ТЕМА 12

Серологическая диагностика

инфекционных болезней

сельскохозяйственных животных

Цель занятия: дать представление о сущности реакции пре

ципитации, применении ее в ветеринарно-лабораторной практике, получении и подготовке компонентов; освоить методы постановки реакции; ознакомить с различными модификациями проведения реакции преципитации.

Материальное обеспечение: уленгутовские пробирки в шта

тивах, пастеровские пипетки; диагностикумы: флакон с преципитирующей сибиреязвенной сывороткой с этикеткой; фабричная упаковка с ампулами сибиреязвенного антигена; две пробирки с экстрактом из кожевенного сырья — положительная и отрицательная пробы; демонстрация реакции диффузионной преципитации в агаровом геле микро-и макрометоды, чашки Петри; предметные стекла; соответствующие таблицы.

Серологическая (от лат. serum — сыворотка крови) диагностика основана на проведении различных серологических реакций. В основу практического применения этих реакций положен принцип тесной физико-химической связи между родственными антигеном и антителом. На основании данного принципа по одному известному компоненту можно сделать заключение о природе другого, т. е. природе неизвестного. Таким образом, во всех серологических реакциях участвуют два основных компонента — антиген и антитело, реакция между которыми осуществляется в электролитической среде. В качестве последней используют 0,85%-ный раствор поваренной соли (физиологический раствор).

Антигены — естественные или синтетические высокомолекулярные генетически чужеродные вещества, распознаваемые клетками организма и вызывающие иммунный ответ в виде образования антител (иммуноглобулинов Ig), появления сенсибилизированных лимфоцитов или развитии толерантности к данному антигену.

Реакции «антиген — антитело», происходящие in vivo, — это важнейший защитный механизм устранения множества антигенов, с которыми организм может встретиться в любой момент.

К антигенам, имеющим значение в ветеринарной микробиологии, относят живые и убитые микроорганизмы, их структурные образования (корпускулярные антигены), продукты их жизнедеятельности — токсины, ферменты, продукты метаболизма (растворимые антигены).

Антигены для проявления своего действия должны быть: § генетически чужеродными; § высокомолекулярными соединениями. Это, прежде всего,

белки (полноценные антигены) и полисахариды, липополисахариды и др. (неполноценные антигены — гаптены); § парентерально введены (попасть) в организм, т. е. минуя желудочно-кишечный тракт.

Полноценные антигены способны в организме животного вызывать образование антител (Ig), а также вступать с ними в реакцию in vitro.

Антитела — специфические белки (иммуноглобулины Ig), способные распознавать антиген и реагировать с ним, лишая его вредного воздействия на организм животного. Они вырабатываются зрелыми плазматическими клетками (В-лимфоцитами) и поступают из лимфоидной системы в кровь.

Серологические реакции используют для:

1) серодиагностики — выявления в сыворотке крови больного животного специфических антител к тому или иному антигену, микроорганизму;

2) сероидентификации — определения вида микроорганизма или неизвестного антигена по известному антителу.

В зависимости от физико-химического состава антигена, функциональных групп антител, участвующих в серологических реакциях, происходит строго специфическое взаимодействие

антигена с антителами: преципитация, агглютинация, лизис клеток, связывание комплемента и др. Все это позволяет использовать визуально видимый феномен в практических целях. Биологическая промышленность выпускает диагностические препараты — антигенные и антительные диагностикумы определенной специфической направленности. Так, при помощи этих препаратов можно идентифицировать неизвестный микроорганизм, обнаружить в исследуемой сыворотке специфические антитела и, следовательно, поставить диагноз, т. е. провести серологическую диагностику.

Сущность реакции преципитации состоит в осаждении (преципитации) антигена, находящегося в высокодисперсном состоянии, под воздействием специфических антител находящихся в иммунной сыворотке. В результате положительной реакции антиген переходит в грубодисперсное состояние и образуется видимый невооруженным глазом комплекс «антиген + антитело» в виде серо-белого диска (преципитат).

Растворимый антиген, участвующий в реакции, называется преципитиногеном, а антитела — преципитинами.

Антитела, реагирующие с растворенным антигеном, обеспечивающие выпадение мелкодисперсионного осадка комплекса «антиген — антитело» в среде электролита, называются преципитинами.

Реакция является высокочувствительным тестом, с помощью которого можно выявить наличие специфического антигена в разведении 1:100 тыс. и более, т. е. в столь малых количествах, в которых он не обнаруживается химическим путем. Реакция преципитации применяется для диагностики инфекционных болезней, вызываемых как бактериями, так и вирусами.

В ветеринарии РП широко используют для исследования кожевенного и мехового сырья, шерсти, мяса, загнившего патологического материала на сибирскую язву. Это особенно важно, когда не представляется возможным выделение самого возбудителя.

Бактериальные антигены, используемые для реакции преципитации, обладают устойчивостью к высокой температуре. Так, сибиреязвенный, чумной, туляремийный и другие антигены не разрушаются при кипячении в течение 45 мин, они сохраняются в гниющих субстратах.

Реакция преципитации применяется также в судебной медицине и ветеринарии для определения видовой принадлежности белка крови и в ветеринарно-санитарной практике для выявления фальсификации мясных, рыбных продуктов. С помощью этой реакции можно определить, из какого мяса (свиного, говяжьего, конины и др.) приготовлен тот или иной продукт.

Для ее проведения разработаны методы кольцепреципитации, диффузной преципитации, диск-преципитации.

Реакция кольцепреципитации.

Эта реакция была разработана А. Асколи в 1910 г. для исследования кожевенного сырья на сибирскую язву. Она получила также и другое название — асколизация кожевенного сырья.

Для ее проведения необходим ряд компонентов.

1. Экстракт из исследуемого сырья: кусочки исследуемой кожи, нанизанные на проволоку в виде кольца, стерилизуют в автоклаве при давлении 1,5 атм. 30 мин (для исключения заражения персонала лаборатории). Данные пробы охлаждают, измельчают, помещают в баночки и заливают 0,3%-ным карболизированным физиологическим раствором (на 1 г сырья — 9 мл). Продолжительность экстрагирования составляет 16–20 ч (холодный способ).

Пробы от свиных шкур и мяса экстрагируют горячим способом в водяной бане в течение 30 мин. Полученный материал фильтруют через асбестовую вату. Экстракт из исследуемого сырья должен быть прозрачным, поэтому даже при незначительном помутнении данную пробу необходимо перефильтровать. В экстракте, полученном из кожсырья больных животных, содержится сибиреязвенный антиген в высокодисперсном состоянии.

2. Сибиреязвенную преципитирующую сыворотку получают путем гипериммунизации лошадей на предприятиях биологической промышленности. Для этого лошадям-продуцентам внутривенно многократно (16–17 раз) вводят возбудитель сибирской язвы (антиген) с интервалом в 3–7 дней в нарастающих дозах — от 5 до 70 мл. Предварительно до гипериммунизации лошадей вакцинируют для создания грунд-иммунитета.

Через 10–14 дней после последнего введения антигена у лошадей берут кровь в количестве 5–6 л и отделяют преципитирующую гипериммунную сыворотку, содержащую противосибиреязвенные антитела. Полученную специфическую сыворотку консервируют 0,5% фенола и отстаивают в течение 2 мес., затем фильтруют через стерилизующие пластины и расфасовывают в стерильные флаконы (объем — 50 мл) с этикетками.

3. 0,85%-ный раствор поваренной соли (физраствор).

Для контроля используют следующие компоненты:

1) специфический сибиреязвенный антиген биофабричного изготовления, который представляет собой прозрачный обезвреженный экстракт, полученный из возбудителя сибирской язвы (в ампулах с этикеткой);

2) нормальная сыворотка в ампулах, фабричного изготовления, полученная от здоровых животных.

Методы постановки реакции преципитации.

1. Метод наслаивания: в уленгутовские пробирки наливают около 0,3 мл преципитирующей сыворотки (по стенке, чтобы остался мокрый след), затем осторожно по мокрому следу мелкими каплями наслаивают в таком же объеме исследуемый экстракт (антиген) так, чтобы получилась тонкая и четкая граница между двумя компонентами.

2. Метод подслаивания: в уленгутовские пробирки наливают около 0,3 мл исследуемого экстракта (антигена), затем под него подслаивают тонко оттянутой пастеровской пипеткой около 0,3 мл преципитирующей сыворотки.

Положительная РП характеризуется появлением в первые 1–2 мин (не позднее 10–15 мин) на границе двух компонентов тонкого серо-белого кольца — преципитата, состоящего из грубодисперсного комплекса «антиген + антитело».

При учете реакции штатив с пробирками держат на уровне глаз и просматривают на черном фоне в проходящем свете.

Любая серологическая реакция сопровождается контролем качества всех компонентов:

• преципитирующая сибиреязвенная сыворотка + физраствор — эталон отрицательной реакции;
• преципитирующая сибиреязвенная сыворотка + экстракт из

тканей здоровых животных — отрицательная реакция;

• преципитирующая сибиреязвенная сыворотка + специфический антиген — эталон положительной реакции; § нормальная сыворотка + экстракт из исследуемой кожи —

отрицательная реакция.

Реакция диск-преципитации.

Эта реакция используется при диагностике сибирской язвы и дифференциации ее возбудителя от подобных ему сапрофитных микробов рода Bacillus. Она основана на взаимодействии продуктов метаболизма нативных антигенов, растущих в жидкой питательной среде возбудителя сибирской язвы, с антителами преципитирующей сибиреязвенной сыворотки в слое агарового геля. При этом происходит образование диска преципитации в слое агарового геля, расположенного между антигеном и сывороткой.

Для постановки реакции диск-преципитации необходимы следующие компоненты:

1) преципитирующая сибиреязвенная сыворотка;

2) очищенный 1%-ный агаровый гель;

3) жидкая питательная среда для возбудителя сибирской язвы.

Техника проведения реакции диск-преципитации сводится к следующему: преципитирующую сибиреязвенную сыворотку разливают по 1 мл в стерильные бактериологические пробирки. На поверхность сыворотки наслаивают расплавленный и охлажденный до 15°С 1%-ный агаровый гель столбиком высотой 5–7 мм. На поверхность застывшего агара вносят 1–1,5 мл МПБ, засеянного исследуемой культурой. Посевы выдерживают в термостате при 37°C в течение 16–20 ч. Учет результатов проводят визуально на темном фоне.

Если исследуемая культура является возбудителем сибирской язвы, то в средней части столбика агарового геля образуется белая линия преципитации в виде диска с четкими границами.

Почвенные сибиреязвенные сапрофитные бациллы, за исключением нескольких штаммов Вас. anthracoides, дают отрицательный результат (диск преципитации отсутствует).

В качестве контроля при постановке реакции могут быть использованы посевы, сделанные из флакона с сибиреязвенной вакциной СТИ.

Реакция диффузионной преципитации (РДП).

Эта реакция нашла широкое применение при диагностике инфекционных болезней, для обнаружения антител в иссле- дуемой сыворотке крови и определения их титра, а также для установления токсигенности некоторых видов микроорганиз- мов и др.

Техника проведения этой реакции сводится к следующе- му: из агара фирмы «Дифко» готовится 1,5%-ный агар в фи- зиологическом растворе (рН 7,2–7,4) с добавлением мертио- лата (1:10000) как консерванта. В стерильные чашки Петри раз- ливают по 20–25 мл расплавленного агара слоем 3–6 мм. После застывания агара в его слое штампами с различным количест- вом пробойников вырезают лунки на расстоянии друг от друга 4–10 мм, в которые вносят по одной капле горячего агара для формирования дна лунки. Розлив компонентов реакции в лун- ки проводится различно в зависимости от методики и постав- ленных целей. Например, в центральную лунку (диаметр 16 мм) вносят иммунную сыворотку, в периферическую лунку (диа- метр 12 мм), исследуемые антигены или наоборот. Чашки с по- ставленной реакцией выдерживают 24–72 ч при комнатной тем- пературе.

За это время реагенты диффундируют в агар навстречу друг другу. При положительной реакции образуется комплекс Аг + Ат в виде линии преципитации серо-белого цвета в месте встречи или в зоне эквивалентного соотношения антигенов и антител. При учете реакции обращают внимание на число ли- ний преципитации, их расположение между лунками и отно- сительно друг друга. Характер взаимного расположения ли- ний преципитации зависит от состава анализируемых антиге- нов и сыворотки. Если линии преципитации сливаются, то анализируемые антигены идентичны, если пересекаются — неидентичны.

Эта реакция может быть осуществлена и микрометодом. В данном случае слой агара готовят на предметных стеклах, в котором делают лунки. В остальном эта реакция сходна с мак- рометодом.

План работы.

1. Ознакомиться с биопрепаратами для постановки РП.

2. Провести постановку и учет результатов реакции кольцепреципитации методами «наслаивания» и «подслаивания».

3. Ознакомиться с результатами готовой реакции диффузионной преципитации, поставленной для демонстрации.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Как называются компоненты в реакции преципитации?

2. Какова последовательность внесения компонентов при проведении РП методом наслаивания и подслаивания?

3. Какие изменения претерпевает высокодисперсный антиген под

действием специфических антител в РП?

4. При постановке РП проведен контроль: в пробирки внесли преципитирующую сыворотку и специфический антиген. Каков будет результат в этом контроле?