ТЕМА 13
Реакция агглютинации: пробирочный метод.
Другие модификации постановки реакции
Цель занятия: дать представление о сущности реакции
агглютинации, применении ее в ветеринарно-лабораторной практике, получении и подготовке компонентов; освоить методы постановки РА объемным (пробирочным) и капельным методами; ознакомить с различными модификациями проведения РА.
Материальное обеспечение: пробирки в штативе, пипетки
на 1 и 5 мл, физиологический раствор в колбах, бруцеллезная (позитивная) и нормальная (негативная) сыворотки, единый бруцеллезный антиген для РА и РСК; предметные стекла, пипетки, сальмонеллезный антиген-диагностикум биофабричного изготовления и специфические О-и Н-агглютинирующие сальмонеллезные сыворотки; для демонстрации: пробирки с положительной и отрицательной кольцевой реакцией с молоком на бруцеллез; плексигласовые панели с гемагглютинацией; роз-бенгал проба (РБП) на бруцеллез.
Агглютинацией называется склеивание микробных или других клеток при воздействии на них специфических антител в присутствии электролитов. Двухфазный характер этого взаимодействия ничем не отличается от механизма других двухкомпонентных реакций иммунитета: первая фаза — специфическая, невидимая, когда происходит взаимодействие бактерий с антителами; вторая фаза — неспецифическая, в процессе которой изменяется физико-химическое состояние реакционной жидкости, образуются видимые хлопья агглютината. Антиген, вступающий в реакцию, носит название агглютиногена, антитела сыворотки — агглютинины, а комплекс «антиген — антитело», выпадающий при положительной реакции, — агглютинат.
Реакция агглютинации используется для серологической диагностики многих инфекционных болезней, в том числе бруцеллеза, сальмонеллеза, колибактериоза, сапа, листериоза, кампилобактериоза и др.
Она проводится с двумя целями:
1) для обнаружения специфических антител в исследуемых сыворотках;
2) для установления вида (серогруппы, сероварианта) выделенного возбудителя из патологического материала с помощью известных сывороток, содержащих специфические антитела.
Агглютинация происходит при температуре 37°С в растворе электролитов (0,8%-ный раствор хлорида натрия), в слабощелочной среде (рН 7,2–7,4).
По характеру агглютинации разделяют на два вида.
1. Соматическую агглютинацию, когда происходит склеивание и оседание неподвижных, не имеющих жгутиков, микробов. Эта форма О-агглютинации протекает медленно, в течение 18–24 ч, и дает плотный осадок, который при встряхивании разбивается на мелкие зерна.
2. Жгутиковую агглютинацию, когда происходит склеивание и оседание подвижных, имеющих жгутики микробов. Эта форма Н-агглютинации происходит значительно быстрее, уже через 2–4 ч, и дает рыхлый осадок, который при встряхивании легко разбивается на крупные хлопья.
Существует множество вариантов постановки реакции агглютинации. Наиболее распространенными методами являются: классическая, развернутая реакция агглютинации, которая проводится в пробирках с различными разведениями сыворотки; на предметном стекле (капельная, пластинчатая: кровянокапельная гемагглютинация); роз-бенгал проба (РБП), кольцевая проба (реакция) с молоком и др.
Для серологической диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота в ветеринарной лабораторной практике применяется пробирочная РА, которую ставят в объеме 1 мл. Для
постановки РА с исследуемой сывороткой необходим ряд компонентов:
1. Исследуемая сыворотка крови. Кровь берут из яремной вены в пробирки с номером индивидуально у каждого животного. В лаборатории пробирки выдерживают для свертывания крови 45 мин при 30–37°С. Появившийся сгусток крови отделяют от стенок стальной спицей, а затем данные пробы помещают в холодильник при 4°С. Отстоявшуюся сыворотку отсасывают через 20–24 ч и переносят в сухие стерильные пробирки.
Исследуемые сыворотки для проведения РА, в зависимости от вида животного, разводят физиологическим раствором согласно наставлению.
2. Известный антиген представляет собой взвесь убитых бруцелл в физиологическом растворе в определенной концентрации (10 млрд/мл). Бруцеллезные антигены готовят и стандартизируют на биопредприятиях, разливают во флаконы с этикеткой.
3. 0,85%-ный раствор поваренной соли, рН 7,2–7,4 (физраствор).
Для контроля качества компонентов в поставленной РА используют:
1) позитивную (положительную) сыворотку в ампуле, полученную биопредприятием;
2) негативную (отрицательную) сыворотку крови здоровых животных в ампуле, полученную биопредприятием.
Для исследования каждой пробы сыворотки крови требуется пять пробирок, поставленных в первый ряд. Количество таких рядов зависит от числа исследуемых животных. Розлив компонентов реакции проводят индивидуальными мерными пипетками. В первой пробирке каждого ряда готовят основное разведение 1:25. Для этого к 2,4 мл физиологического раствора вносят 0,1 мл исследуемой сыворотки. После приготовления основного разведения сывороток в остальные пробирки (кроме второй) каждого ряда разливают по 0,5 мл физиологического раствора. Затем из первой пробирки с исходным разведением 1:25 переносят по 0,5 мл во вторую (пустую) и третью пробирки, получая разведение 1:25 и 1:50. Из третьей пробирки переносят 0,5 мл в четвертую, получая разведение 1:100, из нее в пятую по 0,5 мл, получая разведение 1:200. Из последней
пробирки (1:200) излишек жидкости — 0,5 мл — удаляют. Далее, добавив во все пробирки (кроме исходной) по 0,5 мл фабричного антигена, разведенного 1:10, получают ряд из четырех пробирок со следующим разведением исследуемых сывороток: 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 в объеме по 1 мл.
Первая пробирка с исходным разведением сыворотки 1:25 остается без антигена и служит контролем качества сыворотки. При наличии хлопьев, фибрина, эритроцитов и посторонних примесей результаты агглютинации не учитываются.
В табл. 5 представлена схема постановки пробирочной РА для серологической диагностики бруцеллеза.
При постановке РА одновременно с исследуемыми сыворотками ставят три контроля: § с негативной (отрицательной) сывороткой в тех же разведениях, как и с исследуемыми;
- с позитивной (положительной) сывороткой в разведениях
до ее предельного титра;
- контроль антигена (0,5 мл физиологического раствора с
0,5 мл разведенного антигена) для исключения спонтанной
агглютинации.
После розлива всех компонентов штативы с пробирками осторожно встряхивают и помещают в термостат при 37–38°С на 16–20 ч, затем выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и проводят учет реакции.
Результаты реакции учитывают визуально и определяют ее степень в плюсах по следующей схеме;
- (++++) — полное просветление жидкости; на дне осадок в
виде «зонтика», при легком встряхивании осадок разби$
вается на мелкие зерна, а жидкость остается прозрачной
(100%$ная агглютинация);
- (+++) — неполное просветление жидкости; «зонтик» хоро$
шо выражен, при встряхивании появляются мелкие зерна
(75%$ная агглютинация);
- (++) — незначительное просветление жидкости; «зонтик»
умеренно выражен, при встряхивании появляются мелкие
зерна (50%$ная агглютинация);
- (+) — едва заметное просветление жидкости; «зонтик» вы$
ражен слабо, при встряхивании заметно небольшое коли$
чество зерен (25%$ная агглютинация);
- (–) — просветление жидкости; образование «зонтика» не про$
изошло, на дне пробирки видна «пуговка» осевших микро$
бов, при легком встряхивании образуется равномерная взвесь.
За титр антител принимают последнее разведение сыворот$ ки, в котором произошла агглютинация не менее чем на два плюса (++).
Реакцию считают положительной при наличии агглютина$ ции с сывороткой крупного рогатого скота с оценкой не менее чем два плюса (++) в разведении 1:100 и выше.
Реакцию считают сомнительной при наличии агглютина$ ции только в разведении 1:50 с сыворотками крупного рогатого скота с оценкой не менее чем на два плюса (++).
При получении сомнительных результатов сыворотки кро$ ви животных повторно исследуют через 3–4 нед. (Шумилов К. В. и др., 1993).
Капельный метод РА применяют в основном для идентификации культур бактерий, а также для установления их принадлежности к определенным серогруппам и серовариантам. Техника постановки РА сводится к следующему: на предметное стекло раздельно наносят 2 капли — каплю известной агглютинирующей диагностической сыворотки (из флакона с этикеткой) и каплю физиологического раствора (контроль). Бактериологической петлей снимают с агара часть изучаемой бактериальной культуры, петлю увлажняют в капле сыворотки, затем культуру рядом с каплей растирают до гомогенного состояния, смешивают с сывороткой и, слегка покачивая, осторожно подогревают в пламени спиртовки до 37°С (не более). Если сыворотка и бактериальная культура специфичны друг другу, агглютинация наступает в ближайшие 2–3 мин. Агглютинация проявляется в виде склеивания бактериальных клеток и полного (или частичного) просветления жидкости в капле.
В контрольной капле — физраствор + антиген — реакция агглютинации не происходит, капля остается равномерно мутной (здесь контролируют качество компонентов и возможность самоагглютинации).
Реакцию агглютинации учитывают при хорошем освещении, применение лупы облегчает учет реакции.
Реакция гемагглютинации (РГА).
Эта реакция не относится к реакциям иммунитета, так как является результатом действия естественных гемагглютининов некоторых бактерий и вирусов на эритроциты, что влечет за собой их агглютинацию.
Данную реакцию ставят на плексигласовых панелях с лунками. Готовят ряд разведений исследуемого материала в физрастворе и к ним добавляют равный объем 1–2%-ной взвеси эритроцитов, после чего панели с реакцией помещают в термостат на 30 мин или оставляют при комнатной температуре на 1 ч.
Учет реакции производят по характеру осадка. При положительной реакции осадок из склеившихся эритроцитов имеет форму раскрытого «зонтика» с изрезанными краями, а при отрицательной — осадок в виде диска (кнопки) с ровными краями.
Реакция гемагглютинации позволяет выявить только наличие и концентрацию бактерий (вирусов), обладающих гемагглютинирующей способностью. Для идентификации этих микроорганизмов в дальнейшем применяют реакцию торможения гемагглютинации (РТГА).
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА).
Реакция торможения гемагглютинации относится к иммунным реакциям, в которой специфические антитела, взаимодействуя с антигеном, лишают его способности агглютинировать эритроциты.
Реакция проводится в два этапа. На первом этапе готовят ряд разведений специфической сыворотки от 1:10 до 1:1280; к каждому разведению сыворотки добавляют равный объем жидкости, содержащий антиген в четырехкратном титре, который определен в предварительно поставленной РГА. При этом, если произошла полная агглютинация эритроцитов антигеном в разведении 1:640, для дальнейшей работы применяют антиген в 4 раза концентрированнее, т. е. в разведении 1:160.
На втором этапе, после инкубирования при 37°С в течение 30 мин к этой смеси добавляют равный объем 1–2%-ной взвеси эритроцитов. Если сыворотки и антигена взято по 0,25 мл, то добавляют 0,5 мл эритроцитов.
Контролем является проба, где сыворотка заменена физраствором. Реакция читается после выдерживания в течение 30 мин в термостате или 45 мин при комнатной температуре.
При положительной РТГА на дне пробирки образуется плотный осадок эритроцитов (задержка реакции), имеющий вид «пуговки» или диска.
При отрицательной РТГА отмечается выраженная гемагглютинация в виде «зонтика».
Реакция используется для идентификации и типизации выделенного антигена, титрования вируссодержащих жидкостей и серологической диагностики вирусных инфекций.
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА).
Сущность этой реакции заключается в том, что антиген или антитела (иммуноглобулины) адсорбируют на поверхность эритроцитов, которые приобретают способность агглютинироваться в присутствии специфических антител или антигена.
Главными достоинствами РНГА являются высокая чувствительность и специфичность, техническая простота, стабильность используемых компонентов.
РНГА применяют при диагностике инфекционных болезней:
1) для обнаружения и титрования антител в исследуемой сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
2) для идентификации неизвестного антигена с помощью известного иммуноглобулинного (антительного) эритроцитарного диагностикума.
Учет РНГА проводится так же, как и при постановке РГА.
План работы.
1. Провести постановку РА классическим (пробирочным) методом на бруцеллез с сыворотками крови крупного рогатого скота (учет результатов провести на следующем занятии).
2. Провести постановку и учет результатов РА капельным методом с неизвестным антигеном с использованием набора агглютинирующих сальмонеллезных сывороток.
3. Ознакомиться с результатами демонстрационной реакции гемагглютинации.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. С какой целью применяется РА?
2. Как называются компоненты, участвующие в РА?
3. Какие изменения претерпевает корпускулярный антиген под действием специфических антител в РА?