Цель занятия: сформировать у студентов общее представ

ление о методах флуоресцирующих антител и способах постановки реакции иммунофлуоресценции; ознакомить с сутью, компонентами, оборудованием и методами проведения иммуноферментного анализа.

Материальное обеспечение: предметные стекла; исследуе

мый материал (бактериальная культура бруцелл, сальмонелл, патологический материал); специфическая люминесцирующая сыворотка; физиологический раствор; фосфатный буфер с рН 7,2–7,4 для промывания мазков; влажная камера (чашки Петри с увлажненной ватой); фильтровальная бумага; нефлуоресцирующее иммерсионное масло; люминесцентный микроскоп, размещенный в затемненной комнате. Для выполнения твердофазного иммуноферментного метода: полистироловая планшета с заранее поставленной цветной реакцией, так как продолжительность постановки ИФА (5–6 ч) не вписывается в учебное время. Иммунологический планшет; специфические сыворотка или иммуноглобулины; фосфатный буфер рН 7,2– 7,4 с твин-20; специфический антиген (для контроля — неспецифический антиген); шприц-дозатор; пероксидазный антивидовой конъюгат (антивидовая меченая сыворотка); субстратная смесь (индикатор ортофенилендиамин с 3%-ным раствором перекиси водорода).

В серологических реакциях — МФА и ИФА — используют антитела, меченные флуорохромами или ферментами, в процессе постановки этих реакций, применяя специальные методы исследования, четко фиксируется образование иммунного комплекса. В некоторых методах ИФА ферментную метку вводят в антиген.

Методы флуоресцирующих антител (МФА).

Эти методы основаны на принципе серологических реакций, когда происходит взаимодействие специфического антигена со специфическими антителами, с образованием иммунного комплекса, но антитела здесь предварительно мечены флуорохромом (изотиоционатфлуоресцеином). Данные методы являются по своей сущности разновидностью серологических реакций, но ставятся на предметном стекле (в мазке), а образовавшийся комплекс «антиген + антитело» обнаруживают по издающей свечение метке при исследовании мазка под люминесцентным микроскопом.

В настоящее время налажено производство флуоресцирующих сывороток и глобулинов централизованным путем. Они выпускаются в сухом виде в ампулах, к которым есть приложения с инструкцией по применению и с указанием титра сывороток.

МФА можно разделить на две разновидности.

1. Прямой МФА:

1) исследуемый антиген (мазок);

2) меченые специфическая сыворотка или g-глобулин.

2. Непрямые МФА:

1) с использованием антивидовой флуоресцирующей сыворотки: § исследуемый антиген (мазок); § немеченые специфическая сыворотка или g-глобулин; § меченая антивидовая сыворотка;

2) с использованием антикомплементарной флуоресцирующей сыворотки: § исследуемый антиген (мазок); § немеченые специфическая сыворотка или g-глобулин; § комплемент; § меченая антикомплементарная сыворотка.

Прямой МФА технически прост и специфичен по результативности. При выявлении возбудителя-антигена на предметное

стекло наносят препарат отпечаток из исследуемого органа (или взвесь бактерий), высушивают на воздухе и фиксируют хими ческим методом, погружая в метанол на 5 мин. В центр препа рата наносят 2–3 капли меченой сыворотки или g глобулина в рабочем титре и выдерживают в термостате 30 мин во влажной камере (чашка Петри с увлажненной ватой). Затем мазок тща тельно промывают от не вступивших в прочную связь имму ноглобулинов каким либо буферным раствором и дистилли рованной водой. Высушивают мазки и просматривают под им мерсионной системой микроскопа. Если антиген и антитела специфичны, то на темном фоне будет отчетливо видно салато во зеленое свечение антител, адсорбировавшихся на антигенах. Если же нет (или антигена в мазке не было), то свечение отсут ствует, так как антитела удаляются с препарата при промыва нии водой. К недостаткам прямого МФА относится и то, что при идентификации неизвестного антигена в лаборатории нужно иметь на каждый возбудитель специфическую люминесцирую щую сыворотку (или глобулин), а они сравнительно дорогие и имеют небольшой срок хранения.

Непрямые МФА носят такое название потому, что флуорес цирующая сыворотка (антитело) при данных методах адсорби руется не на антигене, а на посреднике (на специфическое неок рашенное антитело или на комплемент, которые являются для флуоресцирующих антител антигеном).

Непрямой МФА (двухступенчатый) с использованием антивидовой флуоресцирующей сыворотки считается более уни версальным, так как при помощи одной люминесцирующей антивидовой сыворотки появляется возможность выявлять раз личные виды микроорганизмов. Сущность и техника данного метода заключается в том, что на фиксированный мазок снача ла наносят специфическую для предполагаемого в мазке анти гена немеченую иммунную сыворотку или глобулин (антитела сыворотки первой ступени) и выдерживают во влажной камере при 37°С 30 мин. Затем мазок обильно промывают фосфатным буфером или просто дистиллированной водой. Если в мазке имеется специфический антиген, то образуется прочный ком плекс «антиген — антитело», который при промывании мазка не исчезает. Однако полученный комплекс невидим и чтобы его обнаружить в люминесцентном микроскопе, мазок дополни

тельно обрабатывают флуоресцирующей антивидовой сывороткой или глобулинами (сыворотка второй ступени). Антивидовые сыворотки или глобулины получают путем гипериммунизации кролика (или других видов животных) сывороткой или глобулинами того вида животных, от которых получают специфическую антигену гипериммунную неспецифическую сыворотку. Для этого на мазок наносят антивидовую флуоресцирующую сыворотку и снова контактируют во влажной камере при 36–37°С 30 мин. Затем мазок промывают и высушивают на воздухе. В результате антивидовая сыворотка адсорбируется на комплекс «антиген — антитело» и, поскольку антивидовая сыворотка или глобулины меченые, вновь образовавшийся комплекс «антиген + антитело + антивидовое антитело» при микроскопии издает салатово-зеленоватое свечение.

Если же в первой стадии компоненты были неспецифичны, то комплекс «антиген — антитело» не образуется, и антивидовые антитела не свяжутся, при промывании мазка они смоются с него и при микроскопии характерного свечения не будет.

Непрямой МФА с использованием антикомплементарной флуоресцирующей сыворотки (трехступенчатый МФА) по своей сущности и технике является разновидностью РСК, которая ставится на предметном стекле, и роль гемолитической системы выполняет флуоресцирующая антикомплементарная сыворотка.

Для подтверждения специфичности результатов МФА необходим следующий контроль: для прямого варианта проводят окраску гомогенных и гетерогенных в антигенном отношении микроорганизмов люминесцирующей сывороткой. Свечение бактерий должно быть в первом случае и отсутствовать во втором.

Для непрямого метода ставят два контроля.

1. Мазки, содержащие гомологичные и гетерологичные в антигенном отношении микроорганизмы, обрабатывают антивидовой люминесцирующей сывороткой. Бактериальные клетки не должны светиться, так как нет антител первой ступени.

2. Мазки с гомологичными и гетерологичными бактериями обрабатывают иммунной (антимикробной) сывороткой (1-й этап) с последующим нанесением флуоресцирующей антиглобулиновой сыворотки (2-й этап). Специфическое свечение бактерий должно быть в первом случае и отсутствовать во втором.

Интенсивность свечения оценивается по четырехбалльной системе: «++++» — очень яркая флуоресценция по периферии микробной клетки; «+++» — яркая флуоресценция периферии клетки; «++» — слабое свечение периферии клетки; «+» — нет контрастного свечения периферии и тела микробной клетки. Реакция иммунофлуоресценции считается положительной, если специфическое свечение микробных клеток оценивают на четыре или на три плюса.

Иммуноферментный анализ (ИФА).

Этот метод основан на взаимодействии антигена и антите" ла, где в качестве метки в конъюгате (комплекс «антите" ло + фермент» или «антиген + фермент») используется фер" мент пероксидаза или другая соответствующая им субстрат" ная смесь (5"аминосалициловая кислота и перекись водорода или ортофенилендиамин и перекись водорода). По чувстви" тельности этот метод в сто и более раз превышает РНГА, РДП и др. Предел чувствительности иммуноферментного метода достигает 1–10 нг/мл специфического белка.

Иммуноферментный метод используется для выявления и идентификации микроорганизмов и антител к ним. Различают две разновидности иммуноферментного метода: гетерогенный и гомогенный.

Гетерогенный (в литературе он описан под названием им" муносорбентного — ELISA"теста и РЭМА — реакции энзимме" ченых антител (или антигенов)), адсорбированных на поверх" ности водонерастворимых полимерных материалов.

Гомогенный иммуноферментный метод в основном исполь" зуется для определения низкомолекулярных антигенов (гормо" нов, лекарственных препаратов). При данном методе не исполь" зуется твердая фаза.

Существует ряд основных компонентов, необходимых для выполнения твердофазного иммуноферментного метода.

1. Специфические иммуноглобулины, которые выделяют" ся из гипериммунной сыворотки осаждением сульфатом аммо" ния с последующей очисткой.

2. Антивидовые глобулины, выделяемые из антивидовых сывороток осаждением сульфатом аммония с последующей очи" сткой.

3. Белок А, выделяемый из золотистого стафилококка, или бычий сывороточный альбумин.

4. Антиген, приготовляемый из органов зараженных жи- вотных. Это заведомо положительные или отрицательные ан- тигены.

5. Иммунологический планшет из прозрачного полистирола.

6. Фермент пероксидаза, выделяемый из хрена.

7. Конъюгаты (пероксидаза, связанная с антителами или антигеном методом периодатного окисления).

8. Субстратная смесь (5-аминосалициловая кислота и пере- кись водорода или ортофенилендиамин и перекись водорода).

9. Детергент (поверхностно-активные вещества: твин-20, 80, трилон Х-100, сорбиталь с-20).

10. Шприц-дозатор, необходимый для розлива ингредиен- тов реакции.

Существуют прямой и непрямой методы постановки этой ре- акции. На практике в основном используется непрямой метод.

Способы постановки иммуноферментного метода для обна- ружения специфического антигена: перед постановкой реакции лиофилизированные компоненты растворяют в объеме, указан- ном на этикетке, 0,01 М раствором фосфатного буфера или дис- тиллированной водой и доводят до объема рабочих разведений. Количество каждого из компонентов, вносимых поэтапно в лун- ки планшета, составляет 0,1 мл.

Этапы постановки реакции.

1. Сенсибилизация полистиролового планшета: в лунки планшета вносят специфические антитела (иммуноглобулины) в рабочем разведении, указанном на этикетке. Планшет с анти- телами инкубируют в термостате при 37°С в течение 3 ч или при 4°С — 18 ч. По окончании инкубации, вытряхнув содер- жимое лунок, проводят трехкратную отмывку планшета рас- твором фосфатного буфера, содержащим твин. Остатки раство- ра удаляют постукиванием о фильтровальную бумагу.

2. Внесение антигенов: в планшете, сенсибилизированном специфическими антителами, выделяют контрольные ряды, в первый вносят положительный, во второй — отрицательный антигены и ряд для исследуемой пробы в разведениях от 1:10 до 1:1280. Инкубируют в термостате при 37°С в течение 1 ч. Тщательно отмывают лунки как указано выше.

3. Внесение пероксидазного антивидового конъюгата в рабочем разведении с целью выявления комплекса «антиген — антитело»: залитые планшеты помещают в термостат при 37°С на 1 ч. На образовавшемся комплексе «Ат + Аг» адсорбируются антитела, меченные пероксидазой. Затем лунки планшета трехкратно отмывают, чтобы удалить избыток несвязавшихся антител, раствором ФБТ и подсушивают.

4. Внесение ферментного субстрата: для проявления реакции в лунки планшета вносят раствор субстрата, индикатора пероксидазы — ортофенилендиамина, к раствору которого добавляют 3%-ный раствор перекиси водорода, для выявления образовавшегося комплекса «антиген — антитело — конъюгат». Планшеты закрывают и оставляют в темном месте при комнатной температуре на 15–30 мин.

5. Учет реакции проводят визуально или спектрофотометрически. При визуальной оценке положительной реакции с применением ортофенилендиамина содержимое лунок будет оранжевого цвета различной интенсивности. При визуальной оценке реакции учет проводят по четырехплюсовой системе:

• «++++» — интенсивное окрашивание;
• «+++» — оранжевое окрашивание;
• «++» — бледно-оранжевое окрашивание;
• «+» — желтое окрашивание.

Пробу считают положительной при оценке в два плюса и более. За титр антигена принимают наивысшее разведение, при котором в реакции со специфическим антителом наблюдается бледно-оранжевое окрашивание («++»), значительно превосходящее по интенсивности окрашивание контрольных лунок планшета.

При спектрофотометрическом учете результатов реакции производят расчет коэффициента специфичности, который равен отношению оптической плотности (ОП) продукта реакции в лунках с контрольным положительным антигеном (ОП1) к оптической плотности субстратной смеси в лунках с контрольным отрицательным антигеном (ОП2). Реакцию считают положительной, если коэффициент специфичности выше 2,1, и отрицательной, если ниже 2,1.

Техника постановки иммуноферментного метода для обнаружения (или титрования) антител выполняется как при обнаружении и идентификации микробного антигена, с той лишь разницей, что материалом является исследуемая сыворотка крови.

План работы.

1. Ознакомиться с флуорохромами, глобулиновыми препа- ратами, люминесцирующими сыворотками, антивидовыми сы- воротками биофабричного приготовления, люминесцентным микроскопом.

2. Приготовить препарат на предметном стекле из кусочка печени здорового животного и нанести на еще влажный препа- рат каплю культуры из вакцинного штамма бруцелл (сальмо- нелл); распределить тонким слоем; высушить; зафиксировать и обработать его специфической меченой сывороткой согласно методическим указаниям. Провести идентификацию культуры возбудителя бруцеллеза или сальмонеллеза прямым методом МФА.

3. Провести микроскопию препаратов под иммерсионной системой люминесцентного микроскопа. Зарисовать микрокар- тину.

4. Используя твердофазный иммуноферментный метод, про- вести оценку демонстрационной реакции по интенсивности окрашивания реакционной жидкости.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. В чем заключается сущность прямого МФА? В чем заключается

сущность непрямого МФА?

2. С какой целью применяется МФА?

3. Какова сущность иммуноферментного метода и его отличие от

других серологических реакций?

4. С какой целью используют иммуноферментный метод?