ТЕМА 6

Методы стерилизации

питательных сред и посуды

Цель занятия: изучить методы стерилизации, применяемые

в микробиологической практике; ознакомиться с правилами работы с электрическим сушильным шкафом, автоклавом, ап- паратом Коха, прибором Зейтца.

Материальное обеспечение: автоклав, электрический су-

шильный шкаф, текучепаровой аппарат Коха, стерилизатор с набором инструментов, колба Бунзена, фильтр Зейтца, фильт- ры из асбеста и нитроцеллюлозы, твердые фильтры из белой глины; таблица «Методы стерилизации».

Под стерилизацией понимают полное уничтожение всех жизнеспособных микроорганизмов (вегетативных, споровых) в стерилизуемом объекте с помощью высокой температуры, химических веществ и других факторов.

Главными требованиями ко всем методам стерилизации яв- ляются их надежность и сохранение первоначальных свойств стерилизуемого объекта. В связи с большим разнообразием ка- чества стерилизуемых объектов разработаны различные мето- ды стерилизации. При выборе метода стерилизации необходи- мо учитывать качество стерилизуемого объекта, возможные изменения его свойств под влиянием силы излучения, высокой температуры, химических реагентов и т. д.

Различают физический, химический и механические ме- тоды стерилизации. К физическим методам стерилизации от- носят действие высокой температуры, ультрафиолетовых лу- чей (УФ), ионизирующей радиации, ультразвука. Химические

методы применяют для обработки вакцин, сывороток и других биопрепаратов, консервируемых различными антисептиками. Механический метод рекомендуют для фильтрации жидкостей, которые нельзя нагревать. Для этого применяют специальные бактериальные фильтры, в порах которого остаются бактерии, но вирусы проходят.

Физические методы стерилизации.

I. Термическая обработка.

1. Стерилизация в пламени (в условиях лаборатории чаще в пламени спиртовки) или фламбирование применяются только для обработки мелких инструментов, таких как бактериологические петли, пинцеты, скальпели, ножницы, пастеровские пипетки (этот метод разрушает ткани, резиновые детали и оборудование).

2. Стерилизация сухим жаром проводится в электриче% ских сушильных шкафах при 160°С в течение 2 ч, при 170°С — 60 мин. Этим методом стерилизуют лабораторную стеклянную посуду, предварительно завернутую в бумагу.

3. Кипячение в специальных стерилизаторах в течение 30– 40 мин применяется для обработки хирургических инструмен% тов, при этом вода должна быть обязательно дистиллирован% ная, для усиления эффекта добавляют 1–2% соды. В последние годы появились разнообразные одноразовые инструменты, но тем не менее стерилизация методом кипячения находит приме% нение. Недостатком этого метода является то, что есть споры, выдерживающие такой режим обработки.

4. Стерилизация паром. Различают обработку паром под давлением в герметично закрывающихся автоклавах и текучим паром в аппарате Коха.

Стерилизация паром под давлением проводится в автокла% ве, который представляет собой двустенный металлический котел с герметично завинчивающейся крышкой. Между стен% ками всегда должна находиться вода, во время кипения кото% рой образуется пар, поступающий в рабочую камеру. Давление внутри автоклава показывает манометр. На шкале манометра обозначается только избыточное давление, нормальное давле% ние соответствует показанию «0». Работа с автоклавом требует строгого выполнения правил и техники безопасности, преду% смотренных специальной инструкцией.

Через воронку налить дистиллированную воду до метки и закрыть кран. Загрузить стерилизационную камеру и герметично закрыть. Включить нагревательную систему автоклава при открытом паровыпускающем кране; дождаться появления непрерывной сухой струи пара, свидетельствующей о том, что весь воздух из рабочей камеры вытеснен, и только после этого перекрыть паровыводящий кран. Далее продолжается нагревание, и образующийся пар не находит выхода, поэтому давление возрастает (показатели манометра).

Во время работы автоклава наблюдают за показателями двух манометров: один из них показывает давление в рабочей камере, другой автоматически поддерживает заданный режим работы.

При давлении в 0,5 атм. температура в автоклаве равна 110–112°С; в 1,0 атм. — 120–121°С; в 1,5 атм. — 126–128°С; в 2,0 атм. — 132–134°С. Длительность работы с момента достижения заданного режима продолжается 20–30 мин.

Электронагревательные приборы выключают после окончания стерилизации. Крышку автоклава открывают, соблюдая технику безопасности, только после того, как давление упадет до нуля.

При автоклавировании на бактерии губительно действуют одновременно высокая температура и давление, поэтому автоклавирование является самым надежным методом стерилизации. Эффективность стерилизации можно проверить, помещая в автоклав реактивы с известной точной точкой плавления или пробирки, содержащие термофильные спорообразующие бактерии, которые проверяют посевом в стерильные питательные среды. После выдерживания в термостате среды должны остаться стерильными.

В автоклаве стерилизуют питательные среды, физраствор, посуду, отработанные бактериальные культуры, халаты, вату, бинты.

Дробная стерилизация текучим паром проводится в аппарате Коха или в автоклаве с открытым паровыводящим краном, т. е. появляющийся пар не накапливается, а удаляется через открытые краны постоянно, поэтому температура выше 100°С не поднимается. Данный метод стерилизации рекомендуют применять для питательных сред (с углеводами, желатином), которые изменяют свои свойства при нагревании

выше 100°С. Режим работы: три дня подряд по 40 мин с момента достижения 100°С. Суть сводится к тому, что при первом прогревании вегетативные клетки погибают, а споры остаются (предполагается, что они в течение суток прорастут). Повторное прогревание на второй день вновь убивает проросшие вегетативные клетки. Третье проводят для большей надежности, при этом погибают все вновь появившиеся вегетативные клетки.

Для стерилизации питательных сред, содержащих белки, применяют процесс тиндализации, который проводят в водяной бане при 60–65°С по часу в течение пяти дней.

5. Пастеризация (частичная стерилизация) — прогревание при температуре ниже 100°С. Например, молоко пастеризуют при 74–76°С в течение 20 с. Цель пастеризации — уничтожение патогенных бактерий (возбудителей туберкулеза, бруцеллеза, вируса ящура), а также гнилостных и молочнокислых бактерий, являющихся виновниками порчи продуктов. После пастеризации молоко сразу охлаждают до 4°С, чтобы предотвратить размножение оставшейся термофильной и споровой микрофлоры. Пастеризовать рекомендуют соки, пиво, вино, которые нельзя прогревать при более высокой температуре, так как происходит снижение биологической ценности пастеризуемого продукта.

II. Облучение электромагнитными волнами.

1. Ультрафиолетовые лучи (длиной 250–270 нм), подавляющие репликацию ДНК, широко применяются для санации воздуха в животноводческих помещениях, в цехах молочных заводов, в микробиологических боксах для создания асептических условий. Для дезинфекции воздуха применяют лампы низкого давления типа БУВ-15, БУВ-60.

2. Ионизирующая радиация (холодная стерилизация) поражает генетический аппарат микробной клетки. Гамма-и рентгеновское облучение применяют для уничтожения микроорганизмов на пластмассовых изделиях одноразового применения, перевязочных материалах, биопрепаратах (при этом не снижается их качество).

3. Действие ультразвука заключается в дезинтеграции цитоплазматических структур микроорганизмов. Применяют для стерилизации пищевых продуктов (молока, воды).

Химические методы.

Химические вещества могут ингибировать (тормозить) или полностью подавлять рост микроорганизмов, поэтому их мож- но применять с целью профилактики микробного загрязнения питательных сред, вакцин, диагностических и лечебных сыво- роток.

Вакцины и лечебные сыворотки консервируют карболовой кислотой (0,5%), формалином (0,5%), мертиолятом (1:5000).

Диагностические агглютинирующие сыворотки консерви- руют, добавляя 1,5% хлороформа, который при применении улетучивается, борной кислотой, глицерином.

Мелкую стеклянную посуду, пипетки, предметные стекла дезинфицируют, погружая в 10%-ный раствор Н2О2, 70%-ный этиловый спирт, 5%-ный раствор карболовой кислоты или ще- лочи.

Для дезинфекции в лабораторной практике применяют 3–5%-ные растворы карболовой кислоты, хлорамина.

Механические методы.

Эти методы основаны на фильтрации жидкостей через спе- циальные бактериальные фильтры, которые задерживают ви- димые под микроскопом микроорганизмы. Через них свободно проходят вирусы и микоплазмы, поэтому данные методы сле- дует признать лишь как «частичную» стерилизацию.

Механические методы стерилизации рекомендуется приме- нять для биологических жидкостей, которые нельзя прогревать, например, сыворотку крови, растворы витаминов, белки, дрож- жевые экстракты.

Бактериальные фильтры имеют различную форму и изготав- ливаются из различных материалов. Они отличаются по величи- не пор, диаметр которых указан в прилагаемой инструкции.

В микробиологической практике широко используются фильтры-свечи, изготовленные из каолина с примесью квар- цевого песка («свечи Шамберлана»), из инфузорной земли («све- чи Беркефельда») с различным диаметром пор, в которых фильт- рация происходит только под давлением.

Особенно широкое применение нашли так называемые мембранные фильтры-диски различного диаметра, толщиной 0,1 мм, изготовленные из асбеста, коллодия, нитроцеллюлозы

(они рассчитаны на одноразовое применение). Фильтры монтируют в прибор Зейтца, который состоит из приемного стакана-воронки, металлической сетки, на которую помещают фильтровальную бумагу, затем собственно фильтр и колбы Бунзена. Перед работой собранный прибор завертывают в бумагу и стерилизуют автоклавированием (300 мин при 110°С). Жидкость, подлежащую стерилизации, наливают в воронку прибора, внутри колбы создают вакуум, и жидкость проходит через фильтры, освобождаясь от бактерий, попадает в приемную колбу Бунзена.

План работы.

1. Ознакомиться с оборудованием кафедры (горизонтальным и вертикальным автоклавами, электрическим сушильным шкафом, аппаратом Коха); правилами работы; техникой безопасности при работе с этими приборами.

2. Провести демонстрацию фильтрации воды через фильтр из нитроцеллюлозы, применив прибор Зейтца, вмонтированный в колбу Бунзена (в ней должен быть создан вакуум). Ознакомиться с твердыми фильтрами в виде свечи.

3. Провести кипячение с целью стерилизации МПА и МПБ в пробирках, которые необходимо поставить в термостат на 24 ч; на следующем занятии проверить результаты и убедиться, что спорообразующие остались и проросли (в МПА и МПБ должны появиться признаки роста).

4. Приготовить 3%-ный раствор карболовой кислоты и 3%-ный раствор хлорамина, разлить в широкие сосуды и погрузить в них пипетки.

5. Посетить бокс; ознакомиться с работой ультрафиолетовых ламп.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. С какой целью применяется стерилизация?

2. Что учитывают при выборе метода стерилизации?

3. На чем основаны физические методы стерилизации?

4. На чем основаны механические методы стерилизации и для каких сред они рекомендуются?

5. Назовите недостатки таких методов стерилизации, как кипячение и пастеризация. Чем это объясняется?

6. Какой метод стерилизации самый надежный?