Цель занятия: изучить сущность полимеразной цепной реакции; ознакомиться с компонентами и методом ее постановки; изучить сущность реакции гибридизации нуклеиновых кислот (ДНК-зонды), ознакомиться с ее компонентами и методами постановки.

Материальное обеспечение: набор компонентов для поста

новки полимеразной цепной реакции; амплификатор; аппарат для электрофореза; трансиллюминатор; набор компонентов, реактивов для постановки реакции ДНК-зондов, приборы и аппаратура: аппарат для горизонтального электрофореза, вакуум-шкаф с подогревом, счетчик радиоактивности, настольная центрифуга на 10 тыс. об/мин, рентгенкассета с усиливающими экранами.

Полимеразная цепная реакция.

Полимеразная цепная реакция, разработанная в последние годы, находит все большее использование в микробиологии. С ее помощью можно быстро и надежно провести диагностику инфекционных болезней животных и человека путем индикации возбудителя в исследуемом материале на генетическом уровне.

Вначале из патологического материала или изучаемой микробной культуры методом щелочного гидролиза выделяют ДНК-образец, с которым проводят полимеразную цепную реакцию, т. е. амплификацию заданного фрагмента ДНК-гена. При этом происходит образование дополнительных копий гена

в пробирке заданного участка ДНК-образца. Для этого в пробирку с данным образцом вносят основные компоненты — праймер (затравку), трифосфаты, ДНК-полимеразу. Праймер представляет собой олигонуклеотид, состоящий из 15–20 нуклеотидов. Его получают путем химического синтеза на автоматическом синтезаторе «Виктория», пользуясь данными о первичной структуре (нуклеотидной последовательности) ДНК определенного вида микроорганизма.

Смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов (dGTR, dATP, dCTP, dTTP) — дезоксигуанин — аденин, цитозин, тимин, трифосфорная кислота. ДНК-полимераза — фермент, способный использовать полинуклеотиды как матрицы и строить комплементарные им новые нуклеотидные цепи.

Пробирки помещают в амплификатор — прибор, который позволяет поддерживать строго заданный температурный режим и осуществлять полимеразную цепную реакцию.

Сущность ПЦР заключается в том, что молекулу ДНК подвергают температурному плавлению, т. е. нагреванию до 90– 94°С, что ведет к денатурации — разрушению водородных связей между азотистыми основаниями двойной спирали, а затем охлаждают (отжиг) до 52°С в присутствии праймера, фермента ДНК-полимеразы и всех четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов. Последующее повышение температуры до 70–72°С приводит к синтезу новой молекулы ДНК, комплементарной матричной. Эту процедуру (плавления, отжига и синтеза ДНК) повторяют многократно, в результате чего количество выбранного фрагмента ДНК увеличивается.

Продолжительность реакции определяется числом циклов, необходимых для синтеза ДНК-амплификата в достаточном количестве для дальнейшего исследования или индикации. Индикация производится с помощью электрофореза или с помощью меченого ДНК-зонда.

Методика постановки полимеразной реакции.

1. Получение ДНК-образца (лизатов, исследуемого материала). Для этого исследуемый материал суспендируют в буфере или дистиллированной воде, добавляют 1 М раствор NаОН и выдерживают при 37°С в течение 6–7 мин. Смесь нейтрализуют добавлением трис-(оксицетил)аминометана (рН 6,0). Лизат центрифугируют при 5000 об/мин на протяжении 10 мин для

осаждения крупных частиц. Надосадочную жидкость, содержащую ДНК и РНК, используют для постановки ПЦР.

2. Проведение полимеразной цепной реакции — амплификация данного фрагмента (ДНК-гена). Для этого вносят буферный раствор (буфер для ПЦР (10´)-500 mM КСl, 100 mМ трис НСl, 14, 15 mМ МgС1, 0,1% желатина или бычьего сывороточного альбумина, pH 8,0), фермент ДНК-полимеразу, праймер — олигонуклеотид-затравку, трифосфаты — предшественники синтеза ДНК, исследуемый образец ДНК или биологическая жидкость — кровь, моча, слюна, мокрота и т. д.

3. В пробирку емкостью 1,5 мл (эппендорф) собирают смесь, состоящую из:

• 125 мкл бидистиллированной стерильной воды;
• 15 мкл буфера для ПЦР;
• 5 мкл раствора трифосфатов;
• 3 мкл раствора праймера;
• 3 мкл раствора ДНК-полимеразы термостойкой.

Смесь разливают в пять пробирок (емкостью 0,5 мл) по 30 мкл. В каждую из них вносят по 0,5–1 мкл надосадочной жидкости из лизата, перемешивают, сверху наслаивают по 25 мкл стерильного вазелинового масла. Включают амплификатор и устанавливают режим работы:

• плавление: 92°С в течение 60 с;
• отжиг ДНК: 55°С в течение 60 с;
• синтез ДНК: 70°С в течение 75 с.

В стадии плавления пробирки устанавливают в амплификатор; проводят 80 циклов амплификации, что занимает 3 ч, и за этот срок из одной молекулы ДНК образуется до 1 млн молекул-копий. Реакцию останавливают на стадии «синтеза» и в этой стадии выдерживают 3–5 мин для окончательного досинтезирования фрагментов ДНК.

Полученные пробы молекул ДНК подвергают электрофорезу в агарозном геле. Для этого готовят 1,7%-ный раствор агарозы с этидий бромидом (краситель), разливают на подложку и устанавливают пластинку с зубцами для образования лунок. Через 10–15 мин агароза полимеризуется (застывает).

Пластинку с зубцами осторожно снимают, при этом на агарозе образуются лунки. В аппарат для электрофореза заливают буфер и устанавливают электроды.

В полученные в агарозе лунки вносят пробы: § амплификат; § праймер (свидетель); § лизат, полученный из исследуемого материала.

Электрофорез проводят в режиме 4–5 В/см. Через 40–50 мин аппарат отключают, вынимают пластинку с агарозой и в тече- ние 10 мин окрашивают в 1,7%-ном растворе этидия бромида. Агарозную пластинку помещают на трансиллюминатор, осве- щают ультрафиолетовыми лучами и фотографируют.

Полосы в агарозной пластинке, выявляемые при ультрафио- летовом освещении, являются фрагментами ДНК, синтезиро- ванными в процессе амплификации со специфическим для ка- ждого возбудителя праймером.

На электрофореграмме выявляют расположение полос, ко- торое зависит от электрофоретической подвижности компонен- тов реакции. Положительной реакцией считают расположение полос на электрофореграмме на одном и том же уровне, что ука- зывает на идентичность амплификата и праймера. При отрица- тельных пробах и контроле совпадения полос не происходит или они отсутствуют.

Использование в микробиологии ДНК-зондов.

Метод ДНК-зонды основан на уникальном свойстве генети- ческого материала организма — молекулы ДНК, состоящей из мононуклеотидов, — образовывать двойную спираль путем ком- плементарного соединения азотистых оснований. Молекула ДНК образует двойную спираль, при которой азотистые осно- вания первой цепи строго комплементарно соединяются водо- родными связями с азотистыми основаниями второй цепи, где аденин соединяется с тимином, гуанин — с цитозином.

Принцип метода состоит в том, что структуру двойной спи- рали ДНК (или РНК) можно разрушить нагреванием, и при этом происходит разделение цепей. Этот процесс называется денату- рацией или плавлением ДНК. Температуру, при которой про- исходит разделение цепей ДНК, называют точкой плавления, которая равняется 85–95°С. Данный процесс обратимый, т. е. при снижении температуры происходит восстановление свя- зей — образование двойной спирали. Это явление называют ре- натурацией. Если при ренатурации взяты молекулы из разных

источников, говорят о гибридизации. Способность к гибридизации двух препаратов нуклеиновых кислот является строгим тестом на комплементарность их последовательностей.

Гибридизацию можно осуществлять в растворе или на фильтре (капроновом или нитроцеллюлозном). Удобным для работы является метод гибридизации с использованием фильтров. При этом один из препаратов ДНК иммобилизируют на нитроцеллюлозных фильтрах, на которых молекула ДНК адсорбируется. Затем их погружают в раствор, содержащий второй препарат денатурированной ДНК (ДНК-зонд). Связывание ДНК-зонда происходит только в том случае, если она имеет последовательность нуклеотидов, комплементарную первоначально адсорбированной на фильтре молекуле ДНК.

Эффективность гибридизации определяют по количеству метки, оставшейся на фильтре. Метод является очень чувствительным. При этом необходимо иметь меченные радиоактивным изотопом РНК или ДНК-зонды, идентификация которых с исследуемой молекулой регистрируется с помощью радиоавтографии.

В качестве ДНК-зонда используют меченые копии ДНК с известной последовательностью нуклеотидов.

Метод блоттинга по Саузерну. Для идентификации гена молекулу ДНК-генома расщепляют с помощью ферментов рестриктаз на куски размером примерно по 15–20 тыс. пар нуклеотидов.

Расщепленный таким образом геном подвергается электрофоретическому фракционированию в агарозном геле. После этого фракции ДНК денатурируют нагреванием и переносят из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр, где их иммобилизируют. Процесс переноса ДНК напоминает промокание и называется методом блоттинга по Саузерну, его сущность заключается в том, что агарозный гель помещают на фильтровальную бумагу, замоченную в концентрированном солевом растворе, а затем на гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр и сверху помещают сухую фильтровальную бумагу.

Для того чтобы солевой раствор впитался в сухую бумагу, ему необходимо пройти сквозь агарозный гель и затем через нитроцеллюлозный фильтр. ДНК переносится вместе с солевым раствором, но задерживается нитроцеллюлозой. Иммобилизованную таким образом ДНК можно гибридизировать на месте с радиоактивным зондом. Со специфичным зондом будут гибри- дизироваться только комплементарные ему фрагменты. Так как зонд радиоактивный, то гибридизацию можно обнаружить с помощью авторадиографии.

Каждая комплементарная последовательность проявляет- ся в виде радиоактивной полосы, месторасположение которой определяется размером фрагмента ДНК.

Метод блоттинга является высокочувствительным и широ- ко применяется в различных областях, в том числе для диагно- стики инфекционных болезней сельскохозяйственных живот- ных, например для обнаружения возбудителей сибирской язвы, бруцеллеза, туберкулеза, ящура, чумы свиней, чумы птиц, эн- теровирусов и т. д.

Метод генной дактилоскопии заключается в анализе ги- первариабельных участков молекул ДНК, который включает следующие этапы: выделение ДНК и фрагментация ее с помо- щью электрофореза в геле. Фрагменты, содержащие гиперва- риабельные участки, выявляют авторадиографически с помо- щью специального зонда — «проба Джеффриса», с которой они связываются путем гибридизации.

В качестве радиоактивного зонда может быть использована ДНК, выделенная из бактериофага М-13.

Метод точечной (дот) гибридизации выполняется путем вне- сения исследуемых образцов ДНК в денатурированном состоя- нии на капроновые мембранные фильтры в виде точек. Напри- мер, ДНК микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота в количестве 3 мкл (1,8 мкг/мл) в виде точек наносится в квад- раты (1,5´1,5 см). Одноцепочечные молекулы ДНК (денатури- рованные) адсорбируются на мембране и фиксируются. После этого на фильтр наносится ДНК-зонд, одноцепочечная молеку- ла ДНК, выделенная, например, из Myc. bovis, меченная ра- диоактивным фосфором.

В случае совпадения азотистые основания молекул ДНК M. bovis и меченая 32Р ДНК-зонда комплементарны, т. е. про- исходит связывание азотистых оснований с образованием двой- ной спирали. После этого несвязанные молекулы ДНК-зонда отмываются, и образующиеся гибридные молекулы выявляют радиоавтографически.

Методика постановки ДНК-гибридизации по индикации возбудителя бруцеллеза включает в себя два основных этапа: подготовка проб исследуемого материала и приготовление ДНКзондов.

Подготовка проб исследуемого материала.

1. Берут небольшие кусочки (0,3–0,2 г) органов, тканей, гомогенизируют их путем растирания с кварцевым песком и добавлением физиологического раствора.

2. Лизис клеток проводят с добавлением 10%-ного водного раствора додецилсульфата, доводя его концентрацию до 0,5– 1,0% и проназу до 500 мкг/мл. Смесь инкубируют при 37°С в течение 30 мин.

3. Добавляют равный объем смеси хлороформ-изоамилового спирта, энергично встряхивают и центрифугируют при 10 тыс. об/мин. Верхнюю водную фазу осторожно переносят в другую пробирку и добавляют 2,5 объема холодного 96%-ного этанола. При этом ДНК выпадает в осадок.

4. Осажденную ДНК подсушивают на воздухе и растворяют в 10–20 мкл воды.

5. Берут капроновый фильтр, расчерчивают на квадраты со сторонами 1,5´1,5 см и на них в несколько приемов наносят растворенный осадок, предварительно подогретый до 100°С.

6. Фильтры подсушивают и выдерживают 2 ч под вакуумом при 80°С.

Фильтры с зафиксированными на них образцами можно долго хранить при комнатной температуре в вакууме.

Приготовление ДНК-зондов.

1. Из бруцелл выделяют ДНК и озвучивают ее ультразвуком при 22 кГц в течение 1 мин.

2. Полученные фрагменты ДНК метят радиоактивным фосфором методом трансляции. Дня этого радиоактивный трифосфат (ТТР) в количестве 60 мк-Кюри выпаривают под вакуумом при комнатной температуре. В эту же пробирку добавляют 5 мкл (5 мкг) озвученной ДНК, по 2 мкл всех остальных трех немеченых трифосфатов, 4 мкл 10-ник-буфера, 2 мкл ДНК-полимеразы 1 и 2 мкл ДНК-азы, разведенной 10 тыс. раз. Все это перемешивают и ставят на 2 ч при 15°С. Очистку зонда от невключившихся трифосфатов производят на колонке с сефадексом Ж-50. После этого этапа зонд готов для дальнейшей работы.

3. Капроновые фильтры с исследуемой ДНК запаивают в полиэтиленовые пакеты, оставив отверстие для внесения пред- гибридизационной смеси.

Состав предгибридизационной смеси: формамид — 1,0 мл; 20´ССЦ (3 М, 0,3 М цитрат натрия) — 1,2 мл 100-х смеси Ден- харда (1х 20-го раствора фикола, 2%-ный поливинилпирроли- дина, 2%-ного бычьего сывороточного альбумина) — 0,6 мл, ДНК из спермы лосося — 0,14 мл.

ДНК из спермы лосося предварительно денатурируется ки- пячением при 100°С в течение 5 мин. В пакет с фильтром вно- сят предгибридизационную смесь из расчета 0,5 мл на см2 фильтра и инкубируют при 46°С 2 ч.

4. Предгибридизационную смесь выливают, и в пакет вно- сят гибридизационную смесь, состоящую из раствора, указан- ного в п. 3, а также денатурированную ДНК из спермы лосося, ДНК-зонд. Смесь инкубируют при 46°С в течение 16–20 ч (ос- тавляют на ночь).

5. Гибридизационную смесь выливают и отмывание фильт- ров проводят в следующем режиме: в растворе состава 2´ССЦ — 0,1% ДДС 2 раза по 15 мин при комнатной температуре, в та- ком же растворе при 60°С по 15 минут 2 раза. В конце фильтры ополаскивают в 0,1´ССЦ 2 раза и высушивают при комнатной температуре.

6. Для учета реакции проводят радиоавтографию или ра- диоактивность определяют на счетчике.

7. Радиоавтографию проводят в следующем порядке: в рент- геновскую кассету (на экран) лейкопластырем приклеивают лист обычной бумаги, на него крепят фильтр после гибридиза- ции и на последнюю накладывают в темноте рентген-пленку. Рентген-кассету закрывают, помещают в полиэтиленовый па- кет и оставляют на ночь при –70°С или –20°С. После холодиль- ника кассету выдерживают в течение 1 ч при комнатной темпе- ратуре, затем в темноте вынимают пленку, проявляют и изо- бражение закрепляют.

При наличии бруцелл в тканях в тех квадратах фильтра, куда они были нанесены, на пленке появляются черные пятна.

После установления бруцелл в исследуемых пробах необхо- димо определение видовой принадлежности бруцелл, которое проводится методом мультилокусной геномной дактилоскопии.

План работы.

1. Ознакомиться с оборудованием, аппаратурой, компонентами для проведения реакции ДНК-зондов.

2. Провести фрагментально постановку реакции ДНК-зондов.

3. Ознакомиться с оборудованием, приборами, компонентами, реактивами, используемыми для постановки ПЦР.

4. Провести фрагментально постановку.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. В чем сущность и принципы проведения ДНК-зондов?

2. В чем заключается метод генной дактилоскопии?

3. Дайте характеристику структуры ДНК.

4. В чем сущность принципа комплементарности ДНК?

5. Преимущества ПЦР при диагностике инфекционных болезней по

сравнению с другими методами.