Цель занятия: овладеть техникой посева бактерий на плот

ные и жидкие питательные среды; освоить методы выделения чистых культур микроорганизмов.

Материальное обеспечение: пробирки со смесью двух куль

тур S. aureus и E. coli в физрастворе; чашки Петри с МПА для выделения чистой культуры S. aureus методом Дригальского; чашки Петри с агаром Эндо для выделения чистой культуры E. coli методом Дригальского; пустые пробирки для имитации посева над пламенем спиртовки; бактериологические петли; спиртовки; микроскопы; набор красок для окраски по Граму; предметные стекла; иммерсионное масло.

Техника посева бактерий на питательные среды.

Все микробиологические исследования проводят в специальных помещениях — боксах. Посевы и пересевы проводят над пламенем спиртовки, инструментами для посева служат бактериологические петли, иглы и пастеровские пипетки.

При посеве бактерий на питательные среды или пересеве из одной пробирки в другую применяют следующую методику: пробирку с чистой культурой и пробирку со скошенным МПА берут в левую руку так, чтобы пробирка с чистой культурой была первой по отношению к работающему. В правой руке находятся бактериологическая петля, которую держат как карандаш, и две пробки от открытых пробирок, зажатые мизинцем и безымянным пальцем. Обжигают края открытых пробирок и вводят прокаленную петлю в пробирку с культурой. Петлю охлаждают о внутреннюю

стенку пробирки или прикасаются к участку незасеянного агара и, если он не плавится, захватывают петлей часть бактериальной культуры. Быстро и осторожно вносят петлю с культурой в пробирку со стерильной средой, опускают до дна косяка (где конденсат) и зигзагообразным движением петли распределяют материал вверх по скошенной поверхности агара. После посева петлю извлекают, обжигают края пробирок и последовательно закрывают их слегка обожженными пробками, выводя пробирки из пламени по направлению к себе, затем прокаливают петлю.

Для посева в жидкие питательные среды применяют методику, описанную выше, только петлей в глубине среды делают несколько вращательных движений.

Посев на плотные среды в чашках Петри проводят также бактериологической петлей или стеклянным шпателем. Для этого крышку чашки Петри чуть приподнимают левой рукой, вводят под крышку бактериологическую петлю с посевным материалом и распределяют по поверхности среды различными методами в зависимости от конечной цели: «штрихом» до истощения посевного материала для получения изолированных колоний или делают сплошной посев «газоном».

Для выращивания микроорганизмов в лабораторных условиях применяют термостат, в котором круглосуточно автоматически поддерживается постоянная температура.

Термостат представляет собой двустенный шкаф с сетчатыми полками внутри и дверью, сделанными из теплоизолирующих материалов. Источником нагревания в термостате являются электронагревательные элементы, которые прогревают воду или воздух. Температура автоматически поддерживается на заданном уровне, для большинства патогенных микроорганизмов в пределах 37°С, для мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (МАФАнМ) — в пределах 30°С, так как эта температура является для них оптимальной. В термостат помещают штативы с пробирками, колбы и чашки Петри с посевами изучаемых микроорганизмов.

Для успешного культивирования бактерий необходимо применять свежие питательные среды. Особенно это касается плотных питательных сред, которые разливают в чашки Петри или скашивают в пробирках обязательно в день посева, чтобы были видны капельки свежего конденсата.

Сроки культивирования большинства патогенных, условно-патогенных микроорганизмов составляют 24–48 ч, некоторые бактерии растут медленно, например, возбудитель туберкулеза до 10–14 дней и больше.

Для полного понимания бактериологических методов необходимо знать специальные термины, применяемые в лабораторной практике.

Посев — первичное внесение исследуемого материала в питательные среды, цель посева — выделение и накопление возбудителя для дальнейшего изучения. Пересев — перенос выросшей бактериальной культуры в новую питательную среду. Бактериальной культурой называют микроорганизмы, выросшие на искусственных питательных средах. Различают чистую бактериальную культуру, в которой все бактерии относятся к одному виду, и загрязненную, если в ней присутствуют неизвестные бактерии. Любое бактериологическое исследование начинают с выделения чистой культуры, так как только в чистой культуре можно определить вид возбудителя.

Перед началом работы пробирки с 5 мл МПА расплавляют в кипящей водяной бане, пробирку с горячим жидким агаром фиксируют в наклонном положении, чтобы получить скошенную поверхность, удобную для посева. Для этого конец пробирки с пробкой приподнимают и кладут на пластинку высотой 1–1,5 см, в результате на дне пробирки должен получиться столбик МПА высотой 3 см, переходящий в косяк. Пробирку с 13–15 мл МПА также расплавляют и выливают в стерильную чашку Петри, закрывают крышку, чашку ставят на ровную поверхность, и после охлаждения получается плотная пластинка среды, готовая для посева.

При посеве необходимо соблюдать следующие правила: работа должна проводиться в боксе, над пламенем спиртовки, петлей нельзя касаться посторонних предметов, а ватные пробки — класть на стол. Начинающим бактериологам нужно предварительно приобрести навыки работы с пустыми пробирками, одновременно держа в левой руке три пробирки, а в правой — бактериологическую петлю и три пробки, имитируя процесс посева над пламенем спиртовки, открывая и закрывая пробирки, манипулируя бактериологической петлей.

Методы выделения чистых культур бактерий.

Обычно исследуемый материал, содержащий возбудителя инфекционной болезни или возбудителя пищевых токсикоинфек- ций, загрязнен сопутствующей микрофлорой, поэтому выделе- ние чистой культуры из исследуемого материала является основ- ной задачей при проведении бактериологического исследования.

Морфологические, культуральные и ферментативные осо- бенности микроорганизмов, необходимые для определения вида микроорганизма, изучают, применяя только чистые культу- ры бактерий.

В лабораторной практике применяются механические и био- логические методы выделения чистой культуры.

I. Механические методы выделения чистых культур основа- ны на механическом разъединении бактерий друг от друга. В ис- тории микробиологии известны методы Пастера, Коха, но в ла- бораторной практике чаще применяют метод Дригальского. Суть метода заключается в том, что бактериологической петлей кап- лю исследуемого материала (кровь, гной и т. д.) наносят на по- верхность плотной среды в чашке Петри и распределяют мето- дом штриха так, чтобы механически разъединить бактерии, ка- ждая из которых должна образовать изолированную колонию.

Бактерии, оставшиеся на поверхности питательной среды, размножаются поперечным делением со скоростью 20–30 мин, поэтому за сутки образуют видимую колонию. При этом надо учитывать, что одна бактерия образует одну колонию, поэтому все бактерии в этой колонии будут принадлежать одному виду. После посева чашку маркируют, ставят в термостат вверх дном, чтобы конденсат не размыл посевы, при 30°С или 37°С на 24 ч. Появившиеся колонии изучают с помощью лупы, нужную ко- лонию обводят восковым карандашом со стороны дна чашки, готовят из нее мазок и окрашивают по Граму. Далее, чтобы полу- чить чистую культуру, из выбранной колонии бактериологиче- ской петлей делают пересев на МПА и МПБ в пробирках, посе- вы культивируют в термостате. На следующий день из вырос- шей культуры делают препарат для микроскопии и, убедившись в том, что выделенная бактериальная культура морфологиче- ски однородная, приступают к изучению ее морфологических, тинкториальных, культуральных, ферментативных свойств для идентификации, или определения вида.

II. Биологические методы выделения чистых культур основаны на учете биологических особенностей бактерий, таких как устойчивость к высокой температуре и кислоте, подвижность, а также их патогенность.

1. При применении высокой температуры для выделения чистой культуры термоустойчивых микроорганизмов исследуемый материал прогревают 10–20 мин при 80°С в расчете на то, что менее стойкие вегетативные формы погибнут при этой температуре, а споры останутся жизнеспособными. Из прогретого материала делают первичный посев в питательные среды методом Дригальского, далее из изолированных колоний термоустойчивых микроорганизмов делают пересев в пробирки с МПА и МПБ и получают чистую культуру спорообразующего возбудителя.

2. Для выделения чистой культуры кислотоустойчивых возбудителей туберкулеза патологический материал обрабатывают 5–10%-ным раствором серной кислоты в течение 10–15 мин. Благодаря действию кислоты погибает сопутствующая микрофлора, а возбудитель туберкулеза остается жизнеспособным. После нейтрализации раствора кислоты 1%-ным раствором гидроксида натрия исследуемый материал вносят на специальные питательные среды, на которых растут возбудители туберкулеза.

3. Для выделения чистой культуры патогенных микроорганизмов, находящихся в загрязненном исследуемом материале, проводят заражение молодых восприимчивых лабораторных животных (кролики, морские свинки, белые мыши). Организм животного здесь играет роль «биологического фильтра», через ткани которого проходят патогенные микроорганизмы, вызывающие гибель животного. После заражения и гибели животных трупы вскрывают и из всех внутренних органов делают препараты на предметном стекле, а также посевы на питательные среды. Полученную чистую культуру изучают и определяют вид возбудителя.

4. Выделение подвижных микроорганизмов методом Щукевича. С поверхности исследуемого материала (мясо, колбаса), петлей делается соскоб, который вносят в конденсат скошенного МПА, пробирку ставят в термостат при 37°С на 24 ч. Если в исследуемом материале были подвижные палочки Proteus vulgaris,

они дают характерный ползучий рост вверх по скошенному агару, из появившихся колоний делают посев на питательные среды, получают чистую культуру и определяют ее вид. Наличие P. vulgaris в исследуемом материале свидетельствует об антисанитарных условиях хранения продуктов питания.

План работы.

1. Приготовить препараты из смеси двух бактериальных культур — S. aureus и E. coli, окрасить по Граму, провести микроскопию и убедиться в наличии смешанной культуры.

2. Провести имитацию посева бактериологической петлей в пустые пробирки над пламенем спиртовки, научиться держать три пробирки в левой руке, бактериологическую петлю и пробки — в правой руке. Научиться открывать и закрывать пробки над пламенем спиртовки.

3. Далее работают две бригады: одна с МПА, другая с агаром Эндо.

3.1. Провести посев смеси двух культур методом Дригальского на поверхность МПА в чашках Петри для получения изолированных колоний и выделения чистой культуры S. aureus, образующей колонии желтого цвета.

3.2. Провести посев смеси двух культур на поверхность агара Эндо для получения изолированных колоний и выделения чистой культуры E. coli, которая образует красные колонии с металлическим блеском.

4. Овладеть методикой посева исследуемого материала в конденсационную воду скошенного МПА с целью получения чистой культуры P. vulgaris.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. С какой целью выделяют чистую культуру микроорганизмов?

2. Перечислите методы выделения чистых культур бактерий.

3. На чем основаны механические методы выделения чистых

культур?

4. На чем основаны биологические методы выделения чистых культур, такие как заражение лабораторных животных?

5. На чем основан метод получения чистой культуры спорообразующих бактерий и вульгарного протея?