Цель занятия: изучить методы индикации возбудителя ту

беркулеза в исследуемом материале; ознакомиться с морфологическими, тинкториальными и культуральными свойствами возбудителя туберкулеза.

Материальное обеспечение: посевы возбудителя туберку

леза в пробирках с селективными средами; стереомикроскоп для изучения культуральных свойств; набор красок по Граму, по Цилю — Нильсену; спиртовки; бактериологические петли; предметные стекла; таблица «Схема бактериологической диагностики».

Возбудителями являются бактерии рода Mycobacterium, семейства Mycobacteriaceae. К возбудителям, имеющим значение в инфекционной патологии, относят возбудителя туберкулеза человека (Myc. tuberculosis), крупного рогатого скота (Myc. bovis) и птиц (Myc. avium).

Лабораторная диагностика туберкулеза.

Лабораторная диагностика туберкулеза состоит из обнаружения возбудителя в исследуемом материале методами световой и люминесцентной микроскопии, выделении чистой культуры, идентификации возбудителя по морфологическим, культуральным, ферментативным и патогенным свойствам.

Материалом для исследования служат лимфатические узлы — заглоточные, подчелюстные, бронхиальные, брыжеечные, печеночные, надвыменные, а также кусочки легких, печени и селезенки. Для прижизненной диагностики от исследуемых животных в лабораторию направляют пробы молока и спермы.

Обсемененность исследуемого материала возбудителем может быть незначительной, поэтому специальными методами обработки повышают концентрацию возбудителя и уничтожают сопутствующую микрофлору.

Для освобождения от посторонней, сопутствующей микрофлоры измельченный исследуемый материал, содержащий кислотоустойчивые микобактерии, растирают в ступке, заливают 6%-ным раствором серной кислоты на 10–20 мин в соотношении 1:4. Затем фильтруют от крупных частиц, центрифугируют, отмывают от кислоты и нейтрализуют 15%-ным раствором двууглекислой соды. Осадок суспендируют в небольшом количестве физраствора и используют для посева и приготовления мазков для микроскопии.

Для концентрации микобактерий в исследуемом материале применяют метод флотации. Для этого материал гомогенизируют в физрастворе и 10 мл гомогената вносят в колбу с узким горлом на 250 мл, добавляют 10 мл 1%-ного раствора гидроксида натрия. Колбу встряхивают в течение 10 мин, содержимое разбавляют в соотношении 1:10 дистиллированной водой, вносят 1–2 мл ксилола, смесь вновь встряхивают в течение 5–10 мин, добавляют дистиллированную воду до горлышка колбы и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Микобактерии концентрируются во флотационном кольце у горлышка колбы вместе с каплями ксилола, которые, всплывая на поверхность, увлекают за собой и микобактерии. Содержимое кольца используют для посева в питательные среды и приготовления мазков на предметном стекле.

Для прямого обнаружения микобактерий в нативном материале можно применить окрашивание раствором флуорохромов с последующей микроскопией под люминесцентным микроскопом.

Методика окрашивания по Цилю — Нильсену: микобактерии характеризуются высоким содержанием липидов, миколовой кислоты, поэтому с трудом воспринимают анилиновые красители. Их окрашивание достигается при применении концентрированного основного фуксина Циля.

1. Готовят мазок на предметном стекле из исследуемого материала; высушивают на воздухе и фиксируют химическим или физическим методом.

2. На мазок кладут кусочек белой фильтровальной бумаги (2´2 см), на который наносят основной карболовый фуксин Циля и в течение 5–7 мин красят при подогревании; краску необходимо доливать по мере испарения (при этом в красный цвет окрашиваются как туберкулезные палочки, так и сопутствующая микрофлора); бумагу сбрасывают.

3. Для обесцвечивания наносят 5%-ный раствор серной кислоты на 1–3 с (очень важный момент дифференциации кислотоустойчивых бактерий, поэтому заранее надо оттитровать время обесцвечивания посторонней микрофлоры, так чтобы туберкулезные палочки не успели обесцветиться).

4. Тщательно промывают водой.

5. Докрашивают посторонние бактерии метиленовой синью 3–5 мин.

6. Промывают водой.

Микрокартина: кислотоустойчивые туберкулезные палочки красного цвета, сопутствующая микрофлора — синяя.

При дифференциации микобактерий учитывают морфологические, культуральные, ферментативные и патогенные свойства.

В препаратах Myc. tuberculosis имеет вид тонких прямых или слегка изогнутых палочек, расположенных беспорядочно или в виде определенных скоплений, Myc. bovis — короткие и грубые палочки, Myc. avium — самые полиморфные, могут быть палочковидные, нитевидные и даже кокковидные.

Лучшие результаты для индикации возбудителя туберкулеза дает применение люминесцентного метода микроскопии. Для обнаружения возбудителя туберкулеза препарат обрабатывают растворами флуорохромов с последующим изучением препарата в люминесцентном микроскопе. Данный метод позволяет обнаружить даже незначительное количество микобактерий в препарате, которые на темном фоне видны как светящиеся желто-зеленые палочки.

Для молекулярных методов индикации возбудителя туберкулеза фирма «Нарвак» выпускает тест-систему для идентификации и дифференциации M. bovis, M. tuberculosis в ПЦР.

Выделение чистой культуры и ее идентификация: микобактерии туберкулеза — строгие аэробы, температурный оптимум — 37–38°С при рН 6,4–7,0. Для них характерен медленный обмен веществ, что приводит к замедленному росту на питательных средах.

Перед посевом исследуемый материал подготавливают, как указано выше, делают посев одновременно в 5–10 пробирок с плотной средой. Посевы регулярно просматривают, пробирки с ростом посторонних микроорганизмов выбраковывают. Через неделю пробки парафинируют и выдерживают до 3 мес. Для выделения культур применяют многокомпонентные, сложные по составу питательные среды со стимуляторами роста — Гельберга, Петраньяни и др. (в состав последней входят молоко, картофельный крахмал, пептон, картофель, яйца, глицерин, водный раствор малахитовой зелени).

Myc. tuberculosis на плотных питательных средах образует рост в виде сухого морщинистого налета кремового цвета, в глицериновом МПБ на 15–30 день появляется сухая морщинистая пленка, поднимающаяся по стенкам колбы, которая постепенно утолщается, среда остается прозрачной.

На плотных питательных средах первичный рост Myc. bovis появляется на 20–60 сут. в виде морщинистого налета, на котором образуются бородавчатые колонии кремового цвета; на жидких питательных средах образует тонкую морщинистую пленку, при этом среда остается прозрачной.

На плотных питательных средах на 15–30 сут. при первичном посеве Myc. avium образует сливающиеся бугристые, иногда слизистые колонии. В жидких питательных средах чаще образует как поверхностный (в виде морщинистой бугристой пленки), так и придонный рост.

Для изучения ферментативных свойств микобактерий целесообразно применять безбелковые синтетичесткие среды Сотона, Моделя.

Биопроба: заражение лабораторных животных проводят для дифференциации отдельных видов микобактерий параллельно с изучением морфологических и культуральных свойств возбудителя. Данный метод основан на разной чувствительности морских свинок и кроликов к различным видам микобактерий. Так, M. bovis патогенен для морских свинок и кроликов,

M. tuberculosis — лишь для морских свинок, а M. avium — для кроликов и птиц.

При появлении клинических признаков заболевания лабораторных животных подвергают убою с последующим патологоанатомическим исследованием и приготовлением из пораженных органов мазков, которые окрашивают по методу Циля — Нильсена. При наличии в них характерных микобактерий подтверждают положительный диагноз на туберкулез, и биопробу прекращают.

Серологическая диагностика: постановку РСК рекомендуют как дополнительный метод при отборе для диагностического убоя животных, положительно реагирующих на туберкулин.

План работы.

1. Изучить культуральные свойства вакцинного штамма возбудителя туберкулеза на среде Петраньяни.

2. Приготовить препарат из вакцинного штамма возбудителя туберкулеза, специально загрязненного посторонней микрофлорой, и окрасить по Цилю — Нильсену. Микрокартину изучить и зарисовать. Обратить внимание на дифференциацию возбудителя туберкулеза от посторонней микрофлоры.

3. Провести микроскопию демонстрационного препарата на туберкулез под люминесцентным микроскопом.

4. Ознакомиться с биопрепаратами для профилактики и диагностики туберкулеза.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. На чем основывается суть окраски по Цилю — Нильсену?

2. Какие питательные среды применяют для культивирования возбудителя туберкулеза? Какие компоненты обязательно входят в

их состав?

3. Какой метод применяется для обработки исследуемого материала для освобождения от сопутствующей микрофлоры?