Цель занятия: ознакомить студентов с морфологическими,

культуральными и биохимическими свойствами возбудителя сальмонеллеза; изучить методы индикации возбудителя сальмонеллеза в исследуемом материале.

Материальное оснащение: посевы возбудителя сальмонеллеза в пробирках с МПА, МПБ, посевы Salmonella в чашках Петри с элективными средами; фабричный набор О-комплексных и Н-монорецепторных агглютинирующих сальмонеллезных сывороток; стереомикроскоп для изучения культуральных свойств; набор красок по Граму; спиртовки; бактериологические петли; предметные стекла; таблица «Схема бактериологической диагностики».

Возбудители сальмонеллеза — бактерии из рода Salmonella, семейства Enterobacteriaceae. Сальмонеллы внутри рода идентифицируют по антигенной структуре, известно более 2200 серологических вариантов, каждый из которых характеризуется определенным набором О-и Н-антигенов.

Лабораторная диагностика сальмонеллеза.

Лабораторная диагностика сальмонеллеза состоит из обнаружения возбудителя в исследуемом материале методами световой и люминесцентной микроскопии; выделении чистой культуры; идентификации возбудителя по морфологическим, культуральным, ферментативным, серологическим и патогенным свойствам.

Материалом для исследования служат паренхиматозные органы, сердце, трубчатая кость, абортированный плод, трупы мелких животных. В первые дни болезни для прижизненной диагностики посылают фекалии больных животных, для полу- чения гемокультуры — кровь.

Микроскопическое исследование: из присланного материа- ла готовят мазки-отпечатки, окрашивают их по Граму и изуча- ют морфологические свойства сальмонелл под микроскопом. По морфологии это небольшие палочки с закругленными концами от 2 до 4 мкм длины и 0,5–0,8 мкм ширины; в мазках распола- гаются одиночно, беспорядочно; подвижны (за исключением S. pullorum-gallinarum); спор и капсул не образуют; по Граму окрашиваются отрицательно.

Выделение чистой культуры и ее идентификация: сальмо- неллы относятся к факультативным анаэробам, оптимальная температура культивирования — 37°С, рН 7,2–7,4. На МПА образуют небольшие серо-белые колонии, S-формы, некоторые сальмонеллы по краю колонии образуют слизистый вал. На МПБ — различной степени помутнение, на дне серо-белый оса- док, на поверхности некоторых видов пристеночное кольцо.

При первичном (прямом) посеве исследуемого материала применяют плотные элективные среды. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37°С, изучают культуральные и ферментативные свойства появившихся колоний. На дифферен- циально-диагностических и элективных средах сальмонеллы растут, образуя характерные колонии:

• на агаре Эндо — круглые, бесцветные или слегка розоватые

колонии;

• на агаре Левина сальмонеллы растут в виде круглых, блед-

ных или розовато-фиолетовых колоний.

В некоторых случаях, при небольшом количестве сальмо- нелл в исследуемом материале, проводят посев на жидкие сре- ды обогащения (Кауфмана, Мюллера), содержащие компонен- ты, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. Эти среды выдерживают сутки в термостате при температуре 37°С, из них проводят пересев на плотные селективные среды (агар Плоски- рева, ВСА), которые после термостатирования при температу- ре 37°С просматривают на присутствие колоний типичных или подозрительных на сальмонеллы.

На селективных средах сальмонеллы растут, образуя характерные колонии:

1. На бактоагаре Плоскирева сальмонеллы образуют бесцветные колонии, но более плотные и меньшего размера, чем на среде Эндо.

2. На висмут-сульфитном агаре сальмонеллы, как правило, растут в виде черных или коричневых колоний с характерным металлическим блеском. При этом участок среды под колонией также прокрашивается в черный цвет. Исключение составляют некоторые серотипы из группы С, которые на этой среде растут в виде серовато-зеленых колоний.

Подтверждение наличия бактерий из рода сальмонелл проводят изучением биохимических и серологических свойств выделенной культуры. При обнаружении роста подозрительных колоний выборочно выделяют 3–5 колоний в каждой чашке. Из них готовят препараты, окрашивают по Граму, изучают подвижность.

Окончательно вид сальмонелл определяют методом серологической идентификации. Они имеют сложное антигенное строение, у них два основных антигенных комплекса: О-антиген (соматический) и Н-антиген (жгутиковый), имеющие значение при идентификации сальмонелл. В соответствии с содержанием О-антигенов сальмонеллы разделены на ряд серологических групп, обозначаемых заглавными буквами латинского алфавита — А, В, С, D и Е.

Н-антигены могут существовать в двух фазах, выявляемых в серологических реакциях: § специфической: обозначаются прописными буквами латинского алфавита; § неспецифической: обозначаются арабскими цифрами или

прописными буквами латинского алфавита.

Сальмонеллы, у которых Н-антиген представлен двумя фазами, называются двухфазными, а имеющие антигены одной фазы — монофазными.

Таким образом, при серологической идентификации принимаются во внимание лишь два основных антигена — О и Н, и этот принцип положен в основу антигенной схемы Кауфмана — Уайта.

Серологической идентификации подлежат только чистые культуры бактерий, отнесенные по морфологическим, культуральным и ферментативным свойствам к роду сальмонелл.

Предприятиями биологической промышленности выпускаются наборы сальмонеллезных О-комплексных и монорецепторных О-и Н-агглютинирующих сывороток. Эти наборы позволяют определить родовую и серовариантную принадлежность 33 групп сальмонелл, чаще выделяемых из патматериала, из продуктов животного происхождения и объектов внешней среды.

Сыворотки выпускаются двумя наборами. В набор №1 вхо- дят О-комплексные сыворотки 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. В набор №2 входят О-и Н-монорецепторные сыворотки (табл. 13).

Методика: вначале подготовленные чистые культуры ис- пытывают с О-комплексными сыворотками. При этом РА на стекле ставят с каждой из О-комплексных сывороток последо- вательно, начиная с сыворотки №1 и до получения положи- тельных реакций с двумя сыворотками.

Для этого на предметное стекло пипеткой наносят каплю О-комплексной сыворотки. В каждую каплю сыворотки вносят часть изучаемой культуры снятой с агара колонии, которую, тща- тельно растирая до гомогенного состояния, соединяют с каплей сыворотки. Если сыворотка и бактериальная культура друг дру- гу специфичны, то через 2–3 мин происходит агглютинация бак- териальных клеток — бактерии склеиваются в виде мелких комочков, реакционная жидкость при этом просветляется. По результатам РА с О комплексными сыворотками устанавливают О групповую (серогрупповую) принадлежность сальмонелл.

Далее для определения серовариантной принадлежности сальмонеллы, отнесенные к определенной О группе, испыты вают с Н монорецепторными сыворотками 1 й и 2 й фазы. В вы боре сывороток для реакции исходят из антигенной структуры сальмонелл той группы, к которой отнесена определяемая куль тура, с учетом вида животных, от которого она выделена.

Техника постановки РА аналогична таковой при использо вании О комплексных и монорецепторных сывороток. Только Н агглютинат имеет вид крупных, легко разбивающихся хлопь ев при полном или частичном просветлении капли.

Одновременно с РА исследуемый материал засевают на трех сахарный агар Олькеницкого с мочевиной (глюкоза, лактоза, са хароза). Пробирки со средой скашивают так, чтобы на дне остал ся столбик агара высотой не менее 3 см (готовая среда желтого цвета). Посев на трехсахарный агар делают сначала штрихом по скошенной поверхности, а затем уколом в глубину столбика. Куль туру выращивают при 37°С в течение 16–18 ч. При наличии саль монелл желтый цвет среды изменяется следующим образом: стол бик становится розовым, скошенная поверхность цвет не изменя ет. Образование газа определяют по наличию трещин и разрыву столбика агара, сероводорода — по почернению столбика.

Сальмонеллы, не образующие сероводород, не изменяют цвет питательной среды. Бактерии, не относящиеся к сальмо неллам, расщепляющие мочевину, окрашивают столбик и ско шенную поверхность в ярко красный цвет, а бактерии, сбра живающие лактозу и сахарозу, изменяют цвет среды в синий.

Если культуры ферментируют лактозу с образованием газа и расщепляют мочевину, они не принадлежат к бактериям рода сальмонелла.

К бактериям из рода сальмонелла относятся не ферменти рующие лактозу, сахарозу и ферментирующие глюкозу и ман нит (S. typhi suis не ферментирует маннит), образующие серо водород (S. cholera suis и S. typhi suis сероводород не образуют) и не образующие индол.

Выявление сальмонелл прямым методом иммунофлуоресценции. Обнаружение в патологическом материале сальмонелл, входящих в серологические группы В, С1, С2, D1 и Е1, возможно

прямым методом иммунофлуоресценции с помощью комплексной и групповых сальмонеллезных флуоресцирующих сывороток.

Комплексная сыворотка применяется для обнаружения сальмонелл, входящих в любую из серогрупп В, С1, С2, D1 или Е1. Групповые адсорбированные сыворотки применяют для определения принадлежности выявленных сальмонелл к одной из указанных групп.

Методика: из колоний, характерных для сальмонелл, или непосредственно из патологического материала готовят препараты, фиксируют химическим методом и на каждый мазок наносят по две капли флуоресцирующей сыворотки, разведенной по инструкции до рабочего разведения. Препараты помещают во влажную камеру, реакция продолжается 20 мин. Затем препараты в течение 5 мин обильно промывают физраствором, дополнительно — дистиллированной водой и подсушивают.

После этого на мазок наносят нефлуоресцирующее масло, просматривают под люминесцентным микроскопом при увеличении 5´90 и силе тока 4,1 А.

Сальмонеллы, окрашенные флуоресцирующей сывороткой, имеют светящийся периферический контур, это специфическое свечение визуально оценивают от «++++» до «+». Диагностически положительным считается свечение не менее чем на «++», при условии, что в контрольных препаратах, окрашенных гетерологической сывороткой, свечение отсутствует

Идентификация изучаемых сальмонелл также может быть проведена с помощью сальмонеллезного бактериофага, реакция с которым всегда высокоспецифична.

Методика: на поверхность подсушенного МПА в чашке Петри наносят две капли взвеси молодой изучаемой культуры сальмонелл. Тонко оттянутой пастеркой на одну из капель наносят О-бактериофаг, на контрольную — каплю бульона (перед работой ампулу с бактериофагом разводят по инструкции). Чашку с нанесенными культурами и О-бактериофагом ставят в термостат, через сутки учитывают результаты. Положительным результатом считают появление на месте внесения фага четко очерченной зоны лизиса с оценкой «++++», при наличии отдельных негативных колоний, в зависимости от их количества, реакцию оценивают на «+++», «++» или «+».

При отрицательном результате — отсутствие негативных колоний в местах нанесения О-бактериофага — будет сплошной рост нанесенной культуры, как и в контрольной капле.

Обнаружение подвижных (кроме S. pullorum и S. gallinarum) палочек, отрицательных по Граму, не ферментирующих лактозу и сахарозу, ферментирующих глюкозу и маннит с образованием кислоты и газа, не образующих индол, образующих Н2S, не разжижающих МПЖ, не расщепляющих мочевину, растущих на среде Симмонса (усваивающих цитратно-аммонийные соли), дающих отрицательную реакцию Фогес — Проскауэра и положительную пробу с метиловым красным, дающих положительную РА с диагностическими О-и Н-агглютинирующими сальмонеллезными сыворотками, указывает на присутствие бактерий из рода сальмонелла.

Если культура обладает ферментативными свойствами, типичными для сальмонелл, но не агглютинируется сальмонеллезными О-и Н-сыворотками, ее следует направить в Государственный институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

План работы.

1. Изучить культуральные свойства сальмонелл на МПА и МПБ в пробирках.

2. Приготовить препарат из агаровой культуры сальмонелл, окрасить по Граму и изучить под иммерсионным объективом.

3. Изучить биохимические свойства сальмонелл, провести биохимическую дифференциацию от культуры кишечной палочки на коротком пестром ряду (среды Гисса), агаре Эндо.

4. Провести серологическую идентификацию сальмонелл в РА на предметном стекле с применением О-комплексных и Н-монорецепторных агглютинирующих сальмонеллезных сывороток.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. На чем основана дифференциация сальмонелл от кишечной палочки на агаре Эндо?

2. С какой целью применяются среды обогащения при выделении

сальмонелл?

3. На чем основана серологическая идентификация сальмонелл?

4. Какие компоненты добавляют в элективные питательные среды

при выделении сальмонелл?