Цель занятия: изучить морфологические, тинкториальные,

культуральные и ферментативные свойства E. Сoli; ознакомиться с методами индикации E. сoli в исследуемом материале.

Материальное обеспечение: пробирки с посевами кишечной

палочки на МПА, МПБ, на агаре Эндо, Левина, Симмонса; среды Гисса с посевами E. сoli, тесты на индол; набор красок по Граму, предметные стекла, бактериологические петли, спиртовки, микроскопы, иммерсионное масло, диагностические агглютинирующие О-коли сыворотки для РА на предметном стекле; биопрепараты; таблицы «Схема бактериологической диагностики инфекционных болезней, короткий пестрый ряд (среды Гисса)».

В связи с трудоемкостью и длительностью серологической дифференциации E. coli нужно заранее подготовить культуру и провести только демонстрацию РА на предметном стекле с поливалентной и моновалентной сыворотками.

Возбудителями колибактериоза (эшерихиоза) являются энтеропатогенные варианты E. coli, род Escherichia, семейство Enterobacteriaceae. Колибактериоз — остропротекающая инфекционная болезнь молодняка сельскохозяйственных животных, включая птиц и пушных зверей. Исследования антигенного строения кишечной палочки показали, что возбудителями заболеваний являются патогенные серогруппы E. сoli: § у телят чаще выделяются серогруппы 08, 09, 015, 0101 и др; § у поросят — 08, 09, 0137, 0138 и др; § у человека — 026, 055, 0111 и др.

Лабораторная диагностика.

Лабораторная диагностика колибактериоза состоит из обнаружения возбудителя в исследуемом материале методами световой микроскопии, выделения чистой культуры, идентификации возбудителя по морфологическим, культуральным, ферментативным, серологическим и патогенным свойствам.

Материалом для исследования служат кусочки паренхиматозных органов или трупы целиком (в зависимости от веса животных). Для прижизненной бактериологической диагностики колибактериоза в лабораторию посылают фекалии в стерильных пробирках не менее чем от пяти больных животных, не подвергавшихся лечению химиотерапевтическими препаратами.

Микроскопия мазков из исследуемого материала: готовят препараты из паренхиматозных органов, окрашивают по Граму. E. сoli — мелкие, подвижные, грамотрицательные палочки с закругленными концами (2–3 мкм), спор и капсул не образуют, в препарате располагаются одиночно, беспорядочно.

Выделение чистой культуры и ее идентификация. Возбудитель относится к факультативным анаэробам, хорошо растет на обычных питательных средах при температуре 37–38°С, рН 7,2–7,4. На МПА образует круглые, серо-белые колонии S-формы, на МПБ — интенсивное помутнение и рыхлый осадок на дне пробирки.

В первый день исследования делают посев из паренхиматозных органов на среду Эндо или Левина в чашках Петри методом отпечатков местом свежего среза или петлей, распределяя его по поверхности так, чтобы выросли изолированные колонии.

На второй день просматривают чашки с посевами и отбирают колонии, характерные для эшерихий: круглые, S-формы, красные с металлическим блеском на Эндо, темно-фиолетовые на среде Левина, кирпично-красные — на бактоагаре Плоскирева. Далее для выделения чистой культуры типичные для E. сoli колонии отсевают на МПА и МПБ, у выделенных культур изучают морфологические, культуральные и ферментативные свойства.

Ферментацию лактозы устанавливают посевом исследуемой культуры на среды Гисса, для E. сoli характерно расщепление лактозы, глюкозы и маннита с образованием кислоты и газа.

Для установления способности выделенной культуры расщеплять мочевину и образовывать сероводород ее вносят в трехсахарный агар с мочевиной и выращивают 24 ч в термостате при 37°С. Бактерии кишечной палочки не расщепляют мочевину и не образуют сероводород, поэтому цвет среды не изменяется и столбик агара не чернеет.

Для определения способности утилизировать цитраты исследуемую культуру вносят на скошенный агар Симмонса, посевы помещают на 24 ч в термостат при 37°С. Бактерии кишечной палочки не утилизируют цитраты (цитратотрицательные), поэтому цвет среды не меняется.

Серологическая идентификация E. coli.

Для серологической идентификации выделенной E. coli применяют поливалентные и моновалентные О-коли агглютинирующие сыворотки, выпускаемые биологической промышленностью в лиофилизированном виде (по инструкции перед применением во флакон добавляют физраствор до первоначального объема). Серогрупповую принадлежность эшерихий определяют только у культур, отнесенных по морфологическим, культуральным и ферментативным свойствам к роду эшерихий.

Для серологической идентификации готовят суточную культуру изучаемой кишечной палочки на скошенном МПА, которую смывают физраствором и смыв переносят в две сухие стерильные пробирки:

1) первую пробирку прогревают в течение 1 ч в кипящей водяной бане при 100°С для разрушения поверхностных термолабильных L-и B-антигенов (с этой культурой ставят РА на предметном стекле);

2) вторую пробирку автоклавируют при температуре 120°С в течение 2 ч, для разрушения поверхностного термостабильного А-антигена (с этой культурой ставят РА только в том случае, если первая РА дала неспецифическую реакцию).

Обе прогретые культуры центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, надосадочную жидкость сливают, а осадок используют в качестве антигена для постановки РА на предметном

стекле. Оставшуюся часть антигена разводят физиологическим раствором до концентрации клеток 5Ч108 мл и ставят

пробирочную реакцию.

Определение серогрупповой принадлежности культур начинают с постановки РА на стекле с групповыми поливалентными сыворотками (их пять — 1, 2, 3, 4 и 0157):

• 1-я поливалентная содержит антитела против серотипов 01,

02, 04, 08, 078, 0111, 0115, 0126;

• 2-я поливалентная содержит антитела против серотипов 09,

015;

• 3-я поливалентная содержит антитела против серотипов

033, 035;

• 4-я поливалентная содержит антитела против серотипов

0555, 0127;

• 5-я поливалентная содержит антитела только против серотипа 0157.

На чистые предметные стекла наносят по капле поливалентных сывороток взятых из набора, в каждую каплю сыворотки петлей вносят прогретую, осажденную центрифугированием культуру E. coli, и хорошо перемешивают. Реакция протекает при температуре 18–20°С, учитывают ее в течение 3 мин.

Положительная реакция характеризуется образованием мелкозернистого агглютината и полным или частичным просветлением жидкости в капле только с одной групповой сывороткой. Положительная РА с поливалентной сывороткой подтверждает принадлежность этой культуры к роду Escherichia. При отрицательном результате РА антиген не изменяется (не склеивается) и остается в виде равномерной взвеси.

Для окончательного определения серогруппы каждую культуру, которая агглютинируется одной из испытанных поливалентных сывороток, исследуют в РА на стекле с моновалентными, входящими в состав данной поливалентной сыворотки, разведенными 1:10.

Исследуемую культуру относят к той серогруппе (определяют по этикетке), с сывороткой которой она дает положительную реакцию.

Постановка РА сопровождается следующими контролями:

1) антиген, приготовленный из выделенной кишечной палочки + физраствор (для исключения самоагглютинации контролируют качество антигена и физраствора); реакция должна быть отрицательной;

2) антиген из известного штамма кишечной палочки, т. е. специфический + положительная сыворотка; пробирка будет служить эталоном положительной реакции;

3) пробирка с сывороткой, разведенной 1:25 без добавления антигена, для исключения флотации.

Примечание: при появлении неспецифической реакции по- становку РА на предметном стекле повторяют с автоклавиро- ванной культурой.

Биопроба для определения патогенных свойств. Выделен- ную культуру сутки выращивают на МПА при 37°С, затем смы- вают физиологическим раствором, готовят суспензию концен- трацией 1 млрд микробных клеток в 1 мл по оптическому стан- дарту мутности. Трех белых мышей массой 14–16 г заражают внутрибрюшинно введением 0,5 мл бактериальной суспензии. За животными наблюдают в течение трех суток, в случае гибе- ли двух (и более) зараженных мышей выделенную культуру считают патогенной.

Обнаружение грамотрицательных палочек, образующих характерные колонии на дифференциально-диагностических и элективных средах, ферментирующих лактозу и маннит, об- разующих индол, не расщепляющих мочевину, не разжижаю- щих МПЖ, не образующих сероводород, дающих положитель- ную реакцию с метиловым-красным и отрицательную реакцию Фогес — Проскауэра, образующих лизиндекарбоксилазу, не растущих на среде Симмонса, а также дающих положитель- ную серологическую реакцию с поливалентными и моновалент- ными О-коли агглютинирующими сыворотками, указывает на наличие в исследуемом материале бактерий E. сoli.

План работы.

1. Изучить культуральные и ферментативные свойства E. сoli на МПА и МПБ, на демонстрационных посевах в средах Гисса, агаре Эндо, Левина.

2. Приготовить препарат из агаровой культуры кишечной палочки, окрасить по Граму, изучить морфологию под иммер- сионным объективом.

3. Приготовить препарат «висячая капля» из молодой бульонной культуры E. сoli и изучить ее подвижность.

4. Познакомиться с биофабричными компонентами для серологической дифференциации E. сoli. Поставить РА с агаровой культурой E. сoli на предметном стекле для серологической идентификации.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Какие виды животных восприимчивы к возбудителю колибактериоза?

2. На чем основана дифференциация E. coli на агаре Эндо, Левина?

3. Какие видимые проявления реакции происходят при положительной и отрицательной РА на предметном стекле?

4. Каким методом получают специфические сыворотки на биофабрике?