ТЕМА 8

Методы культивирования

аэробных, микроаэрофильных

и анаэробных бактерий

Цель занятия: ознакомиться с методами культивирования

аэробных, микроаэрофильных и анаэробных микроорганизмов; изучить методы создания анаэробиоза для культивирования анаэробных микроорганизмов.

Материальное обеспечение: набор пробирок с посевами мик

роаэрофильных, капнофильных бактерий — возбудителей Brucella, Сampylobacter; набор стерильных питательных сред для культивирования анаэробов и демонстрационных посевов анаэробов на следующих питательных средах: МППБ, мозговая среда и молоко высоким столбиком в пробирках со слоем вазелинового масла, сахарный агар в трубочках Вейона, кровяной агар в чашках Петри, среда Вильсона — Блера. Во всех перечисленных средах должен быть характерный рост микроорганизмов; анаэростат, масляный вакуумный насос, эксикатор с притирающейся крышкой.

Многие бактерии удовлетворяют свои энергетические потребности за счет дыхания, в процессе которого кислород выступает в качестве терминального акцептора электронов и протонов в дыхательной цепи. В соответствии с потребностями в молекулярном кислороде бактерии разделяют на пять основных групп.

1. Облигатные (строгие) аэробы способны получать энергию только путем дыхания и поэтому обязательно нуждаются в молекулярном кислороде.

2. Облигатные (строгие) анаэробы. К ним относятся бактерии, у которых энергетический и конструктивный метаболизм происходит без кислорода. Рост строгих анаэробов может быть остановлен даже при незначительном содержании кислорода, поскольку у них отсутствуют ферменты (пероксидаза, каталаза и супероксид дисмутазы), расщепляющие токсические соединения кислорода.

3. Факультативные анаэробы растут как в присутствии, так и в отсутствии кислорода, так как они могут в зависимости от наличия или отсутствия кислорода осуществлять брожение или дыхание.

4. Микроаэрофильные бактерии хотя и нуждаются в кислороде для получения энергии, не могут размножаться без повышенного содержания СО2, поэтому они известны как капнофильные микроорганизмы (от греч. kapnos — дым и philos — любовь). К микроаэрофилам относят большинство аэробных бактерий, например бактерии родов Brucella, Сampylobacter, Helicobacter и Neisseria.

5. Факультативные аэробы способны культивироваться и в отсутствии кислорода. Бактерии могут существовать в среде, содержащей кислород, только при наличии толерантности к кислороду, которая связана со способностью бактериальных ферментов нейтрализовать токсичные соединения кислорода.

Методы культивирования аэробных, факультативно-анаэробных и микроаэрофильных бактерий.

При выращивании аэробных и факультативных анаэробов аэрация происходит в естественных условиях без применения каких-либо дополнительных приборов и приемов. В пробирки с посевами, закрытые ватными пробками, и в чашки Петри, прикрытые крышками, воздух хорошо проникает внутрь, что позволяет бактериям нормально развиваться.

Хотя микроаэрофильные бактерии по типу дыхания аэробы, они растут не в обычной атмосфере (21% кислорода), а с пониженным содержанием молекулярного кислорода. Например, Campylobacter fetus растет в атмосфере, содержащей 5–10% кислорода. Такую атмосферу можно создать в герметичных термостатах, анаэростатах, заменяя часть воздуха сжатым оксидом углерода из баллона, или в обычном эксикаторе. В последнем случае пробирки с посевами помещают в герметичный эксикатор, в котором зажигают свечу или комочек ваты, смоченный

спиртом. Пламя затухает по мере выгорания кислорода, и снижения его концентрации достаточно для роста микроаэрофилов.

Для культивирования Campylobacter fetus чаще используют полужидкий 0,2–0,4%-ный мясопеченочный агар высоким столбиком благодаря особой консистенции. Конвекционные потоки не способны перемешивать верхние, богатые кислородом слои среды с нижними, что создает в среде, заполняющей пробирку, нужный градиент концентрации кислорода. Культуру микроаэрофилов вносят в пробирку с питательной средой уколом, в дальнейшем микроорганизм растет в зоне с оптимальным содержанием кислорода, обычно в виде серо-белого диска в верхнем слое питательной среды.

Возбудители бруцеллеза (B. abortus, B. ovis) относятся к микроаэрофилам и при первичном выделении из патматериала требуют повышенного содержания в атмосфере оксида углерода до 10–15%. Поэтому в боксах бруцеллезных лабораторий стоят аппараты Кипа, из которых подается оксид углерода в пробирки с посевами бруцелл. Посевы при этом закрывают не ватно-марлевыми, а плотнорезиновыми пробками.

Методы создания анаэробиоза при культивировании строгих анаэробов.

Для культивирования строгих анаэробных микроорганизмов необходимо отсутствие кислорода и низкая величина окислительно-восстановительного потенциала (Eh, ОкВП). Строгие анаэробы погибают при наличии незначительных концентраций кислорода, умеренные менее чувствительны, а факультативные анаэробы могут расти в условиях обычной атмосферы (например, молочнокислые).

Для создания анаэробных условий применяют особые методы, обеспечивающие снижение парциального давления кислорода в питательной среде или окружающем пространстве, а также поддерживают полную герметизацию посевов от проникновения воздуха из окружающей среды. В некоторых случаях анаэростат заполняют газовой смесью, состоящей на 80–90% из азота и на 10–20% из СО2, до давления около 500 мм ртутного столба, что исключает диффузию воздуха вовнутрь.

1. Физические методы создания анаэробиоза основаны на том, что из замкнутого пространства (анаэростат или эксикатор), в которое поместили посевы с анаэробами, выкачивают воздух при помощи масляного вакуумного насоса. При помощи этих насосов можно достигнуть вакуума до 3–4 мм ртутного столба. Степень разрежения воздуха в анаэростате показывает ртутный манометр, укрепленный на крышке анаэростата. По" сле выкачивания воздуха кран закрывают, а прибор ставят в термостат при 37°С.

2. Химические методы создания анаэробиоза основаны на том, что кислород, находящийся в эксикаторе или анаэростате, связывают химическими препаратами. Например, на дно эксика" тора или анаэростата помещают порошок пирогаллола и 10%"ный раствор едкого натрия (калия), при взаимодействии которых свя" зывается весь кислород из замкнутого пространства.

3. Биологический метод создания анаэробиоза возможен при совместном выращивании аэробных и анаэробных микро" организмов. Например, в центре чашки Петри с сахарным кро" вяным агаром удаляют полоску среды, далее на одну половину чашки делают посев аэробных бактерий (Serratiae marcescens, Bac. subtilis), а на другую половину — изучаемых анаэробов, затем края чашки герметизируют лейкопластырем. Этот ме" тод можно применять только для нестрогих анаэробных бак" терий.

4. Комбинированный метод заключается в том, что для большей надежности созданного анаэробиоза применяют одно" временно два метода. Например, вначале выкачивают воздух при помощи насоса, а остаток кислорода связывают химиче" ским методом или культивированием в замкнутом простран" стве аэробных бактерий, поглощающих оставшийся кислород.

При культивировании анаэробов следует придерживаться следующих правил:

1) для выращивания анаэробов применяют только органи" ческие специальные питательные среды, в состав которых вхо" дят глюкоза и кусочки печени, мяса;

2) все жидкие питательные среды разливают высоким стол" биком, а для изоляции от кислорода воздуха на их поверхность наслаивают 2 мл вазелинового масла;

3) жидкие питательные среды перед посевом следует реге" нерировать в кипящей водяной бане в течение 20 мин для уда" ления воздуха;

4) исследуемый материал перед посевом следует прогревать в водяной бане в течение 20 мин при 80°С для уничтожения сопутствующей вегетативной микрофлоры.

К особенностям посева анаэробных микроорганизмов относится то, что исследуемый материал в питательные среды вносят в больших дозах, поэтому инструментом для посева анаэробов служат не бактериологические петли, а пастеровские пипетки.

Питательные среды, применяемые для культивирования анаэробов, делят на:

1) накопительные — для первичного посева;

2) дифференциальные, позволяющие дифференцировать один вид анаэробных микроорганизмов от другого.

К накопительным средам относится мясопептонный печеночный бульон (МППБ) или среда Китта — Тароцци. В результате размножения анаэробов на этой среде уже в первые сутки появляется помутнение, у некоторых — газообразование, а иногда и специфический запах.

На плотных дифференциальных средах анаэробы образуют поверхностные и глубинные колонии, характерные для каждого вида, что позволяет дифференцировать их друг от друга по культуральным признакам, а на некоторых дифференциальных средах одновременно изучают и ферментативные свойства. Методические приемы позволяют выращивать строгие анаэробы без использования анаэростата.

К дифференциальным средам относятся сахарный агар, глюкозо-кровяной агар, среда Вильсона — Блера, мозговая среда, молоко.

Сахарный агар перед посевом расплавляют, добавляют исследуемый материал, перемешивают и всасывают в тонкие трубки Вейона длиной до 20–25 см, диаметром — около 1 см. Один конец трубки запаивают, другой закрывают ватой и помещают в обычный термостат на сутки. На этой среде изучают газообразование (разрыв агара) и форму изолированных глубинных колоний, которые просматриваются при помощи лупы в глубине агара. Для некоторых анаэробов характерно образование колоний в виде двояковыпуклой линзы (диска), колоний с тонкими отростками, в виде комочка ваты и т. д.

На глюкозо-кровяном агаре можно одновременно изучить форму колоний на поверхности питательной среды и гемолитические свойства выделенного возбудителя. Чашки Петри с посевами анаэробов на поверхности питательной среды при культивировании обязательно ставят в анаэростат или термоанаэростат.

В среде Вильсона — Блера или железо-сульфитном агаре (ЖСА) анаэробные бактерии восстанавливают сульфит натрия до сульфата натрия, который, вступая в реакцию с хлоридом железа, образует черный осадок сульфита железа, окрашивающий изолированные колонии в черный цвет, — это дифференциальный признак.

В подготовленную чашку Петри наливают исследуемый материал, заранее распределенный в расплавленном ЖСА. Для создания строгих анаэробных условий застывший агар с посевом заливают слоем голодного агара. Большинство анаэробов образуют колонии в течение 20–24 ч, а для Cl. perfringens характерно появление черных колоний уже через 6–8 ч после посева.

Мозговая среда готовится из свежего мозга крупного рогатого скота: в две части фарша из мозга и одной части воды, добавляют сульфит натрия с хлоридом железа, как в ЖСА. Смесь раскладывают высоким столбиком в пробирки, поверхность заливают 2 мл вазелинового масла, автоклавируют при 110°С в течение 2 ч. Дифференциальным признаком при росте анаэробов на этой среде является ее почернение.

Молоко. К обезжиренному молоку добавляют кусочки печени, сыворотку крови, разливают высоким столбиком, наслаивают 2 мл вазелинового масла и дробно стерилизуют. Дифференциальным признаком является скорость свертывания молока, характер створаживания и пептонизация его.

План работы.

1. Ознакомиться с правилами работы с масляным вакуумным насосом при создании вакуума в анаэростате, а также методом создания анаэробных условий в эксикаторе.

2. Ознакомиться с набором питательных сред для культивирования анаэробов и методами культивирования их в эксикаторе и анаэростате, а также с особенностями техники посева анаэробных микроорганизмов в специальные питательные среды.

3. Ознакомиться с культуральными свойствами анаэробов на демонстрационных посевах анаэробов в питательные среды.

Изучить признаки роста анаэробов, являющихся дифференци- альными для анаэробных микроорганизмов.

4. Ознакомиться с культуральными свойствами микроаэро- фильных, капнофильных бактерий — возбудителей Brucella, Сampylobacter на демонстрационных посевах, разлитых высо- ким столбиком в питательные среды. Найти и изучить призна- ки их роста, являющиеся дифференциальными.

5. Провести микроскопию готовых препаратов и ознако- миться с морфологией микроаэрофильных, капнофильных, ана- эробных микроорганизмов.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Перечислите методы создания анаэробиоза и дайте краткую ха-

рактеристику каждому из них.

2. Перечислите требования, предъявляемые к питательным средам

для культивирования анаэробов.

3. Методические особенности посева анаэробных микроорганизмов.

4. С какой целью делают посев анаэробов на поверхность кровяного

агара?

5. Какие культуральные особенности роста у микроаэрофильных,

капнофильных бактерий?