Цель занятия: ознакомиться с морфологическими, культу

ральными и биохимическими свойствами возбудителя сибирской язвы; изучить методы индикации возбудителя сибирской язвы в исследуемом материале.

Материальное обеспечение: посевы вакцинного штамма

возбудителя сибирской язвы в пробирках с МПА и МПБ, в чашках Петри с изолированными колониями; стереомикроскоп для изучения культуральных свойств; набор красок по Граму, Ольту, Михину; спиртовки; бактериологические петли; предметные стекла; набор реактивов для постановки теста «жемчужное ожерелье», для определения чувствительности к пенициллину и бактериофагу; готовый препарат на предметном стекле из патматериала для демонстрации капсул возбудителя сибирской язвы; компоненты для постановки РП; таблицы «Окраска капсул», «Схема бакдиагностики».

Возбудитель сибирской язвы — бактерия Bacillus anthracis, род Bacillus.

Bacillus anthracis является типичным представителем патогенных бацилл, относится к семейству Bacillacеaе и роду Bacillus.

Лабораторная диагностика сибирской язвы.

Лабораторная диагностика сибирской язвы состоит из обнаружения возбудителя в исследуемом материале методами световой и люминесцентной микроскопии; выделении чистой культуры; идентификации возбудителя по морфологическим, культуральным, ферментативным и патогенным свойствам. При подозрении на сибирскую язву категорически запрещается вскрывать трупы павших животных, поэтому материалом для лабораторного исследования является ухо павшего животного, на которое с особыми мерами предосторожности накладывают две лигатуры, а место среза прижигают. Исследуемый материал помещают во влагонепроницаемую тару, пломбируют, указывают верх тары, оформляют сопроводительный документ и направляют в лабораторию.

Микроскопическое исследование: в лаборатории из крови уха готовят мазок, окрашивают по Граму, капсулы — по Ольту (или Михину), а также обрабатывают сибиреязвенными люминесцирующими сыворотками. В препаратах, окрашенных по Граму, видны крупные грамположительные палочки (6–10 мкм), соединенные в короткие цепочки. В препаратах, окрашенных по Ольту или Михину, концы палочек, обращенных друг к другу, резко обрублены и слегка втянуты, свободные концы закругленные, клетки окружены общей капсулой, что является важным диагностическим признаком.

Микрокартина настолько специфична, что предварительный ответ дают немедленно по результатам исследования.

Для выделения чистой культуры возбудителя, который является факультативным анаэробом, исследуемый материал вносят в МПБ и МПА (рН 7,2–7,4) и выдерживают 24 ч в термостате при 37°С. Выросшие культуры просматривают, изучают культуральные свойства. Типичные для B. anthracis крупные, серо-белые колонии R-формы, края которых под малым увеличением имеют вид завитков, получивших название «львиная грива». В препаратах, приготовленных из агаровой бактериальной культуры, бактерии располагаются в виде длинных цепочек. МПБ остается прозрачный, на дне появляется хлопьевидный осадок. По мере старения бактерий, при накоплении продуктов метаболизма в культуральной жидкости, возбудитель сибирской язвы образует споры (бациллы), располагающиеся в центре палочки. Они не образуются при температуре ниже 12°С и выше 42°С, а также в живом организме или невскрытом трупе.

Для выделения чистой культуры возбудителя сибирской язвы из исследуемого материала, загрязненного посторонней микрофлорой, делают посев в селективные среды, в состав которых вводят 200–500 ЕД/мл полимиксина в сочетании с триметопримом, которые подавляют рост E. coli, B. subtilis, B. cereus и др.

При появлении сомнительных данных в результате бак- териологических исследований применяют дополнительные тесты с целью дифференциации выделенной культуры от сходных сапрофитных бацилл (например, B. cereus). При этом определяют способность выделенного возбудителя к кап- сулообразованию путем посева на сывороточные среды, па- тогенность для лабораторных животных, чувствительность к пенициллину и бактериофагу, гемолитическую активность, специфичность к сибиреязвенным люминесцирующим сыво- роткам.

Для дифференциации выделенной культуры от сапрофи- тов ставят тест «Жемчужное ожерелье». Для чего готовят ряд последовательных разведений пенициллина и три колбочки с 20 мл расплавленного и охлажденного до 50°С МПА. В пер- вую колбу вносят 10 ЕД пенициллина, получают агар, содер- жащий 0,5 ЕД/мл; во вторую колбу вносят 1 ЕД пеницилли- на и получают агар с 0,05 ЕД/мл пенициллина; третью кол- бочку оставляют без пенициллина для контроля. Содержимое всех трех колбочек разливают в стерильные пробирки по 5 мл в каждую и скашивают. Во все пробирки вносят по 0,25 мл 3-часовой исследуемой бульонной культуры. Посевы помеща- ют в термостат при 37°С в наклонном положении, так чтобы бульонная культура распределилась по всей поверхности ко- сого агара.

Через три часа из конденсационной жидкости пробирок берут каплю материала, делают мазок, высушивают на воз- духе, фиксируют химическим методом и окрашивают про- стым методом или по Граму. Под воздействием пенициллина только палочки сибирской язвы изменяются и приобретают шаровидную форму, появляется сходство с ожерельем из бус, поэтому при микроскопии такой культуры будут видны це- почки из шарообразных форм — феномен «Жемчужное оже- релье».

Споровые сапрофитные аэробы (B. cereus, B. mycoides, B. subtilis, B. mesentericus, B. megatherium), как правило, не образуют шарообразные формы, а сохраняют обычную форму палочек, т. е. дают отрицательный ответ при постановке это- го теста.

Для определения чувствительности выделенной культуры к сибиреязвенному бактериофагу ее засевают «методом газона» на поверхность МПА в чашке Петри. Затем на поверхность за- сеянной среды наносят каплю бактериофага в рабочем титре, дают ей стечь в виде дорожки, посевы выдерживают в течение 24 ч в термостате при 37°С. В случае принадлежности исследуе- мой культуры к B. anthracis, в зоне нанесения бактериофага остается стерильная (вернее, прозрачная) полоса, при наличии роста культуры во всей чашке.

Иммунофлуоресцентный тест: флуоресцирующую адсор- бированную сыворотку, не дающую перекрестных реакций с антигенно-родственными сапрофитными бациллами, применя- ют для идентификации выделенного возбудителя методом флуо- ресцирующих антител.

Определение способности выделенной культуры образовывать капсулу в условиях in vitro: на обычных питательных сре- дах возбудитель сибирской язвы не образует капсулу, но при добавлении сыворотки крови в питательную среду (например, в среде ГКИ) культура формирует капсулу.

Для проведения пробы готовят питательную среду ГКИ (к 60 мл раствора Хенкса добавляют 40 мл инактивированной сыворотки крови крупного рогатого скота, раствором двуугле- кислого натрия устанавливают рН 7,2) и разливают по 2 мл в пробирки, которые закрывают резиновыми пробками. Иссле- дуемую культуру петлей вносят в пробирку со средой ГКИ, ста- вят в термостат при 37°С, результаты контролируют микроско- пией. Через 60–120 мин у отдельных сибиреязвенных палочек начинается капсулообразование, а через 16–18 ч большинство из них образует капсулу.

Гемолитическую способность изучают посевом выделенной культуры на кровяном МПА в чашках Петри. Возбудитель си- бирской язвы, в отличие от сапрофитов (B. cereus), не обладает гемолитическими свойствами, что является дифференцирую- щим признаком от сапрофитов.

Если для исследования поступил загнивший материал, из которого нельзя выделить чистую культуру сибирской язвы, то в нем определяют наличие специфических антигенов при помо- щи реакции кольцепреципитации. Для этого материал экстра- гируют в течение 30–40 мин «горячим способом», т. е. кипяче- нием в физиологическом растворе (в соотношении 1:10). Полу- ченный экстракт фильтруют через асбестовую вату и исследуют по обычной методике в РП.

Биопроба: для постановки биопробы на животных, часть исследуемого материала растирают в ступке с небольшим ко- личеством физиологического раствора. Двум белым мышам вво- дят 02–0,5 мл гомогената под кожу в области спины. Наблюде- ние ведут в течение 10 дней, в случае гибели мышей их вскры- вают: из крови сердца, печени, селезенки и места заражения готовят мазки, а из органов делают посевы для выделения чис- той культуры.

Основанием для постановки диагноза на сибирскую язву является: наличие в мазках из патологического материала кап- сулообразующих бактерий, а в препаратах из колоний — грам- положительных, неподвижных бацилл; на питательных сре- дах — характерный рост; чувствительность к пенициллину и бактериофагу, положительный тест в РП и положительный ре- зультат биологической пробы.

План работы.

1. Изучить культуральные свойства возбудителя сибирской язвы на МПА и МПБ в пробирках и изолированных колоний на МПА в чашках Петри с применением стереомикроскопа, обра- тить внимание на характерные колонии.

2. Приготовить препарат из агаровой культуры вакцинно- го штамма сибирской язвы. Окрасить по Граму; изучить под микроскопом морфологические и тинкториальные свойства воз- будителя сибирской язвы.

3. Поставить РП методом наслаивания с биофабричными компонентами.

4. Ознакомиться с результатами демонстрационного по- сева споровых сапрофитных аэробов (B. cereus) на кровяном агаре.

5. Ознакомиться с результатами определения чувствительности выделенной культуры к пенициллину и сибиреязвенному бактериофагу.

6. Ознакомиться с вакцинами, гипериммунными сыворотками и диагностическими препаратами.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Особенности схемы бактериологической диагностики сибирской

язвы.

2. Какие морфологические особенности возбудителя сибирской язвы

отличают его от других микроорганизмов?

3. Какие культуральные особенности у возбудителя сибирской язвы?

4. Почему нужно соблюдать меры предосторожности при работе с

патматериалом, который содержит возбудителя сибирской язвы?

5. Обладает ли возбудитель сибирской язвы гемолитическими свойствами?