчивы.
Род Saccharomyces ellipsoideus (S. vini) — дрожжи, как показывает название, эллипсоидной формы. Их используют преимущественно в виноделии, этот вид дрожжей также представлен многими расами.
Но эти и некоторые другие виды рода Saccharomyces при случайном попадании в сырье и пищевые продукты, содержащие легко сбраживаемые углеводы, вызывают их порчу — скисание и брожение.
Дрожжи рода Debariomyces являются возбудителями порчи колбасы, сосисок и других субстратов, богатых белком.
Для изучения морфологии дрожжей на лабораторном занятии можно использовать взвесь пекарских дрожжей в физрастворе, которые равномерно распределяют тонким слоем на предметном стекле, фиксируют физическим методом и окрашивают метиленовой синью в течение 3–5 мин. Дрожжевые клетки располагаются одиночно, имеют овальную форму, в молодой культуре часто обнаруживают почкующиеся дрожжи. Обратите внимание, что морфологию дрожжей можно изучать уже при 400-кратном увеличении.
При бактериологическом контроле качества дрожжевой закваски необходимо изучить их под иммерсией, так как при этом увеличении в загрязненной закваске можно обнаружить между крупными дрожжевыми клетками сопутствующую микрофлору, изучить ее и определить источники загрязнения по ходу технологического процесса.
Определение числа клеток, содержащих гликоген. Полисахариды в клетках дрожжей представлены гликогеном, имеющим вид гранул, расположенных в цитоплазме, выявляют их при обработке клеток раствором Люголя. Зрелость дрожжей определяется по накоплению гликогена в цитоплазме.
Методика: каплю взвеси изучаемой дрожжевой закваски наносят на предметное стекло и в нее добавляют каплю раствора Люголя. Каплю накрывают покровным стеклом, и получается препарат «раздавленная капля», ее микроскопируют и изучают при увеличении в 400 и 900 раз.
Микрокартина: гликогеноподобные полисахариды окрашиваются раствором Люголя в красновато-бурый цвет, а крахмалоподобное вещество (гранулеза) — в синий. Реакция на гликоген идет только в кислой среде, поэтому перед выявлением его в клетке среду, где выращивали дрожжи, подкисляют.
Количество дрожжевых клеток с гликогеном в закваске должно составлять не менее 70% от общего числа. Отсутствие гликогена в клетках дрожжей свидетельствует о том, что дрожжи незрелые, и перед применением такой закваски в производство ее надо освежить добавлением питательных веществ.
План работы.
1. Визуально и при помощи лупы изучить культуральные свойства плесневых грибов, выросших на демонстрационных посевах в чашках Петри. Обратить внимание на культуральные свойства грибов, особенности строения мицелия — войлочный, бархатистый; наличие пигмента — зеленый, черный, оливково-бурый.
2. Приготовить препарат из мицелия плесневых грибов Penicillium, Aspergillus, Mucor; провести микроскопию; изучить морфологию; найти представителей одноклеточных и многоклеточных грибов, органы их спороношения — конидиеносцы, микрокартину зарисовать.
3. Приготовить препарат из взвеси пекарских дрожжей; окрасить простым методом; изучить микрокартину; найти почкующиеся дрожжевые клетки; зарисовать микрокартину. Обратить внимание на наличие бактериальной микрофлоры, которая является загрязняющей или сопутствующей.
4. Провести определение гликогена в дрожжевой клетке.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Какие морфологические особенности характерны для низших и
высших микроскопических грибов?
2. Какие способы размножения характерны для плесневых грибов?
3. С какой целью в питательные среды добавляют антибиотики при
культивировании плесневых грибов?
4. Какой морфологический признак является характерным для
дрожжей?
5. С какой целью определяют наличие гликогена в дрожжевой
клетке?