Цель занятия: ознакомиться с морфологическими, культу

ральными и биохимическими свойствами патогенных кокков — стафилококков и стрептококков; изучить методы индикации возбудителей стафилококкозов и стрептококкозов в исследуемом материале.

Материальное обеспечение: посевы культур стафилокок

ка и стрептококка в пробирках с МПА и МПБ, в чашках Петри с изолированными колониями для изучения культуральных свойств с помощью стереомикроскопа; чашки Петри для демонстрации метода диффузии в агар при определении чувствительности бактерий к антибиотикам; для демонстрации: кровяной агар — колонии с гемолизом, желточно-солевой агар с положительной лецитовителлазной пробой, оценить реакцию плазмокоагуляции (свернувшаяся плазма не должна выливаться из пробирки); готовые препараты с мытным стрептококком и возбудителем диплококковой септицемии; набор красок по Граму; метиленовая синь; спиртовки; предметные стекла; бактериологические петли; готовые препараты из патматериала при диплококковой септицемии, гноя и чистой культуры стафилококка и стрептококка для демонстрации; таблица «Схема бакдиагностики при патогенных кокках».

К патогенным коккам относятся бактерии рода Staphylococcus, Streptococcus (Diplococcus). Все они способны вызывать нагноительные процессы кожи и подкожной клетчатки, протекающие локализованно или принимающие генерализованный характер (пиемия, сепсис), диплококковая септицемия молодняка сельскохозяйственных животных.

Лабораторная диагностика стафилококкозов.

Стафилококкозы вызывают бактерии рода Staphylococcus из семейства Micrococcaceae. Официально утверждены три вида: S. aureus, S. epidermidis и S. saprophyticus. Стафилококки вызывают у человека и животных стафилококкозы, различные нагноительные процессы: фурункулы, карбункулы, маститы, гнойное воспаление ран, сепсис и септикопиемию; у коров получил распространение стафилококковый мастит. Токсигенные штаммы, попав в продукты питания, вызывают пищевые токсикозы.

Лабораторная диагностика стафилококкозов состоит из обнаружения возбудителя в исследуемом материале методами световой и люминесцентной микроскопии, выделении чистой культуры, идентификации возбудителя по морфологическим, культуральным, ферментативным, серологическим и патогенным свойствам.

Материалом для исследования служат раневой экссудат, гной из абсцессов, кровь при септицемии, молоко при маститах из пораженной доли и кусочки паренхиматозных органов.

Микроскопическое исследование: из исследуемого материала готовят препараты, окрашивают их метиленовой синью, а также по Граму, микроскопируют и изучают морфологические и тинкториальные свойства. В положительном случае обнаруживают грамположительные кокки диаметром 0,5–1,0 мкм, которые не образуют спор и капсул, располагаются единично, парами, в виде скоплений неправильной формы и гроздьев винограда.

Выделения чистой культуры и идентификации ее: стафилококки относятся к факультативным анаэробам. Они хорошо растут на обычных питательных средах при температуре 35–40°С, оптимум рН 7,2–7,4. На МПА они образуют мелкие колонии S-формы различной пигментации: белые, чаще желтые. На МПБ появляется обильное помутнение и рыхлый осадок.

Исследуемый материал, загрязненный сопутствующей микрофлорой, вносят в элективные среды: на солевой МПА с 8–10%

хлорида натрия (на нем сопутствующая микрофлора не растет); на молочно-солевой агар, который применяют для выделения стафилококков из исследуемого материала (гноя, молока), на котором стафилококки образуют выраженный пигмент; на среду Байрд — Паркера, где они растут в виде черных блестящих колоний, окруженных узкой белой каймой; на МПА с добавлением 3 мл 0,1%-ного раствора кристаллвиолета, на котором патогенные стафилококки образуют колонии фиолетового цвета.

После получения чистой культуры на МПА и МПБ изучают морфологические, тинкториальные, культуральные и ферментативных свойства возбудителя, а также приступают к изучению признаков, свидетельствующих о патогенности выделенной культуры. Патогенные штаммы стафилококков ферментируют маннит, выделяют лецитиназу, бактериальные гемолизины, лизирующие эритроциты; выделяют плазмокоагулазу, благодаря которой облегчается персистенция бактерий в тканях и затрудняется их фагоцитоз; синтезируют фермент гиалуронидазу, фактор инвазивности, деполимеризующий межклеточное вещество.

Методика определения гемолизина: на поверхности кровяного агара делают посев изучаемой культуры штрихом и ставят в термостат на 24 ч. Если возбудитель выделяет гемолизин, он диффундирует в агар и вызывает лизис эритроцитов, вокруг изолированных колоний образуется прозрачная зона гемолиза.

Методика определения плазмокоагулазы: в пробирку с 0,5 мл цитратной плазмы крови кролика, разведенной физраствором (1:5), вносят петлю чистой суточной культуры стафилококка и ставят в термостат при 37°С. Реакцию плазмокоагуляции предварительно учитывают через 3–4 ч, осторожно, не встряхивая пробирку. В сомнительных случаях пробирки оставляют в термостате для окончательного учета на 24 ч. Реакцию считают положительной, если плазма коагулирует в сгусток (реакцию оценивают по степени плотности сгустка от одного до четырех плюсов).

Методика определения гиалуронидазы: в качестве источника гиалуронового субстрата можно использовать бактериальную культуру Pasteurella multocida серовар А. На поверхность питательной среды в чашке Петри штрихом засевают культуру P. multocida. Затем рядом в виде сплошной линии засевают

культуру изучаемого стафилококка, у которого выявляют способность к синтезу гиалуронидазы. Чашки с посевами ставят в термостат при 37°С на 16–24 ч. Если исследуемый возбудитель стафилококкоза выделяет гиалуронидазу, то она диффундирует из колонии в толщу питательной среды и разрушает капсулу тест-микроба. Это явление можно обнаружить только при просмотре колоний пастерелл в падающем свете под определенным углом: колонии P. multocida вблизи стафилококка по размеру меньше остальных и в отличие от флуоресцирующих отдаленных колоний — серого цвета.

Методика определения лецитиназы: готовят желточно-солевой агар в чашках Петри; делают посев изучаемой культуры штрихом; сутки культивируют в термостате. Вокруг колоний патогенного стафилококка, выделяющего лецитиназу, появляется отчетливо видимый золотисто-радужный венчик, такое явление называют лецитовителлазной реакцией.

Для идентификации выделенного стафилококка, выявления источников и путей его распространения можно также применить международный стандартный набор из 23 типов бактериофагов, с помощью которого можно типировать до 60–80% изолятов.

Для рациональной терапии больных животных, в связи с появлением антибиотикоустойчивых штаммов, предварительно проводят определение чувствительности выделенного возбудителя к различным антибиотикам. Суть метода состоит в том, что чистую культуру стафилококка наносят методом газона на поверхность МПА в чашках Петри. По поверхности засеянного агара раскладывают 5–6 бумажных дисков, пропитанных различными антибиотиками. Чашки ставят в термостат, антибиотики диффундируют в агар, через 20–24 ч проводят учет результатов. Вокруг антибиотиков, к которым чувствительны изучаемые стафилококки, появляется зона задержки роста, диаметр которой измеряют. Для лечения рекомендуют те антибиотики, вокруг которых была самая большая зона задержки роста — 20–32 мм.

Биопробой можно определить способность S. aureus продуцировать энтеротоксин. Для выявления энтеротоксина проводят внутривенное заражение кошек фильтратом из бульонной культуры изучаемого стафилококка (2–3 мл/кг), в положительном

случае у кошек возникают симптомы гастроэнтерита, развиваются рвота и диарея.

В продуктах с наличием стафилококков и их токсинов органолептические изменения не происходят. Интоксикации стафилококкового происхождения связаны с накоплением в инфицированной пище энтеротоксина. Классическое проявление интоксикации человека отмечается, когда в 1 г продукта содержится 105–107 стафилококков, способных вырабатывать токсин, менее 1 мкг которого вызывает пищевую интоксикацию.

Лабораторная диагностика стрептококкозов.

Наибольшее значение в инфекционной патологии сельскохозяйственных животных имеют следующие виды стрептококкозов: S. pneumonia — возбудитель стрептококковой септицемии молодняка сельскохозяйственных животных; S. agalactiae и S. disagalactia — возбудители мастита крупного рогатого скота; S. еque — возбудитель мыта лошадей; S. pyogenes — возбудитель ряда заболеваний, преимущественно человека.

Лабораторная диагностика стрептококкозов состоит из обнаружения возбудителя в исследуемом материале методами световой и люминесцентной микроскопии; выделении чистой культуры, идентификации возбудителя по морфологическим, культуральным, ферментативным, серологическим и патогенным свойствам.

Материалом для исследования при мыте являются носовые истечения, содержимое абсцессов лимфатических узлов, для посмертной диагностики — кровь из сердца и кусочки паренхиматозных органов. При подозрении на диплококковую септицемию — кровь из сердца, селезенка, печень, костный мозг. При стрептококковых маститах исследуют молоко из последних порций.

Микроскопическое исследование: из исследуемого материала — из носовых истечений при мыте лошадей; из гноя, экссудата, молока при мастите; при диплококковой септицемии молодняка и пневмонии — из паренхиматозных органов готовят мазки-отпечатки, окрашивают на капсулы и по Граму. Стрептококки чаще имеют вид цепочек, состоящих из круглых или овальных грамположительных кокков диаметром 0,6–1,5 мкм, без спор и жгутиков. Морфология некоторых стрептококков в

препаратах из патматериала имеет некоторые особенности: у S. pneumonia (по старой номенклатуре Diplococcus lanceolatus) парные кокки c удлинением концевой части, окруженные капсулой, что отразилось в названии; S. eque в мазках из гноя имеют вид длинных цепочек, а в препаратах из агаровой культуры — цепочки короче, при этом сами кокки сплющены. S. agalactiae и S. disagalactia везде имеют вид обычных цепочек. Препарат из патологического материала лучше окрашивать по Романовскому — Гимза или метиленовой синью, что дает нежный цвет и позволяет увидеть капсулу.

Стрептококки представляют собой круглые или овальные грамположительные кокки диаметром 0,5–1,25 мкм; неподвижные; спор не образуют; располагаются парами или короткими цепочками в зависимости от вида возбудителя. Например, кокки возбудителя пневмонии и диплококковой септицемии в препаратах из патматериала располагаются парно и окружены четко видимой прозрачной капсулой. Мытный стрептококк в препаратах из гноя располагается в виде длинных цепочек из мелких сплющенных кокков.

Выделение чистой культуры и ее идентификация: стрептококки относятся к факультативным анаэробам, оптимальная температура культивирования 37°С, рН 7,2–7,4. При культивировании требуют специальные среды, в которые добавляют 1% глюкозы, 5–10% стерильной инактивированной сыворотки крови кролика или барана. Многие из них обладают гемолитическими свойствами, в зависимости от способа разрушения эритроцитов стрептококки делят на три группы: бета-гемолитический тип, образующий прозрачную зону гемолиза, альфагемолитический тип, образующий зеленоватую зону гемолиза, и гамма-гемолитический тип, не вызывающий гемолиз эритроцитов.

При посеве на кровяном МПА S. pneumonia образует круглые полупрозрачные колонии с альфа-гемолизом, в МПБ — равномерное помутнение. S. eque растет в виде мелких росинчатых колоний S-формы с узкой зоной бета-гемолиза, в МПБ происходит легкое помутнение, и со временем на дне появляется осадок в виде крупинок. У S. agalactiae (S. disagalactia) на кровяном МПА появляются мелкие сероватые колонии с бета-гемолизом, при росте на МПБ бульон остается прозрачный,

а на дне образуется мелкозернистый осадок. S. pyogenes на кровяном МПА образует мелкие прозрачные S-формы колонии с зоной бета-гемолиза, в бульоне — равномерное помутнение, после которого он просветляется и на дне появляется зернистый осадок.

Для исключения стафилококковой и энтерококковой инфекции (род Enterococcus) выделенную культуру исследуют в нескольких направлениях. Характерной особенностью стрептококков является отсутствие каталазной активности: стафилококки образуют каталазу, стрептококки — нет. Для дифференциации S. pyogenes от энтерококков полученную культуру вносят в МПБ, содержащий 40% желчи крупного рогатого скота и в МПБ с 6,5% хлорида натрия. Энтерококки в отличие от гноеродных кокков растут на этих средах, что является дифференциальным признаком.

Также проверяют чувствительность выделенной культуры к желчи крупного рогатого скота. Для этого 0,5 мл исследуемой суточной бульонной культуры вносят в МПБ с 10% желчи и выдерживают в термостате 1 ч. Чувствительные стрептококки лизируются, а энтерококки устойчивы к желчи.

Для дифференциации S. pneumonia от прочих стрептококков применяют тест чувствительности к оптохину, который угнетает рост практически всех выделенных возбудителей.

Определения фибринолизина (стрептокиназы.) Многие гемолитические стрептококки образуют стрептокиназу, активизирующую протеолитический фермент плазмы (плазмин), который растворяет коагулированную плазму.

Методика: исследуемую культуру стрептококков бактериологической петлей наносят в одну точку в виде «бляшки» на агар с 12% цитрированной плазмы, так чтобы во время культивирования в термостате появилась большая изолированная колония. Чашку Петри с посевом ставят в термостат при 37°С на 24 ч. В положительном случае в агаре вокруг колонии-бляшки появляется зона просветления.

Серогрупповую принадлежность выделенной культуры определяют в РП, применяя стрептококковые преципитирующие сыворотки, выпускаемые биологической промышленностью. Исследуемую культуру выращивают в МПБ в течение 18 ч. Затем 7–9 мл культуры центрифугируют; надосадочную жидкость удаляют; к осадку добавляют 0,3–0,4 мл 0,2 Н раствора соляной кислоты; осадок суспендируют; взвесь прогревают в кипящей водяной бане 10 мин; охлаждают; добавляют каплю 0,04%-ного спиртового раствора фенолфталеина и нейтрализуют 0,2 Н раствором гидроксида натрия. Жидкость приобретает бледно-розовый цвет, ее повторно центрифугируют и надосадочную жидкость, содержащую термостабильный полисахаридный антиген С, используют как антиген для постановки реакции кольцепреципитации. По классификации Р. Ленсфильда стрептококки на основании антигенных свойств полисахарида С можно отнести к той или иной серологической группе: А, В, С, D и т. д. S. pneumonia не содержит групповой полисахарид, но является антигенно-гетерогенным видом, который дифференцируют на типы в РА.

Стрептококки можно быстро идентифицировать при обработке мазков-отпечатков моноклональными антителами, мечеными флуоресцеинами.

Биопроба: для изучения патогенных свойств выделенных культур проводят биопробу на молодых белых мышах. Для заражения используют свежевыделенную бульонную культуру, которую вводят внутрибрюшинно трем мышам по 0,5 мл. Культура считается патогенной при гибели двух мышей.

Таким образом, заключительный бактериологический диагноз основывается на учете морфологических, тинкториальных, культурально-ферментативных и патогенных свойств возбудителя, выделенного из патологического материала.

План работы.

1. Изучить культуральные свойства стафилококков, стрептококков, выросших на питательных средах в чашках Петри и в пробирках с сывороточным МПБ.

2. Приготовить препараты на предметном стекле из суточной культуры всех представленных стафилококков и стрептококков; окрасить по Граму; провести микроскопию. Обратить внимание на морфологические особенности всех перечисленных стрептококков и сравнить их (размеры, форма, наличие капсулы, взаиморасположение).

3. Изучить на демонстрационных посевах гемолитические свойства на кровяном агаре в чашках Петри; оценить лецитовителлазную пробу на желточно-солевом агаре, провести учет реакции плазмокоагуляции.

4. Ознакомиться с профилактическими, диагностическими биопрепаратами. Бактериологическое исследование включает обнаружение возбудителя в исследуемом материале методом световой и люминесцентной микроскопии, выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя по комплексу признаков.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Какие инфекционные болезни вызывают стафилококки и стрептококки?

2. Какие морфологические свойства характерны только для стафилококков и стрептококков?

3. Как изучают патогенные свойства стафилококков?

4. Какие элективные среды применяют при выделении стафилококков из исследуемого материала?