Цель занятия: изучить методы индикации возбудителя бру

целлеза в исследуемом материале; ознакомиться с морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами возбудителя бруцеллеза.

Материальное обеспечение: посевы возбудителя бруцел

леза в пробирках с МППГГА и МППГГБ (мясопептонный печеночный глюкозо-глицериновый агар и бульон); стереомикроскоп для изучения культуральных свойств; набор красок по Граму, по Козловскому; спиртовки; бактериологические петли; предметные стекла; физиологический раствор; пипетки пастеровские, градуированные, автоматические; таблица «Схема бактериологической диагностики инфекционных болезней».

Необходимы компоненты для постановки пробирочной РА, для постановки роз-бенгал пробы, для постановки РСК, для постановки кольцевой реакции с молоком (для положительной пробы в молоко добавляют капли бруцеллезной сыворотки).

Возбудителями бруцеллеза являются бактерии рода Brucella: B. melitensis — возбудитель бруцеллеза овец и коз; B. abortus — возбудитель бруцеллеза крупного рогатого скота; B. suis — возбудитель бруцеллеза свиней; B. ovis — возбудитель бруцеллеза овец; B. neotomae — возбудитель бруцеллеза крыс; B. canis — возбудитель бруцеллеза собак.

Лабораторная диагностика бруцеллеза.

Лабораторная диагностика бруцеллеза состоит из обнаружения возбудителя в исследуемом материале методами световой и люминесцентной микроскопии; выделении чистой культуры; идентификации возбудителя по морфологическим, культуральным, ферментативным, серологическим, патогенным свойствам и идентификации по комплексу признаков.

Материалом для прижизненной диагностики являются абортированный плод с околоплодными оболочками; для серологического исследования направляют сыворотку крови, молоко. При убое животных отбирают паренхиматозные органы, лимфатические узлы, пораженные суставы, у самцов — семенники.

Микроскопическое исследование: из присланного материала готовят мазки-отпечатки, окрашивают их по Граму и изучают морфологические свойства сальмонелл под микроскопом. Brucella представляют собой коккобактерии или мелкие палочки величиной 0,5–1,5 мкм, неподвижные, грамотрицательные, истинной капсулы не образуют. В препаратах располагаются одиночно, беспорядочно, редко парами.

Если исследуемый материал загрязнен посторонней микрофлорой, рекомендуется применить специальный метод окрашивания бруцелл по Козловскому, основанному на «феномене запаздывания» бруцелл к окрашиванию вторым красителем.

Методика окрашивания бруцелл по Козловскому.

1. На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу (2´2 см), на которую наносят 2%-ный водный раствор сафранина и окрашивают в течение 2 мин при подогревании (до кипения не доводить). Все бактерии (бруцеллы и посторонние) принимают цвет сафранина.

2. Краску смывают водой.

3. Дополнительно окрашивают 1%-ным водным раствором малахитовой зелени — 30–60 с. За это время успевают окраситься только посторонние бактерии, а у бруцелл наблюдается «феномен запаздывания» к окрашиванию вторым красителем, поэтому они остаются розовыми.

4. Краску смывают водой.

Микрокартина: бруцеллы ярко-розовые, а посторонняя микрофлора успевает окраситься в зеленый цвет.

Выделение чистой культуры и ее идентификация: возбудители Brucella по типу дыхания являются аэробами или микроаэрофилами, оптимальная температура культивирования — 37°С при рН 6,8–7,4. Для выращивания бруцелл применяют специальные среды: мясопептонный печеночно-глюкозный глицериновый бульон и агар с добавлением 1% глюкозы и 2–3% глицерина (МППГГБ и МППГГА); эритрит-агар, стимулирующий рост бруцелл; сывороточно-декстрозный агар с добавлением 10% сыворотки и 1% декстрозы. При подозрении загрязнения исследуемого материала сопутствующей микрофлорой его засевают на среды с ингибиторами (генцианвиолет 1:200 000, уксуснокислый натрий 0,25 мг/мл).

Микроаэрофильные свойства проявляют такие возбудители, как B. abortus, B. ovis, которые при первичном выделении из патматериала требуют повышенное содержание оксида углерода (до 10–12% СО2), они растут медленно (до 30 дней), поэтому их рост контролируют и периодически просматривают посевы. Типичные штаммы бруцелл на поверхности агара образуют мелкие прозрачные S-формы колонии, которые по мере старения мутнеют (не исключается появление R-форм), в бульоне наблюдается равномерное помутнение и пристеночное кольцо, на дне — рыхлый осадок.

Для идентификации и дифференциации выделенных культур ставят большое количество тестов. Изучают потребность в оксиде углерода; способность расти на питательных средах в присутствии некоторых ингибиторов (анилиновые краски — тионин и фуксин); выделение сероводорода и образование индола (см. тему «Ферментативные свойства»); ферментацию углеводов; проверяют оксидазную и каталазную активность, подвижность, способность редуцировать нитраты, чувствительность к бруцеллезным бактериофагам, патогенность к лабораторным животным.

Определение потребности выделенных бруцелл в оксиде углерода проводится по следующей методике: часть пробирок с посевами помещают в эксикатор, в который через газомер вводят СО2 до содержания 5–10%, эксикатор ставят в термостат и культивируют при 37°С. Одновременно другую часть посевов для контроля культивируют в обычных условиях, полученные посевы сравнивают и анализируют. Дело осложняется тем, что

некоторые биовары B. abortus могут вырасти и без повышенного содержания СО2.

Определение способности расти на питательных средах в присутствии некоторых ингибиторов: готовят питательные среды с анилиновыми красками в определенной концентрации — тионин (1:25000) и фуксин (1:50000). Так, культуры B. abortus и B. melitensis не растут на среде, содержащей тионин, а B. ovis растет на средах и с тионином и с фуксином.

Для выявления бруцелл непосредственно в патологическом материале, а также в объектах окружающей среды, предложен прямой метод иммунофлуоресценции; непрямой метод позволяет обнаружить антитела в сыворотке больных, переболевших или вакцинированных животных.

Определение чувствительности к фагам проводят по следующей методике: делают посев изучаемых бруцелл на поверхность питательной среды в чашке Петри сплошным газоном и на посев наносят капли фага на определенном расстоянии друг от друга, чашки на сутки ставят в термостат при 37°С. В положительном случае появляются прозрачные зоны.

Для окончательной идентификации выделенных бруцелл ставят РА с диагностическими агглютинирующими R-и S-сыворотками.

Методика: на предметное стекло наносят капли R-и S-сывороток и каплю физраствора, в них суспендируют выделенную культуру. Если исследуемая культура даст положительную РА («++» и более) с обеими или с одной из диагностических сывороток и отрицательную реакцию с физраствором, то ее относят к виду Brucella. Для контроля R-сыворотки проверяют в разведении, указанном биофабрикой, с роз-бенгал и цветными антигенами; S-сыворотки — в титре, указанном на упаковке с цветным антигеном и в неразведенном виде с роз-бенгал антигеном.

Для обнаружения бруцелл в патологическом материале, обильно обсемененном посторонней микрофлорой, проводят биопробу на восприимчивых морских свинках, которым подкожно вводят 1 мл суспензии (1:10) из исследуемого материала. У морских свинок бруцеллез протекает хронически, поэтому у них берут кровь на 15, 25, и 40-й день, в сыворотке которой в РА определяют наличие антител. Положительная РА в

разведении 1:10 и выше свидетельствует о заражении бруцеллезом, далее для выделения чистой культуры бруцелл морских свинок умерщвляют, делают посевы из лимфоузлов, селезенки, печени и костного мозга.

Культуры бактерий, обладающие типичными морфологическими, тинкториальными, культуральными, ферментативными свойствами и давшие положительную РА с позитивной бруцеллезной сывороткой, относят к бруцеллам.

С помощью роз-бенгал пробы (РПБ) исследуют большое количество животных в сжатые сроки. РБП относится к качественным реакциям, так как с ее помощью можно выявить наличие антител в сыворотке крови больного животного, но нельзя определить их титр. Сыворотки, давшие положительную РБП, дополнительно исследуются в пробирочной РА и РСК.

Методика постановки РБП: на предметное стекло наносят 0,3 мл исследуемой сыворотки крови животного и 0,03 мл бруцеллезного антигена (это компонент биофабричного изготовления с этикеткой, представляет собой взвесь бруцелл, окрашенных розовым бенгальским). Осторожным покачиванием стекла компоненты перемешивают и через 3–5 мин учитывают результат. В положительном случае появляются розовые комочки агглютината.

Кольцевая реакция с молоком (КР) относится к ориентировочным, ее применяют для проверки благополучных по бруцеллезу молочных стад и для контроля молока на рынке.

Методика постановки КР: в бактериологические пробирки наливают по 2 мл исследуемого молока, добавляют 0,1 мл антигена (взвесь бруцелл, окрашенных гематоксилином). Пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при 37°С на 45 мин, содержимое окрашивается в фиолетовый цвет. В положительном случае бруцеллы агглютинируют и адсорбируются на капельках жира, который, поднимаясь вверх, окрашивает тонкий слой сливок в фиолетовый цвет, само молоко становится белым. В отрицательном случае, когда нет антител в молоке, неокрашенные сливки поднимаются вверх, образуют белое кольцо, а само молоко остается равномерно окрашенным в фиолетовый цвет. В сомнительном случае слой сливок слабо окрашен, столбик молока приобретает фиолетовый цвет.

Серологическая диагностика: при массовых диагностических исследованиях ставят пробирочную РА, роз-бенгал пробу (РБП на стекле), РСК, РДСК, кольцевую реакцию с молоком (КР).

Пробирочную реакцию агглютинации ставят в объеме 1 мл. Сыворотки крупного рогатого скота, лошадей, собак, пушных зверей, верблюдов разводят 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором; сыворотки крови овец, коз, буйволов разводят 5,0%-ным, а сыворотки оленей — 10%-ным фенолизированным физиологическим раствором. Сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов исследуют в разведениях от 1:50 до 1:400; овец, коз, свиней, буйволов, оленей и собак — в разведениях 1:25 и более; пушных зверей — 1:10 и более. При массовых исследованиях сыворотки крови ограничиваются постановкой РА в двух первых разведениях. После приготовления нужных разведений сыворотки в объеме 0,5 мл в каждую пробирку добавляют 0,5 мл разведенного до концентрации клеток 5Ч108 мл единого бруцеллезного антигена (при

этом надо учитывать, что степень разведения исследуемой сыворотки в пробирке удваивается), компоненты перемешивают осторожным встряхиванием, штатив с пробирками ставят в термостат при 37°С на 18–20 ч, затем оставляют на несколько часов при комнатной температуре. Результат учитывают по общепринятой системе. В качестве контрольной параллельно ставят реакцию с заведомо положительной и отрицательной сывороткой (это эталон положительной и отрицательной РА).

РА при бруцеллезе крупного рогатого скота, лошадей и верблюдов считают положительной, если титр составляет 1:100 и более (1:50 сомнительный результат), у овец, коз, оленей, буйволов и собак — 1:50 (1:25 сомнительный результат). При получении сомнительных результатов у этих животных через 3– 4 недели повторно берут кровь и с сывороткой вновь ставят РА. Обычно в ходе массовых серологических исследований ограничиваются постановкой реакции от каждого животного в первых двух разведениях.

Реакцию связывания комплемента (РСК) ставят в объеме 1 мл. Предварительно инактивированные в течение 30 мин сыворотки крови (лошадей — при 56–58°С; крупного рогатого скота и свиней — при 60–62°С, овец и коз — при 58–60°С) исследуют в разведении 1:5–1:10. Положительным результатом РСК (РДСК) считают задержку гемолиза на «++» и более в разведении сыворотки крови 1:5.

План работы.

1. Изучить морфологические и культуральные свойства вакцинного штамма возбудителя бруцеллеза на МППГГБ и

МППГГА.

2. Приготовить препарат из культуры вакцинного штамма бруцеллеза на предметном стекле; окрасить по Граму; провести микроскопию.

3. Приготовить препарат из вакцинного штамма возбудителя бруцеллеза, специально загрязненного посторонней микрофлорой, и окрасить по Козловскому. Провести микроскопию, обратить внимание на дифференциацию возбудителя от посторонней микрофлоры. Препарат изучить и зарисовать.

4. Поставить роз-бенгал пробу — РА на стекле; оценить картину положительной и отрицательной реакции, их отличие.

5. Поставить кольцевую реакцию с молоком, оценить положительную реакцию, объяснить наличие окрашенного кольца.

6. Ознакомиться с результатами готовой пробирочной РА, встряхнуть осадок-агглютинат, описать картину положительной и отрицательной реакции.

7. Познакомиться с биопрепаратами, применяемыми для профилактики бруцеллеза.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. На каком свойстве бруцелл основана окраска по Козловскому?

2. Какие питательные среды применяют при культивировании возбудителя бруцеллеза?

3. Перечислите все серологические методы диагностики бруцеллеза.

4. В каких случаях применяется кольцевая реакция с молоком?

5. Почему РБП относится к качественным реакциям?