ТЕМА 7

Приготовление питательных сред

для культивирования микроорганизмов,

их классификация

Цель занятия: сформировать у студентов представление о на

значении обычных (общеупотребительных), специальных, дифференциально-диагностических и элективных питательных сред; изучить способы приготовления питательных сред; ознакомить студентов с методами культивирования микроорганизмов.

Материальное обеспечение: компоненты для приготовле

ния питательных сред — сухой агар-агар, пептон, поваренная соль, желатин. Набор готовых жидких и плотных питательных сред в пробирках, чашках. Образцы сухих питательных сред в фабричной упаковке. Лабораторные весы, разновески, химические стаканы, мензурки, колбы с дистиллированной водой, электроплитка; таблица «Классификация питательных сред».

Характеристика и классификация питательных сред.

В микробиологических лабораториях готовят питательные среды для выращивания микроорганизмов с учетом их физиологических потребностей, содержащие различные вещества, необходимые для размножения и роста микроорганизмов.

Ко всем питательным средам предъявляются общие требования.

1. Питательные среды должны быть стерильные.

2. Питательные среды должны быть влажные, так как микроорганизмы питаются поверхностью тела путем осмоса и диффузии, а продукты метаболизма выделяются только в растворенном виде.

3. Для большинства бактерий благоприятной является рН в пределах 7,2–7,4.

4. Питательные среды должны содержать все питательные вещества, источники углерода и азота (пептон), обеспечиваю! щие оптимальный рост.

5. Некоторые питательные среды должны быть прозрачными.

6. Для анаэробных бактерий готовят питательные среды, изолированные от воздуха слоем вазелинового масла.

В табл. 3 представлена классификация питательных сред. Из данных, представленных в ней, видно, что в состав естест! венных сред входят растительные компоненты: экстракты овощные, соевые, гороховые; животного происхождения: экс! тракты из мяса, сыворотки крови, яйца, молоко, которые мож! но отнести к средам неопределенного химического состава. Из этой группы сред широко применяются МПБ (мясопептонный бульон), МПА (мясопептонный агар), РПБ (рыбопептонный бульон).

Синтетическими называют среды, в состав которых вводят физиологически обоснованные количества химически чистых элементов, углеводов, незаменимых аминокислот, витамины, различные минеральные вещества, такие среды относят к сре! дам известного химического состава. При изучении метаболи! ческих потребностей микроорганизмов в питательные среды вводят радиоактивно меченые углерод и фосфор.

Как видно из табл. 3, по назначению питательные среды делят на: основные (обычные, общеупотребительные); специальные; дифференциально-диагностические; элективные (накопительные, избирательные).

К основным (общеупотребительным) питательным средам относятся МПБ, МПА. На них растут многие нетребовательные микроорганизмы — E. coli, S. aureus, Bac. anthracis.

Основой многих питательных сред является мясная вода: говядину хорошего качества освобождают от костей, жира и измельчают в мясорубке. 1 кг полученного фарша заливают 2 л водопроводной воды, кипятят 60 мин (можно предварительно экстрагировать в условиях холодильника 16–18 ч, потом кипятить). Далее мясную воду охлаждают, фильтруют через ватномарлевый фильтр и доливают воду до первоначального объема. Колбы закрывают ватно-марлевыми пробками, бумажными колпаками и стерилизуют 20 мин при 120°С в автоклаве, приготовленную мясную воду используют как один из компонентов при приготовлении МПБ и других сред. В мясной воде содержится большое количество аминокислот, углеводов, факторов роста, минеральных солей и экстрактивных веществ.

Перевар Хоттингера готовят из мясных отходов путем их триптического гидролиза. Мелко нарезанный материал заливают кипящей водой в соотношении 1:2, кипятят, охлаждают до 45°С и добавляют панкреатин, подщелачивают раствором карбоната натрия до рН 7,8–8,0, встряхивают и добавляют хлороформ (10 мл/л) плотно закрывают, выдерживают 10 сут. в теплом месте и получают продукт гидролиза.

МПБ (мясопептонный бульон). К 1 л мясной воды добавляют 1% пептона и 0,5% химически чистой поваренной соли, устанавливают рН среды 7,4–7,6. Разливают в колбы или пробирки и автоклавируют при 120°С 20 мин. Стерильная среда прозрачная, имеет интенсивно-желтый цвет.

МПА (мясопептонный агар). К 1 л МПБ добавляют 2–3% сухого агар-агара, расплавляют в кипящей водяной бане, разливают в пробирки по 5 мл для приготовления скошенного МПА или по 13–15 мл «столбиком» для последующего разлива в чашки Петри. Приготовленные среды автоклавируют при 1 атм. 20– 30 мин. Большим преимуществом этой среды является то, что плотность среды сохраняется и при температуре термостата.

Внедрение плотных питательных сред в бактериологию в свое время оказалось очень важным шагом для получения чистых куль- тур микроорганизмов. Стали применять уплотнители, используе- мые в кондитерском производстве при изготовлении мармелада и желе. В качестве уплотнителя применяют агар-агар, получаемый из некоторых морских водорослей. Агар-агар — это полисахарид, не имеющий питательных свойств, но придающий питательной среде плотную консистенцию при добавлении 2% и полужидкую консистенцию при добавлении 0,3–0,5% агар-агара, при этом по- лучается ПЖА (полужидкий мясопептонный агар).

Для нужд микробиологии, промышленность выпускает «бактериологический», «высокоочищенный» агар-агар в виде порошка или тонких прозрачных пластинок.

МПЖ (мясопептонный желатин). Желатин — продукт выварки костей, хрящей и сухожилий, обладающий питатель- ными свойствами. Его выпускают предприятия биологической промышленности в виде порошка и тонких пластинок. Для при- готовления МПЖ к 1 л МПБ добавляют 10–20% порошка жела- тина, после набухания крупинок колбу ставят в кипящую водя- ную баню для расплавления и разливают по 8–9 мл в пробирки. МПЖ после охлаждения принимает плотную консистенцию при комнатной температуре. Затем его дробно стерилизуют в аппа- рате Коха или в автоклаве с открытым краном три дня по 20 мин или однократно в автоклаве при 112°С 15 мин.

Особенностью этой среды является то, что выращивание бактерий на МПЖ возможно только при комнатной температу- ре, так как в термостате она расплавляется (разжижается). Тем- пература плавления желатина — 23–26°С, застывает он при тем- пературе 18–20°С, образуя плотный гель. Недостатком этой сре- ды является то, что при температуре культивирования бактерий она расплавляется. Обычно МПЖ применяют для изучения про- теолитических свойств бактерий при комнатной температуре. Под действием протеолитических ферментов, выделяемых бак- териями, МПЖ необратимо разжижается.

Бульон Хоттингера: перевар Хоттингера разводят водопро- водной водой в соотношении 1:5 и добавляют 0,5% хлорида на- трия и 0,1 г гидрофосфата калия; устанавливают рН 7,4–7,6; кипятят 15–20 мин; фильтруют; разливают по пробиркам и сте- рилизуют 20–30 мин при 120°С.

Некоторые патогенные микроорганизмы при первичном выделении из исследуемого материала очень требовательны к качеству питательных сред. Поэтому для их культивирования применяют специальные среды, в состав которых добавляют углеводы, кровь, сыворотку крови, некоторые незаменимые аминокислоты.

Сахарный МПБ и МПА. Чтобы приготовить сахарный МПБ и МПА, к обычным, общеупотребительным средам в колбе добавляют 1% глюкозы, размешивают, разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром дробно.

Сывороточный МПБ и МПА. К МПБ в колбе добавляют 5–10% стерильной сыворотки крови, размешивают и разливают по пробиркам. МПА предварительно расплавляют, охлаждают до 50°С и стерильно добавляют 5–10% сыворотки крови, тщательно перемешивают. Полученную среду разливают в чашки Петри, пробирки и охлаждают.

Кровяной МПА. К расплавленному и охлажденному до 50°С МПА в колбе, чашке Петри стерильно прибавляют 5–10% дефибринированной крови (кролика, барана), тщательно перемешивают. На этой среде изучают способность патогенных бактерий вызывать гемолиз эритроцитов.

Сывороточные и кровяные среды готовят непосредственно перед посевом, так как повторно расплавлять эти среды нельзя.

Дифференциально-диагностические среды применяют для первичного выделения возбудителя из исследуемого материала и для дифференциации бактерий друг от друга. При приготовлении дифференциально-диагностических сред к обычной среде добавляют углеводы, индикаторы, а к некоторым еще и ингибиторы, анилиновые краски. При размножении микроорганизмов в дифференциально-диагностических средах происходит изменение цвета индикатора, питательной среды и самих колоний, что позволяет отличать одни виды бактерий от других (среды Гисса, агар Эндо, Левина, Плоскирева и т. д.).

В некоторых случаях, когда предполагается незначительное обсеменение исследуемого материала патогенным возбудителем, например сальмонеллами, проводят подращивание возбудителя для увеличения его численности посевом в среды обогащения без ингибиторов, такие как пептонная и буферная вода, МПБ. После появления видимого роста в средах обогащения делают пересев из них в дифференциально-диагностические среды.

Элективные (селективные, накопительные) среды разнообразные и очень сложные по своему составу, могут быть плотными и жидкими. Эти питательные среды рекомендуют применять для накопления и выделения возбудителя из исследуемого материала, обильно обсемененного посторонней микрофлорой, а также для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания. В них добавляют ингибиторы (анилиновые краски, желчь, антибиотики), подавляющие рост сопутствующей микрофлоры и обеспечивающие преимущественные условия для размножения выделяемого возбудителя. Жидкие селективные среды в научной литературе еще называют средами накопления, их рекомендуют применять, когда в исследуемом материале предполагается незначительное содержание интересуемого возбудителя и нужно подавить размножение нежелательной, сопутствующей микрофлоры.

К элективным питательным средам относятся среды для индикации бактерий группы кишечных палочек (БГКП).

Среды Гиса — это жидкие или полужидкие питательные среды, применяемые для изучения сахаролитических свойств бактерий. Основой данных сред служит 1%-ная пептонная вода, к которой добавляют 0,5% хлорида натрия и 0,5% одного из углеводов (глюкоза, лактоза, сахароза, маннит) и индикатор Андрэде (готовая среда желтого цвета) или индикатор бромтимоловый синий (готовая среда сине-зеленого цвета). Готовую среду разливают в пробирки по 5–6 мл. В пробирки с жидкой средой помещают «поплавки» (мини-пробирки вверх дном) для улавливания образующегося газа; в полужидких средах при наличии фермента, расщепляющего углеводы до конечных продуктов, в глубине среды появляются неисчезающие пузырьки газа.

Среда Эндо выпускается в сухом виде. При приготовлении ее в лаборатории к 100 мл МПА прибавляют 1 г лактозы, предварительно растворенной в небольшом количестве воды. В отдельной пробирке к 1 мл спиртового насыщенного основного фуксина добавляют 10%-ный водный раствор сульфида натрия до обесцвечивания фуксина. Приготовленную смесь вливают в растопленный МПА и перемешивают. Готовая среда должна быть бледно-розового цвета, ее не хранят, а сразу разливают по чашкам Петри. Она применяется для дифференциации E. coli от Salmonella. Только кишечная палочка расщепляет лактозу, входящую в состав агара Эндо, до молочной кислоты, которая подкисляет среду и восстанавливает обесцвеченный фуксин. Колонии кишечной палочки (эшерихий) в кислой среде приобретают красный цвет с металли- ческим блеском, а при росте сальмонелл, которые не расщепляют лактозу, рН среды не изменяется, поэтому образуются неокрашен- ные колонии, что позволяет дифференцировать их друг от друга.

Среда Левина выпускается в сухом виде. При приготовле- нии ее добавляют к 100 мл расплавленного МПА в указанной последовательности: 2 мл 0,5%-ного водного раствора метиле- нового синего, 1,5 мл 2%-ного раствора эозина желтого, 2 г лак- тозы и 0,2 г двуосновного фосфата калия (растворы красок го- товят предварительно, стерилизуют текучим паром и хранят впрок). Готовая среда приобретает красно-фиолетовый цвет. Лактозопозитивные бактерии, эшерихии, расщепляющие лак- тозу, на этой среде образуют колонии, окрашенные в темно-фио- летовый цвет, а сальмонеллы — бесцветные.

Агар Плоскирева выпускается в сухом виде. Предназначен для выделения сальмонелл, содержит лактозу и компоненты, по- давляющие рост сопутствующей микрофлоры, т. е. ингибиторы (желчные соли, цитрат натрия, тиосульфат натрия, бриллианто- вый зеленый, йод, нейтральный красный). Агар Плоскирева по классификации является одновременно дифференциально-диаг- ностической и селективной средой, поэтому его рекомендуют применять при обильном обсеменении материала сопутствующей микрофлорой. Готовая среда оранжево-красная, колонии саль- монелл бесцветные, а эшерихии — кирпично-красного цвета.

Среда Кесслера: к 1000 мл дистиллированной воды добав- ляют 10 г пептона и 50 мл бычьей желчи. Смесь кипятят на во- дяной бане при помешивании 20–30 мин; фильтруют через вату; добавляют 2,5 г лактозы; доводят объем дистиллированной воды до 1000 мл; устанавливают рН 7,4–7,6; добавляют 2 мл 1%-ного водного раствора генцианвиолета; разливают в про- бирки с поплавками по 8–10 мл и стерилизуют при температу- ре 121°С в течение 10 мин. Желчь и генцианвиолет являются ингибиторами грамположительных бактерий и, подавляя их размножение, облегчают индикацию кишечной палочки. Гото- вая среда имеет темно-фиолетовый цвет и не меняет его во вре- мя роста бактерий. О наличии кишечной палочки в исследуе- мом продукте свидетельствует помутнение среды и появление газа в поплавках.

ХБ (хинозолбромкрезолпурпурная среда): в 1 л воды раство- ряют 10 г пептона, 5 г хлорида натрия, 5 г маннита. Приготов- ленную смесь кипятят 15–20 мин; устанавливают рН 7,4–7,6; фильтруют через бумажный фильтр; фильтрат кипятят 10 мин; охлаждают до 60°С; после чего прибавляют 30 мл дрожжевого диализата, 15 мл желчи, 10 мл раствора хинозола и 10 мл 1,6%-ного спиртового раствора бромкрезола пурпурного. Сре- ду разливают в стерильные пробирки по 7–8 мл. При росте БГКП эта среда окрашивается в желтый цвет.

Среда Хейфеца выпускается в сухом виде. В состав, кроме основных питательных компонентов (вода, пептон, маннит, натрия хлорид), входят розоловая кислота, раствор метилено- вого синего. Готовая среда приобретает красно-фиолетовый цвет, при росте кишечной палочки рН сдвигается в кислую сто- рону, и среда приобретает зеленоватую окраску.

К средам для индикации сальмонелл относят висмут-суль- фитный агар, среду Клиглера, трехсахарный агар, среды Кауф- мана и Мюллера.

Висмут-сульфитный агар, или среда Вильсона — Блера. На данной среде сальмонеллы образуют характерные влажно-сли- зистые колонии черного цвета, у протея они зеленые, эшери- хии на этой среде не растут или образуют единичные коричне- вые колонии с большим опозданием.

Среда Клиглера готовится из сухой питательной среды.

Трехсахарный агар с мочевиной по Олькеницкому: к 100 мл 1,5%-ного МПА, рН 7,2, добавляют по 1 г лактозы и сахарозы, 0,1 г глюкозы, 1,0 г мочевины, 0,02 г соли Мора (FeSO4(NH4)2SO46H2O), 0,03 г натрия тиосульфата, 0,4 мл 0,4%-ного водного раствора фенолового красного (фенолрота).

Все ингредиенты, кроме фенолрота, растворяют в неболь- шом количестве дистиллированной воды (10 мл) на водяной бане. Затем вливают в расплавленный агар; фильтруют; рН до- водят до 7,2–7,4.

После этого добавляют фенолрот и разливают в пробирки по 5–6 мл. Стерилизуют осторожно в прогретом автоклаве при температуре 112°С (не выше) в течение 30 мин. Лучше стери- лизовать текучим паром 20 мин 3 дня подряд. После стерили- зации среду скашивают так, чтобы оставался столбик высо- той 3–4 см. Готовая среда имеет бледно-розовый цвет.

Покраснение скошенной части столбика указывает на образование кислоты в результате расщепления лактозы и сахарозы. Покраснение столбика среды свидетельствует о расщеплении глюкозы. Эта среда позволяет выявлять расщепление мочевины, при этом происходит восстановление цвета до исходного.

Среда Кауфмана предназначена для культивирования сальмонелл, в ее состав включают раствор Люголя, тиосульфат натрия, раствор бриллиантового зеленого, бычьей желчи, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры.

Среда Мюллера содержит МПБ, мел, раствор Люголя, серноватистокислый натрий. Среду разливают по 8–10 мл в пробирки, перечисленные компоненты подавляют рост кишечной палочки и способствуют росту тифопаратифозных бактерий.

Среды для индикации золотистого стафилококка также относятся к элективным питательным средам.

Желточно-солевой агар применяют для выделения стафилококков из загрязненного посторонней микрофлорой материала. К МПА добавляют 10% хлорида натрия, а перед применением в расплавленный и охлажденный до 50°С агар добавляют 20% стерильной желточной взвеси. Патогенные стафилококки на этой среде вокруг колоний образуют «радужный венчик».

Солевой бульон: в 1000 мл РПБ, МПБ растворяют 65–90 г хлористого натрия; фильтруют; устанавливают рН 7,0–7,2; стерилизуют при температуре 121°С в течение 20 мин.

Молочно-солевой агар: к 1000 мл расплавленного и охлажденного до 45–60°С РПА или МПА, содержащего 75 г хлорида натрия (рН 7,2–7,4), добавляют асептически 100 мл стерильного обезжиренного молока. Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Агар типа Байрд-Паркер: в 1000 мл дистиллированной воды размешивают 30 г сухого питательного агара на основе ферментативного гидролизата кормовых дрожжей; добавляют 10 г пирувата натрия; 5 г хлористого лития. Нагревают при помешивании и кипятят в течение минуты до полного растворения ингредиентов. Устанавливают рН 7,2; стерилизуют при 121°С в течение 15 мин.

Перед применением в растопленную и охлажденную до 45–60°С среду асептически добавляют (из расчета на 100 мл среды) 0,5 мл 2%-ного раствора теллурита калия и 5 мл эмульсии яичного желтка.

К средам для выращивания клостридий относят среды Китта — Тароцци и Вильсона — Блера, сульфит-полимиксин-неомициновая среда, голодный агар.

Среда Китта — Тароцци: в пробирки с 2–3 кусочками вареной печени наливают высоким столбиком мясопептонный или печеночный бульон с 1% глюкозы. На поверхность среды в пробирки наслаивают 1–2 мл вазелинового масла. Стерилизуют при температуре 121°С в течение 20 мин и рН 7,2 (необходимо проверить до и после стерилизации).

Среда Вильсона — Блера (железо-сульфитный агар) для индикации клостридий в исследуемом материале: к 100 мл стерильного расплавленного и охлажденного до 80°С РПА или МПА, содержащего 1% глюкозы, добавляют 10 мл 20%-ного раствора сульфита натрия (Na2SO3) и 1 мл 5%-ного раствора железо-аммонийных квасцов (Fe(NH4)(SO4) Ч 12Н2О) (можно заменить 1 мл 8%-ного раствора железа сернистокислого (FeSI4), рН среды 7,5–7,8).

Растворы солей готовят непосредственно перед применением и стерилизуют текучим паром в течение 1 ч. Клостридии на этой среде образуют характерные черные колонии.

Сульфит-полимиксин-неомициновая среда (СПН) для индикации клостридий в исследуемом материале. В 1000 мл печеночного бульона асептически вносят 5 мл 10%-ного водного раствора сульфита железа закисного (FeSO4), 10 мл 10%-ного водного раствора сульфита натрия (Na2SO3), полимиксина М-200000 ЕД, сульфата неомицина В —50 мг. Разливают в стерильные пробирки по 9 мл.

Голодный агар: 2 г агара расплавляют при нагревании в 98 мл дистиллированной воды. Стерилизуют при 121°С в течение 20 мин.

К средам для выращивания плесневых грибов относят агар Чапека, агар Сабуро, сусло-агар, среду Ван-Итерсона.

Агар Чапека рекомендуется применять для выращивания многих видов грибов. В состав среды входят: 1000 мл воды, 30 г глюкозы, 2 г нитрата натрия, 1 г дигидрофосфата калия, 0,5 г сульфата магния, 0,5 г хлорида калия, 0,0012 г сульфата железа и 20 г агара. Среду стерилизуют при давлении 0,5 атм. 30 мин.

Агар Сабуро применяют при выращивании возбудителей дерматомикозов и кандидамикозов. В состав среды входят:

1000 мл воды, 40 г глюкозы, 10 г пептона и 18 г агара. После стерилизации рН питательной среды должен быть в пределах 6,5.

Сусло-агар применяют при выращивании возбудителей дерматомикозов и кандидамикозов. Солодовое неохмеленное сусло разбавляют водой в соотношении 1:2, устанавливают рН 6,5– 6,7, добавляют 2% агара, кипятят, фильтруют, стерилизуют при давлении 0,5 атм. 30 мин.

Среда Ван-Итерсона предназначена для выделения из кормов токсичных грибов, вызывающих стахиботриотоксикоз, дендродохиотоксикоз и др. К 1000 мл воды добавляют 0,5 г нитрат аммония и 0,5 г дигидрофосфат калия. Среду стерилизуют при давлении 1 атм. 30 мин. Полученной средой увлажняют фильтровальную бумагу в чашке Петри и делают посев изучаемых кормов.

План работы.

1. Ознакомиться с компонентами питательных сред, с рецептурой приготовления МПБ, МПА. Подготовить и взвесить по рецепту сухой агар-агар, пептон, поваренную соль; отмерить мясной экстракт мерными мензурками; соединить все компоненты в колбе и поставить в кипящую водяную баню.

2. Разлить приготовленный МПА в пробирки по 5 и 13 мл; закрыть пробками и подготовить для автоклавирования. Одну пробирку для проверки качества агар-агара скосить, охладить и убедиться в плотности среды.

3. Ознакомиться с фабричными питательными средами, приготовить из них агар Эндо, агар Левина, висмут-сульфитный агар, среду Вильсона — Блера по прописи указанной на этикетке, разлить в чашки Петри.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Как готовят мясную воду?

2. Какие среды относятся к обычным, общеупотребительным? Каково их назначение?

3. Какие среды относятся к дифференциально-диагностическим?

Каково их назначение?

4. Какие компоненты придают селективность элективным питательным средам?

5. С какой целью добавляют ингибиторы в питательные среды?

6. Почему посевы в МПЖ нельзя культивировать в термостате?