ТЕМА 11
Ферментативные свойства бактерий
Цель занятия: освоить методы изучения ферментативных
(биохимических) свойств микроорганизмов, таких как сахаролитические, протеолитические, гемолитические; научиться дифференцировать бактерии по ферментативным свойствам.
Материальное обеспечение: набор сред Гисса (или короткий
пестрый ряд) с демонстрационными посевами Salmonella, E. coli; агар Эндо с посевом кишечной палочки и сальмонеллы, колонии которых наглядно, в виде слов E. coli и Salmonella, написаны бактериологической петлей, содержащей соответствующую культуру; чашки Петри от прошлого занятия с посевами отпечатков пальцев рук студентов; бактериологические петли; спиртовки; набор красок для окраски по Граму; предметные стекла; иммерсионное масло; микроскопы; таблицы: «Биохимическая дифференциация бактерий семейства Enterobacteriaceae», «Среды Гисса (короткий и длинный пестрый ряд)».
К настоящему моменту студенты знакомы с морфологическими, тинкториальными, культуральными признаками бактерий, при помощи которых можно провести идентификацию. Однако мир микроорганизмов так сложен, что различные виды микроорганизмов могут обладать одинаковыми перечисленными признаками, и только по набору ферментов их можно дифференцировать друг от друга.
Ферментативные свойства — это способность бактерий при помощи различных ферментов расщеплять сложные органические соединения. Каждый вид микроорганизмов синтезирует
определенный набор ферментов, эта способность генетически закреплена, поэтому по наличию или отсутствию фермента можно провести идентификацию микроорганизмов. Для изу- чения ферментативных свойств микроорганизмов готовят пи- тательные среды строго определенного состава, в которые вно- сят изучаемую культуру микроорганизмов и наблюдают за по- являющимися изменениями.
В лабораторной практике при идентификации чаще приме- няют изучение сахаролитических, протеолитических и регене- рирующих свойств микроорганизмов.
Сахаролитические свойства бактерий изучают на жидких, полужидких (среды Гисса) и плотных питательных средах (сре- ды Эндо, Левина, Плоскирева). Наличие синтезируемого фер- мента определяется по:
- изменению физического состояния питательной среды (на-
личие пузырьков газа в поплавках или в полужидкой сре-
де, свертывание молока);
- изменению рН среды и цвета индикатора в дифференциаль-
но-диагностических средах (агаре Эндо, Левина, Плоскире-
ва, среде Гисса с различными углеводами).
В бактериологической лаборатории в наличии всегда долж- ны быть следующие индикаторы:
1) индикатор Андраде готовят по следующей методике: 1 г кислого фуксина растворяют в 400 мл Н2О и 64 мл нормально- го раствора едкого натра, выдерживают сутки в термостате при 37°С. Хранят во флаконах из темного стекла. При приготовле- нии сред Гисса добавляют 1% индикатора. Данные среды при добавлении щелочи окрашиваются в желтый цвет; расщепле- ние углевода до кислоты приводит к покраснению питатель- ной среды;
2) индикатор ВР применяют при приготовлении сухих сред Гисса. В щелочной, т. е. в свежеприготовленной питательной среде, он имеет розовый цвет; при появлении кислых продук- тов изменяет цвет от голубого до синего;
3) тест с метиловым красным показывает появление ки- слоты в среде после расщепления глюкозы. Исследуемую куль- туру выращивают 2–5 сут. в жидкой среде Кларка с глюкозой, в которую добавляют 5–6 капель раствора метилрота, который, как индикатор, проявляет себя в интервале рН от 4,4 до 6,0.
Положительным результатом является покраснение среды после внесения индикатора.
Для приготовления среды Кларка в 1000 мл дистиллированной воды добавляют 5 г пептона, 5 г гидрофосфата калия и 5 г глюкозы. Все компоненты растворяют в воде, кипятят 2– 3 мин, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 6,9–7,0. Далее разливают по 5 мл в пробирки и стерилизуют при 112°С 20 мин.
Тест Фогеса — Проскауера выявляет промежуточный продукт расщепления глюкозы — ацетоин (ацетилметилкарбинол). Для проведения теста исследуемую культуру выращивают на среде Кларка. Затем к 1 мл культуры добавляют 0,6 мл 5%-ного раствора a-нафтола, перемешивают и вносят 0,2 мл 40%-ного раствора гидроксида калия и инкубируют 1 ч. Положительная реакция — окрашивание питательной среды в красный цвет, отрицательная реакция — желтое окрашивание.
Обычно ферментация углеводов происходит за 24–48 ч, но при использовании длинного пестрого ряда учет результатов проводят через 7–14 сут., так как некоторые углеводы расщепляются медленно. Бактерии, имеющие определенные ферменты, расщепляют углеводы и высшие спирты до альдегидов, кислот и даже до СО2, который улавливают в маленьких пробирках, перевернутых вверх дном (их называют поплавками), помещенных в обычные пробирки с жидкой средой, или образовавшиеся пузырьки газа фиксируются в толще полужидких сред Гисса.
При отсутствии ферментации углевода цвет среды не изменяется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только некоторые углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина. Поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором был назван «пестрым рядом».
На плотных дифференциально-диагностических средах, в состав которых входят углеводы и индикатор, вырастают колонии, имеющие различную окраску. Например, E. coli, ферментирующая лактозу до молочной кислоты, изменяющая рН в кислую сторону, на агаре Эндо образует красные колонии, а Salmonella, не синтезирующая фермент, — бесцветные колонии.
Дифференциация основана на углеводе лактозы, для расщепления которой только у кишечной палочки есть необходимый фермент, поэтому в состав дифференциально-диагностических сред обязательно включают лактозу (табл. 4).
Способность E. coli расщеплять лактозу до кислоты и газа применяется на средах Эндо, Левина, Плоскирева, а также при санитарно-микробиологическом исследовании пищевых продуктов, смывов с поверхности производственного оборудования на среде Кесслера. Кроме этого, при анализе данных табл. 4 видно, что ферментативная активность представленных бактерий обратно пропорциональна их патогенности.
Протеолитические свойства бактерий изучают на средах, в состав которых входят белки — это молоко, МПЖ, МПБ. Протеолитические ферменты расщепляют белки до промежуточных (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или конечных (сероводород, индол, аммиак) продуктов.
Под действием протеолитических ферментов происходит глубокое расщепление казеина молока, пептонизация и просветление сгустка (известны бактерии из рода клостридий, вызывающих пептонизацию без свертывания); молочнокислые бактерии, ферментирующие молочный сахар (лактозу) до молочной кислоты, вызывают кислотное свертывание молока, что используется в молочной промышленности при получении кисломолочных продуктов, творога и сыра.
Тест на желатиназу: делают посев изучаемых бактерий уколом в глубину столбика МПЖ. Посевы оставляют при комнатной температуре и наблюдают 5–7 дней за появляющимися изменениями, при этом изучают не только разжижение среды, но и его особенности. Под действием желатиназы может происходить необратимое разжижение на поверхности в виде воронки, если это аэробные, и в глубине среды, если это анаэробные бактерии.
При глубоком расщеплении белка до конечных продуктов выделяются индол, аммиак и сероводород. Для выявления этих газов высоко над засеянной средой между стенкой пробирки и самой пробкой фиксируют полоску индикаторной бумаги, по! севы ставят в термостате в течение 1–3 сут., максимум 6 сут.
Первый тест на индол: индикаторную полоску, пропитан! ную насыщенным раствором щавелевой кислоты, фиксируют над посевом в МПБ. При выделении индола, на 2–3!й день после посе! ва, нижняя часть индикаторной бумаги приобретает розовый цвет.
Второй тест на индол: к культуре, выращенной в бульоне Хоттингера, добавляют 1–3 мл эфира, встряхивают, отстаива! ют и вносят 0,5 мл реактива Эрлиха (в 9 мл 96%!ного этанола добавляют 1 г парадиметиламино!бензальдегида и 20 мл соля! ной кислоты). Через 5 мин получают результат. При наличии индола на границе эфира и питательной среды появляется крас! но!фиолетовое окрашивание.
Тест на аммиак: над посевом в МПБ фиксируют розовую лакмусовую полоску индикаторной бумаги, которая при выде! лении аммиака через 1–5 сут. синеет.
Тест на сероводород: над посевом фиксируют полоску бу! маги, пропитанную 5%!ным раствором ацетата свинца. При взаимодействии сероводорода с уксуснокислым свинцом бума! га чернеет за счет образования сульфида свинца.
Тест на каталазу, который образуют аэробные бактерии: бактериальную массу снимают с поверхности агара бактерио! логической петлей и суспендируют в капле 3%!ного раствора перекиси водорода. Если изучаемая культура выделяет катала! зу, в капле появятся пузырьки.
Для проведения теста на оксидазу необходима индикатор! ная бумага, пропитанная 1%!ным раствором тетраметилпара! фенилендиамина дигидрохлорида. Бактериальную массу изу! чаемой культуры петлей наносят на поверхность индикатор! ной бумаги, в положительном случае через 10–60 с появляется фиолетовое или пурпурное окрашивание.
Тест на редукцию нитратов выявляет восстановление нит! ратов до нитритов. Изучаемую культуру засевают в МПБ, со! держащий 0,2% нитрата калия, культивируют 48–72 ч, затем в опытную и контрольную пробирки добавляют по 1 мл реак! тива с крахмалом (в 100 мл Н2О добавляют 1 г растворимого
крахмала и 0,5 г йодида калия, перед постановкой реакции к этому раствору добавляют несколько капель 10%-ного раствора соляной кислоты). В положительном случае среда окрашивается в темно-синий цвет.
Тест на общую фосфатазу: исследуемую культуру микроорганизмов засевают штрихом на поверхность МПА с натриевой солью дифосфата фенолфталеина и инкубируют 4–5 сут. Чашки переворачивают вниз крышкой, на внутреннюю поверхность которой наносят каплю 28–30%-ного раствора нашатырного спирта. При наличии фосфатазы колонии окрашиваются в красный цвет.
Тест на редуцирующую способность бактерий: готовят молоко с метиленовой синью (1000 мл молока подщелачивают добавлением 10%-ного раствора карбоната натрия до рН 7,2 и вносят 20 мл 1%-ного водного раствора метиленового синего), молоко приобретает голубой цвет, далее его разливают в пробирки по 7–8 мл и дробно стерилизуют. Изучаемую культуру вносят в такое молоко, сутки культивируют в термостате и учитывают результаты. Если культура обладает редуцирующими свойствами, метиленовая синь восстанавливается и молоко обесцвечивается.
В настоящее время биологическая промышленность выпускает тест-системы для быстрой идентификации бактерий по группе специально отобранных ферментативных признаков. Они представляют собой пластмассовые пластины с микропробирками, заполненными различными сухими средами, в которые вносят суспензию исследуемой культуры и после инкубирования в термостате учитывают результаты. К тест-системам прилагаются таблицы для учета результатов и идентификации микроорганизмов в зависимости от спектра выявленных ферментов.
Нижегородский институт микробиологии и эпидемиологии выпускает следующую тест-систему: биохимические пластины для идентификации энтеробактерий (ПБДЭ). Также разработаны тест-системы для санитарно-микробиологических целей.
За рубежом разработаны тест-системы для идентификации энтеробактерий, анаэробов, несбраживающих бактерий и т. д.
Таким образом, мы изучили морфологические, тинкториальные, культуральные и ферментативные свойства, освоили методические приемы, по которым можно провести идентификацию изучаемого микроорганизма.
План работы.
1. Освоить методы изучения ферментативных свойств E. coli и Salmonella на демонстрационных посевах на среды Гисса (короткий «пестрый ряд») и агаре Эндо. Определить вид «за- шифрованного микроба», посеянного в пробирки короткого «пестрого ряда» по изменению цвета индикатора и наличию газа в поплавках, используя данные биохимической диффе- ренциации.
2. На агаре Эндо провести дифференциацию колоний E. coli и Salmonella по их цвету. (Весьма наглядно получается, если слова Escherichia и Salmonella написать на поверхности агара бактериологической петлей, смоченной соответствующей куль- турой.)
3. Освоить методы изучения протеолитических свойств бак- терий в пробирках с МПЖ и с молоком, а также методику опре- деления выделения сероводорода, аммиака и индола изучаемы- ми микроорганизмами.
4. Ознакомиться с демонстрационными посевами: чашки Петри с кровяным агаром с зоной гемолиза вокруг колоний ста- филококков и с положительной реакцией плазмокоагуляции.
5. Изучить результаты посева пальцев рук на МПА в чашке Петри; обратить внимание на количество колоний; приготовить из них препараты; окрасить по Граму; изучить под микроско- пом; провести анализ.
6. Ознакомиться с тест-системами, выпускаемыми биологи- ческой промышленностью для быстрой идентификации бакте- рий по группе специально отобранных ферментативных при- знаков.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. С какой целью изучают ферментативные свойства бактерий?
2. Какие ферментативные свойства изучают у бактерий?
3. Наличие какого углевода имеет дифференциально-диагностиче-
ское значение в среде Эндо?
4. До каких конечных продуктов происходит расщепление углево-
дов и белков?
5. С какой целью изучают способность бактерий вызывать гемолиз
эритроцитов и коагулировать плазму крови кроликов?
6. Перечислите все изученные таксономические признаки.