Более 95% казеина в молоке находится в мицеллярной форме. Мицеллы казеина - близкие к сферической форме частицы размером от 30 до 300 нм и молекулярной массой от 2,6-10⁷ до 510⁹ (чаще от 610⁸ до 6-10⁹) . Каждая мицелла содержит от нескольких тысяч до сотен тысяч молекул всех четырех типов казеинов. Шарообраз­ная форма мицелл играет важную роль в обеспечении их высокой устой­чивости, так как при одинаковой массе удельная поверхность минималь­на у частиц шарообразной формы. В то же время, чем ниже удельная поверхность коллоидных частиц, тем ниже у них запас свобод­ной энергии, тем выше стабильность при прочих равных условиях. Диа­метр мицелл уменьшается при снижении в среде содержания неоргани­ческих компонентов, особенно кальция и фосфора. Средний состав мицеллы показан в табл. 2.2.

Структура мицеллы казеина окончательно не установлена, несмотря на интенсивное ее изучение. Предложены два принципиальных типа мо­дели мицеллы казеина: каркасная (скелетная) и субмицеллярная. Согласно каркасной модели мицелла казеина представляет непрерывную трехмерную сетку свернутых полипептидных цепей a_s,-казеина, с кото­рыми посредством мицеллярного фосфата кальция связывается æ-казеин; β-казеин удерживается на каркасе слабыми гидрофобными связями и может легко покидать мицеллу и снова в нее входить.

Субмицеллярная модель (рис. 2.1) полагает, что мицеллы составле­ны из сотен дискретных частиц - субмицелл диаметром 10-20 нм, в ко­торых молекулы казеинов гидрофобно связаны друг с другом. Существуют два типа субмицелл: F₂ и F₃ (Опо & Tagaki, 1986; Опо & Obata, 1989; Aori, 1989). Субмицеллы F₂ состоят из a_sl- и æ-казеина, их диаметр равен 20 нм; субмицеллы F₃ диаметром 10 нм состоят из α- и β-казенное. Субмицеллы удерживаются в составе мицелл, главным образом, коллоидным фосфатом кальция (ККФ).

Формы Са и фосфатов в мицелле говяжьего казеина приведены в табл. 2.3. В молоке в среднем содержится 30 мМ Са (120 г/100 кг) и 22 мМ Р_н (неорганического фосфора) (68 г/100 кг). В мицеллах содержится ~ 2/3 Са и 1/2 Р_н 20-38% (в среднем 30%) растворенного в молоке Са, или около 10% от общего содержания, находится в ионизированном виде.

Са в мицелле представлен двумя формами: коллоидным (нераство­римым) фосфатом кальция (ККФ) и казеинатом кальция (органический Са) в примерном соотношении 3:1. Р₀ (органический фосфор) входит в состав казеина: остатки фосфорной кислоты ковалентно соединены с радикалами оксиаминокислот - серина и треонина.

ККФ - аморфный комплекс неорганического Са и Р с отношением Са к Р, равным примерно 3:2; в состав комплекса также входят Mg и цитраты. Весь Р_н мицеллы входит в ККФ. ККФ прикреплен к фосфосерильным остаткам казеинов через кальциевые мостики. Holt et al. (1989 г.) предложили ККФ, связанный с фосфосерильными группами казеинов (Р₀), считать единым комплексом, назвав его мицеллярным фосфатом кальция (МФК). МФК находится в коллоидной форме и выделяется вместе с казеином при осаждении и ультрацентрифугировании [402]. В этом случае Са и Р в мицелле будет находиться в двух формах: мицел­лярного фосфата кальция (неорганический Са + неорганический и орга­нический Р) и казеината Са.

Концентрация кальция в МФК не зависит от активности ионов Са в молоке, а в составе казеинатов Са (органический Са) зависит. Органиче­ский Са, наряду с растворенным в сыворотке Са, является источником ионов Са. Мицеллы начинают распадаться при удалении из них более 20% ККФ хелатными соединениями или повышением кислотности, а также повышением pH выше 9 мочевиной, солянокислым гуанидином или подобными агентами. Органический Са играет роль в стабилизации мицелл.

Гидрофобные участки α-, β- и æ-казеинов погружены внутрь суб­мицелл и образуют неполярное ядро субмицеллы. Полярные фосфосерильные группы α- и β казеинов и почти не содержащий фосфатов гид­рофильный гликомакропепгид (МП) æ-казеина, несущие отрицательные заряды, окружают ядро. Более гидрофобные Р₃-субмицеллы расположе­ны в ядре мицеллы, более гидрофильные Р₂-субмицеллы - на поверхно­сти. Цепочки МП æ-казеина, соединенные с основной гидрофобной его частью связью между фенилаланином в положении 105 и метионином в положении 106 (Фен₁₀₅ - Мет₁₀₆), в виде ворсинок (волосков) выступают над поверхностью мицеллы. Удельный внутренний объем мицелл при­близительно равен 2,2 мл на г сухого веса, внешний (гидродинамиче­ский), включающий наружный ворсистый (волосообразный) слой, - око­ло 3,9 мл/г. По другим данным, внешний удельный объем варьирует в интервале от 1,5 до 7,1 мл/г протеина, достигая максимума при pH 5,4. Таким образом, МП занимает довольно большое про­странство. Изменение доли æ-казеина на 1 % изменяет диаметр мицеллы на 20%, поскольку при снижении дозы æ-казеина на поверхности мицел­лы образуются незащищенные от агрегации с другими мицеллами участ­ки и мицелла начинает расти до тех пор, пока вся поверхность не будет защищенной (за счет снижения удельной поверхности).

Полярные участки полипептидных цепей субмицелл типа F₃ тоже выступают над поверхностью мицеллы и активно взаимодействуют с водной фазой молока.

Мицеллы казеина отличаются высокой устойчивостью к нагрева­нию. Свежее молоко с pH 6,6-6,7 свертывается при 100° С за несколько часов, при 130° С - более чем за 20 мин, при 140° С - за 20 мин и 150° С - за несколько секунд. Часть пептидных и фосфатных связей казеина разрушается даже во время нагревания молока до 95° С, что доказывается появлением в молоке свободного неорганического фосфа­та и увеличением содержания небелкового азота, но эта степень денату­рации казеина недостаточна для агрегации мицелл и свертывания моло­ка. Исследования японских ученых показали, что выдержка концентри­рованного (1:2,5) молока в течение 15, 75 и 135 с при 135-140° С вызы­вает дезинтеграцию мицелл казеина без свертывания молока.

Мицеллы могут быть получены в виде гранул ультрафильтрацией молока с последующим восстановлением без каких-либо повреждений.

Они не разрушаются при механической обработке молока, на­пример, при гомогенизации.

Стабильность мицелл казеина обеспечивается гидратацией (сольва­тацией), поверхностным зарядом, стерической устойчивостью. Полярные группы a_s- и β- казенное, МП æ-казеина в мицелле взаи­модействуют с растворителем, в результате вокруг мицеллы образуется гидратный слой, изменение величины которого в зависимости от pH пока­зано на рис. 2.2. По Fox, в зависимости от температуры степень гидратации мицелл составляет от 0,5 до 4,0 г/г казеина, в среднем - 2 г/г.

Степень гидратации белков молока зависит от его тепловой обра­ботки: для сырого молока она составила 2,29 г Н₂0 /г сухих веществ, по­сле нагревания при 85° С в течение 10 мин - 3,44 г/г. Обработка молока, подвергшегося и не подвергшегося нагреву, реннетом изменила степень сольватации соответственно до 2,64 и 2,78 г Н₂0/г сухих веществ. Степень сольватации уменьшалась при снижении pH и зависела от вида кислоты, используемой для подкисления. По величине сольватации бел­ков кислоты располагались в следующем порядке: уксусная > соляная > фосфорная > молочная. Подкисление молока, подвергнутого тепловой обработке, до pH 5,8-6,0 предотвращало его сычужную свертываемость.

Нет единой точки зрения на то, насколько прочно связана вода в мицелле казеина, хотя широкие колебания массовой доли влаги в ми­целле свидетельствуют о том, что большая часть ее связана мицеллой непрочно. Тем не менее наличие вокруг нативной мицеллы гидратной оболочки из молекул воды, достаточно прочно удерживаемой полярны­ми группами и в определенной степени придающей стабильность ми­целле, не вызывает сомнений. Отщепление от æ-казеина МП уменьшает величину гидратного слоя приблизительно в 1,5 раза (рис. 2.2).

В результате адсорбции ионов и ионизации остатков аминокислот на поверхности мицеллы казеина образуется отрицательный заряд. Он невелик (от минус 8 до минус 20 мВ при pH 6,7 и 20° С), но достаточен для того, чтобы противостоять силе молекулярно­го притяжения между мицеллами казеина при их сближении. Больше половины поверхностного заряда (примерно минус 12 мВ) обусловлено МП, выступающим над поверхностью мицеллы. Поверхностный заряд постепенно снижается при падении pH с 6,7 до 6,0, затем скорость его снижения резко возрастает при понижении pH до 5,4, после чего величина заряда начинает увеличиваться, пока pH не снизится примерно до 5,1. После этого заряд снова уменьшается при снижении pH и становится равным нулю при pH 4,6 (изоэлектрическая точка). Минимальное значение ξ-потенциала при pH 5,3-5,4 обу­словлено адсорбцией ионов Са мицеллами. Поверхностный заряд обес­печивает электростатическую стабильность мицеллы.

Стабильность мицеллы в молоке в основном обусловлена æ-казе­ином, в частности его гидрофильной частью - МП. При низком содер­жании æ-казеина на поверхности мицеллы остаются незащищенные участки и мицелла продолжает расти, при этом доля субмицелл, содер­жащих æ-казеин, в ядре мицеллы снижается, а размеры мицелл увели­чиваются. Чем выше содержание æ-казеина, тем меньше размер мицелл при прочих равных условиях.

Часть казенное не входит в состав мицеллы. Этот казеин называет­ся «растворимым»; он в основном представлен β-казеином и, вероятно, находится в молоке в виде мономеров. Массовая доля растворенного казеина в свежем молоке составляет 5-10% от общего содержания. Она увеличивается при снижении температуры молока и уменьшается при повышении концентрации ионов кальция и массовой доли æ-казеина. Часть казеина молока переходит в растворимую форму в результате высокотемпературной обработки молока.

Мицеллы казеина нестатичны. В молоке нормального состава они находятся в состоянии динамического равновесия со средой. Мицеллы подвержены многочисленным изменениям: от броуновского движения ворсистого внешнего слоя до диффузии ионов, молекул или их частей, как в мицеллу, так и из нее. Приблизительно 45% Са мицеллы может принимать участие в обменных процессах за 1 час и 63% - за двое суток (Yamauchi & Yoneda, 1977).

Если мицеллу раздробить, то ее фрагменты снова соединяются друг с другом с образованием частиц, подобных исходной мицелле. После разрушения мицеллы восстанавливаются за несколько минут, преимущественно за счет гидрофобных взаимодействий белков.

Выдержка молока в течение нескольких часов при низких темпера­турах сопровождается потерей мицеллой части ККФ, значительного ко­личества β-казеина, в меньшей степени æ-казеина, но, как это ни парадок­сально, повышает стабильность мицеллы по отношению ко всем видам свертывания. Выход части β-казеина из мицеллы при низких температу­рах может быть связан с ослаблением гидрофобных связей или диссоциа­цией части ККФ, или с обоими этими факторами. Между выходом из мицеллы β-казеина и коллоидного Са имеется связь (рис 2.3)

Выход из мицелл казеина белков во время хранения при низких температурах носит обратимый характер, хотя обратный процесс требует длительного времени и идет не до конца. Для восстановления минерального состава мицелл молока, выдержанного 48 ч при 2-4° С, требуется 18-24 ч при 20° С. Снижение pH также сопровождается со­любилизацией ККФ (рис. 2.4).

Разноречивы данные о значении pH, при котором ККФ полностью растворяется: это или pH 5,2-5,3 при 20-30° С, или pH 4,9-5,0 при 0-20° С (Davies & White, 1986; Pyne & McGang, 1986). Из исследований Dalgleish & Law (1989) вытекает, что ККФ при 20° С полностью раство­ряется при pH 5,8. Различия в этих данных, очевидно, обусловлены раз­личиями в методике исследований.

После полного удаления ККФ в мицеллах остается 14-16% от об­щего содержания Са, который находится в форме казеината кальция. Этот Са можно удалить из мицеллы только после полного растворения ККФ. Весь Са, но не весь Р₀ удаляется из мицеллы в изоэлектрической точке.

Параллельно с солюбилизацией ККФ при снижении pH из мицеллы в сыворотку выходят казенны в порядке: β > æ>α. Степень диссоциации казеинов зависит от pH и температуры (рис. 2.5).

После достижения максимума степень диссоциации казеинов на­чинает снижаться и становится равной нулю в изоэлектрической точке. В интервале pH от 6,8 до 4,8 степень диссоциации казеинов увеличивает­ся с понижением температуры от 35 до 4° С. Максимальное количество растворенного казеина при 4, 20 и 30° С равняется соответственно око­ло 60, 30 и меньше 10% от его общего содержания в молоке.

Степень диссоциации различных типов казеинов в зависимости от температуры меняется неодинаково. Доля растворенного æ-казеина в интервале pH от 6,8 до 5,4 не зависит от pH, но в большой степени зави­сит от температуры: при 4, 20 и 30° С она равняется 8, 15 и 20% от об­щего содержания растворенного казеина. При дальнейшем снижении pH по направлению к изоэлектрической точке доля лæ-казеина в содер­жании растворенного казеина при температурах больше 20° С снижает­ся. Доли немицеллярных a_s!- и β-казеинов также не зависят от pH в ин­тервале 6,8-5,4, но сильно зависят от температуры и составляют при 4, 20 и 30° С соответственно 8 и 75, 15 и 55, 55 и 25%. Сильная зави­симость степени диссоциации индивидуальных казеинов от температу­ры свидетельствует о различии их связей в мицеллах.

Диссоциация ККФ, очевидно, главная причина выхода казеинов из мицелл при снижении pH при температурах больше 20° С. Повышение температуры и pH увеличивает содержание в молоке ионизированного Са, а добавление воды, хлористого натрия, цитрата или других веществ, способных образовывать хелатные высокомолекулярные соединения, снижает содержание Са и Р в мицелле.

Выход ККФ и казеинов из мицеллы сопровождается изменением ее параметров. Степень гидратации мицеллы немного снижается при по­нижении pH от 6,6 до 6,0, затем увеличивается, с достижением макси­мума при pH 5,3-5,4, когда весь ККФ выходит из мицеллы и диссоциа­ция казеинов достигает максимума. Объяснить это можно тем, что вы­ход казеинов из мицеллы увеличивает ее пористость, что способствует проникновению сыворотки в мицеллу. При дальнейшем снижении pH уменьшаются степень диссоциации казеинов, поверхностный заряд и степень гидратации мицеллы; последняя достигает минимума в изо­электрической точке казеина. Частичная замена кальция натрием при pH 6,6-6,5 увеличивает гидратацию.

При 30° С и pH 5,3 появляются мелкие мицеллы: субмицеллы, вы­шедшие из мицелл, или новые мицеллы, образовавшиеся из покинув­ших мицеллу казеинов. Пастеризация сырого молока (74° С, 30 с) не предотвращает миграцию β-казеина из мицеллы при 4° С.

Описанные изменения в составе мицелл казеина характерны толь­ко для нативных мицелл; мицеллы после воздействия на них молокос­вертывающих энзимов ведут себя по-иному (разд. 2.5).