Цель занятия: дать представление о сущности реакции свя

зывания комплемента, применении ее в ветеринарно-лабораторной практике, получении и подготовке компонентов; освоить методы титрации компонентов для РСК, провести постановку главного опыта; ознакомить с различными модификациями проведения РСК.

Материальное обеспечение: пробирки в штативах, пипет

ки на 1 и 5 мл, водяная баня с терморегулятором; компоненты: физиологический раствор, гемолизин (1:100), эритроциты барана (1:40), комплемент (1:20), единый бруцеллезный антиген для РА и РСК, бруцеллезная (позитивная) и нормальная (негативная) сыворотки; демонстрационные наборы с результатами: проверки компонентов на антикомплементарность и гемотоксичность; титрования гемолитической сыворотки; готовая шкала для оценки степени гемолиза эритроцитов; таблицы по теме.

РСК, как и все серологические реакции, может быть использована в следующих направлениях:

1) для выявления специфических антител в сыворотке крови больных животных с включением в реакцию известного антигена при диагностике бруцеллеза, сапа, листериоза, лептоспироза и др.;

2) для индикации или определения в исследуемом материале специфического антигена с использованием известных иммунных сывороток.

Сущность РСК заключается в том, что при взаимодействии антитела со специфическим для него антигеном происходит процесс связывания комплемента на образовавшемся комплек# се, который визуально не проявляется. Для выявления связы# вания комплемента с комплексом «антиген — антитело» вво# дится гемолитическая система (ее называют индикаторной), состоящая из гемолитической сыворотки (гемолизина) и эрит# роцитов барана.

Если антиген и антитело, взятые для исследования, специ# фичны, то происходит полное связывание комплемента, и ге# молиз эритроцитов в гемолитической системе не происходит. На дне пробирки после инкубации в течение 20 мин при 37°С и последующем выдерживании смеси в течение 20–24 ч при ком# натной температуре образуется осадок негемолизированных эритроцитов.

Если же антиген и антитело неспецифичны, то комплекс, связывающий комплемент, не образуется, последний остается в свободном состоянии и отклоняется в гемолитическую систе# му, вследствие чего наступает гемолиз эритроцитов, и иссле# дуемая смесь приобретает красный лаковый цвет. РСК, как и другие реакции иммунитета, протекает при строгих количест# венных соотношениях, взятых в опыт компонентов и точно от# титрованных количествах комплемента, гемолитической сыво# ротки, антигена и антител.

Существуют различные модификации реакции связывания комплемента, мы представляем методику постановки РСК при диагностике бруцеллеза. Реакция проходит в водяной бане при 37–38°С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента — сыво# ротки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).

При диагностике сапа и других болезней РСК ставится в объеме 2,5 мл, поэтому каждый из компонентов, входящих в реакцию, берется в объеме 0,5 мл.

Для серологической диагностики бруцеллеза крупного ро# гатого скота в ветеринарной лабораторной практике применя# ется РСК, которую ставят в объеме 1 мл. Для постановки РСК с исследуемой сывороткой необходим ряд компонентов.

1. Исследуемые сыворотки берут в стерильные пробирки индивидуально от каждого животного, контрольные (позитив# ные и негативные) — в ампулах биофабричного производства

с этикеткой. Перед применением их разводят физраствором 1:5 или 1:10 и прогревают в водяной бане в течение 30 мин при 56– 58°С для разрушения собственного комплемента. Такая сыво! ротка называется инактивированной.

2. Антиген бруцеллезный единый для РА, РСК, РДСК, из! готовленный на биофабрике, представляет собой гомогенную взвесь инактивированных нагреванием и карболовой кислотой бруцелл в физиологическом растворе.

3. Комплемент в наибольшем количестве содержится в сы! воротке крови морских свинок, поэтому ее используют как компонент в РСК. Удобнее применять лиофильно высушен! ную сыворотку, которую в настоящее время выпускают пред! приятия биологической промышленности. Для постановки РСК комплемент вводят в строго определенной дозе, так как и избыток и недостаточное количество его приводят к ложным результатам. Комплемент очень нестойкий, поэтому его ак! тивность определяют в день постановки опыта в присутст! вии антигена в бактериолитической системе, а также на пози! тивной и негативной сыворотках того вида животных, кото! рых исследуют.

4. Эритроциты барана: кровь от барана берут из яремной вены с соблюдением правил асептики в колбу со стеклянными бусами и дефибринируют осторожными круговыми движения! ми (фибрин наматывается на бусы), жидкую фракцию крови фильтруют через марлю. Полученную кровь отмывают физио! логическим раствором путем центрифугирования (15 мин при 1500–2000 об/мин), после чего надосадочную жидкость удаля! ют, а оставшуюся эритроцитарную массу ресуспендируют в физ! растворе и вновь центрифугируют (до трех раз). Данные опера! ции выполняют до тех пор, пока жидкость над эритроцитами не станет прозрачной. Отмытые эритроциты разводят для ре! акции физраствором 1:40 или готовят 2,5%!ную взвесь эрит! роцитов (для удобства и точности желательно применять гра! дуированные центрифужные пробирки);

5. Гемолитическую сыворотку (гемолизин) получают на био! предприятиях путем гипериммунизации кроликов 25–50%!ной взвесью эритроцитов в физрастворе. Данную взвесь вводят кро! ликам внутривенно 4–5 раз с 3–4!дневными интервалами. Че! рез 7 дней после последнего введения у кроликов берут кровь.

.---)-0 /-----1

Полученную сыворотку инактивируют 30 мин при 56–58°С для разрушения кроличьего комплемента. Гемолизин консервиру- ют глицерином 1:1 или добавлением 0,5% фенола и разливают по ампулам с этикеткой.

Для постановки главного опыта РСК определяют качество и проводят предварительное титрование всех компонентов, ис- пользуемых в реакции.

1. Вначале проводят проверку компонентов на антикомпле- ментарность и гемотоксичность по схеме, представленной в табл. 6.

При получении таких результатов делают следующее заклю- чение: в реакции используют компоненты, не обладающие ан- тикомплементарными и гемотоксическими свойствами.

2. Титрование гемолизина проводят при получении каждой новой партии и периодически 1 раз в 3 мес. в процессе хране- ния компонента. Для титрации гемолизина готовят ряд после- довательных разведений от 1:500 до 1:4000 по схеме, представ- ленной в табл. 7.

%-)---*-+-(-)-,-"-,---*После приготовления последовательных разведений гемолизина приступают к его титрованию в присутствии комплемента и эритроцитов барана, т. е. в гемсистеме по схеме, представленной в табл. 8.

Титром гемолизина считают наименьшее его количество, необходимое для полного гемолиза 0,2 мл взвеси эритроцитов в присутствии 0,2 мл комплемента, разведенного 1:20 в течение 10 мин при 37–38°С. Из табл. 8 видно, что предельный титр гемолизина равен 1:1500, а рабочий титр гемолизина для постановки РСК должен быть в 2 раза выше, т. е. он будет равен 1:750 (его и используют в работе).

После водяной бани учитывается результат.

Для приготовления гемолитической системы берется гемолитическая сыворотка в рабочем титре и 2,5%-ная взвесь эритроцитов в равных объемах.

Титрование комплемента в гемолитической системе. Комплемент титруют в разведении 1:20 в дозах от 0,02 до 0,2 мл с интервалами в дозах по 0,02 мл. После внесения комплемента в каждую пробирку добавляют недостающее до 0,2 мл количество физиологического раствора и остальные компоненты по схеме, как указано в табл. 9.

Титром комплемента в гемолитической системе считают наименьшее его количество, вызывающее полный гемолиз эритроцитов в течение 10 мин в водяной бане при 37–38°С. В примере, приведенном в табл. 9, титр комплемента в гемолитической системе равен 0,08.

3. Титрирование комплемента в бактериолитической системе показано в табл. 10.

Перед постановкой главного опыта РСК проводят титрование комплемента в бактериолитической системе с позитивной (бруцеллезной), негативной сывороткой крови того вида животных, которых исследуют, и одной сыворотки, взятой из исследуемой партии. Каждую из них разводят 1:5 физраствором (1 мл сыворотки + 4 мл физраствора) и инактивируют.

Сыворотку разливают по 0,2 мл в 2 ряда, в каждой из которых по 10 пробирок. Затем в пробирки каждого ряда вносят комплемент (в разведении 1:20) в возрастающих дозах от 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом 0,02 мл и недостающее до 0,2 мл (в каждой пробирке) количество физраствора.

По такой же схеме проводят титрование комплемента в бактериолитической системе с использованием позитивной и одной из исследуемых сывороток. Титром комплемента в бактериолитической системе считают минимальное его количество в разведении 1:20, вызывающее полный гемолиз 2,5%-ной взвеси эритроцитов в пробирках с негативной и исследуемой сыворотками с антигеном и без антигена, а также в пробирках с позитивной сывороткой без антигена в течение 20 мин в водяной бане при 37–38°С, при задержке гемолиза в пробирках с бруцеллезной сывороткой и антигеном. Определение титра комплемента в бактериолитической системе проводят согласно схеме.

В приведенном примере титр комплемента в этой системе равен 0,10 мл. Но в дальнейшем следует учитывать, что активность комплемента в присутствии всех компонентов главного опыта может снижаться, поэтому делают поправку и на рабочий титр комплемента, который для главного опыта увеличивают на 0,02 мл. В данном случае он будет составлять 0,12 мл.

Расчет количества комплемента, необходимого для постановки главного опыта, можно показать на следующем примере: на исследование в лабораторию прислали 150 проб с сывороткой крови, на каждую из которых необходимо две пробирки, т. е. всего 300 пробирок. Как видно из табл. 10, титр комплемента составил 0,12 в разведении 1:20. Следовательно, из расчета 0,12 ´ 300/20 = 1,8 мл, на 300 пробирок нужно 1,8 мл сыворотки морской свинки. Общий объем разведенного комплемента на 300 пробирок для постановки главного опыта составляет 60 мл (из расчета 300 ´ 0,2 мл = 60 мл).

Флакон с биофабричным лиофинизированным комплементом после восстановления (т. е. внесения 2 мл физраствора) содержит 2 мл нативной сыворотки морской свинки. Для приготовления комплемента в установленном разведении на постановку главного опыта нужно к 1,8 мл сыворотки морской свинки добавить 58,20 мл физраствора.

Главный опыт РСК.

При массовых исследованиях реакцию проводят в одной пробирке в разведении сыворотки 1:5 с антигеном, при повторном исследовании в разведениях одной сыворотки 1:5 без антигена и 1:5 и 1:10 с антигеном.

При исследовании в одной пробирке берут 0,1 мл сыворотки и добавляют 0,4 мл физраствора (разведение 1:5).

При постановке реакции в трех пробирках в первую наливают 0,1 мл исследуемой сыворотки и добавляют 0,4 мл физраствора (разведение 1:5). Из первой пробирки 0,2 мл переносят во вторую и 0,1 мл — в третью, в которую затем добавляют 0,1 мл физраствора (разведение 1:10).

Реакцию ставят по схеме главного опыта (табл. 11). Главный опыт сопровождается следующими контролями:

• негативная и бруцеллезная сыворотки в разведениях 1:5 и 1:10

с антигеном и 1:5 без антигена (по схеме главного опыта);

• гемолитическая система (0,6 мл физраствора и 0,4 мл гемолитической системы).

Учет результатов РСК проводят визуально. При постановке реакций в одной пробирке (при массовом исследовании) учет проводят 1 раз — сразу после извлечения штативов из водяной бани; при исследовании в трех пробирках — через 3–4 ч, когда в контрольных пробах с позитивной сывороткой эритроциты осядут на дно пробирки, или на следующий день (пробирки с реакцией хранят в холодильнике).

Результаты реакции оценивают в плюсах по следующей схеме:

• (++++) — отсутствие гемолиза; надосадочная жидкость прозрачная и бесцветная;
• (+++) — гемолиз 25% эритроцитов;
• (++) — гемолиз 50% эритроцитов;
• (+) — гемолиз 75% эритроцитов;

• (–) — полный гемолиз эритроцитов; осадок отсутствует;

жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

За положительный результат РСК принимают задержку ге! молиза на два креста и более. Учет результатов начинают все! гда с контрольных пробирок. Седьмая пробирка: контроль фи! зиологического раствора и гемсистемы; гемолиза не должно быть. Шестая пробирка: контроль комплемента и гемсистемы; должен быть полный гемолиз. Пятая пробирка: контроль анти! гена; должен быть полный гемолиз (нет антикомплементарно! сти антигена). Четвертая пробирка: контроль антикомплемен! тарности исследуемой сыворотки (безантигенный ряд); должен быть полный гемолиз. При задержке гемолиза (антикомплемен! тарность сыворотки) от данного животного необходимо брать кровь для повторного исследования. Третья пробирка: контроль негативной сыворотки; должен быть полный гемолиз. Вторая пробирка: контроль позитивной сыворотки; должна быть за! держка гемолиза.

При прохождении всех этапов контроля, включая провер! ку исследуемой сыворотки на антикомплементарность, можно учитывать результат в пробирке с исследуемой сывороткой и антигеном (первая пробирка). Результат в зависимости от состояния животного в этом случае может варьировать от «++++» — положительная РСК до «–» — отрицательная РСК.учитывать результат в пробирке с исследуемой сывороткой и антигеном (первая пробирка). Результат в зависимости от состояния животного в этом случае может варьировать от «++++» — положительная РСК до «–» — отрицательная РСК.

Степень задержки гемолиза эритроцитов определяют по шкале, которую готовят перед учетом реакции. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным гемолизом и жидкость из них сливают в одну. Из данной смеси готовят разведения с меньшим процентом гемолиза по схеме, представленной в табл. 12.

Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотка% ми определяют путем сравнения со степенью гемолиза в про% бирках шкалы, процент гемолиза выражают в плюсах.

Диагностическая оценка. При исследовании сывороток в одной пробирке (в разведении 1:5 с антигеном) все сыворотки, давшие задержку гемолиза на один плюс и выше, исследуют повторно в тот же или на другой день в трех пробирках в разве% дениях 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена.

Реакцию считают положительной при задержке на 2–4 плю% са в одном или двух разведениях сыворотки (1:5 или 1:10) и полном гемолизе эритроцитов в контрольной пробирке (без ан% тигена); сомнительной — при задержке гемолиза с оценкой один плюс. При получении сомнительного результата сыворотки кро% ви от животных через 15–20 дней исследуют повторно. При этом животных, с сывороткой крови которых получена дважды со% мнительная реакция, считают реагирующими положительно.

Реакцию длительного связывания комплемента (РДСК), как более чувствительную, применяют вместо РСК при исследовании на бруцеллез, туберкулез, кампилобактериоз. Основные принци% пы постановки РДСК от РСК мало чем отличаются друг от друга.

Особенность данной реакции заключается в том, что при постановке главного опыта бактериолитическую систему после- довательно выдерживают при трех температурных режимах:

1) при комнатной температуре 15 мин;

2) при 4°С в холодильнике, 18–20 ч;

3) на водяной бане при 37–38°С 15 мин.

После добавления компонентов, входящих в гемолитиче- скую систему, пробирки с реакцией помещают в водяную баню при 37–38°С на 10 мин.

Результаты РДСК учитывают точно так же, как и при РСК.

План работы (для трех занятий).

Первое занятие по РСК.

1. Провести учет РА, поставленной на прошлом занятии пробирочным методом, на бруцеллез с сыворотками крови круп- ного рогатого скота.

2. Изучить сущность РСК и ознакомиться с ее компонентами.

3. Ознакомиться с результатами проверки компонентов на антикомплементарность и гемотоксичность.

4. Ознакомиться с результатами титрования гемолитиче- ской сыворотки.

Второе занятие по РСК.

Провести постановку и учет результатов титрования ком- племента в бактериолитической системе.

Третье занятие по РСК.

Провести постановку и учет главного опыта РСК.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. С какой целью при постановке РСК исследуемую сыворотку инак-

тивируют?

2. При постановке главного опыта РСК на бруцеллез в одной из проб

«нет гемолиза». Дайте диагностическую оценку реакции.

3. При титровании гемолизина установлен предельный титр 1:2000,

назовите рабочий титр гемолизина.

4. При постановке РСК на бруцеллез с сывороткой крови больного

животного допущена неточность: в пробирку внесено комплемен-

та больше, чем установлено при титровании. К каким результа-

там может привести эта оплошность (ПГ, ЧГ, НГ)?

5. Почему при постановке РСК возникает необходимость во второй

гемолитической системе?