Все молокосвертывающие энзимы, достаточно широко используемые в сыроделии, принадлежат к кислым протеазам, проявляющим макси­мальную активность в кислой среде. Они характеризуются высоким со­держанием дикарбоновых аминокислот, низким содержанием основных аминокислот. Их еще называют аспарагиновыми протеазами, потому что в их активном центре имеются два остатка аспартата. Кислые протеазы содержат 325-360 аминокислотных остатков; молекулярная мас­са их находится в пределах 33000-38000. Молекулярные массы говяжьего химозина и свиного пепсина равны 35600 и 34600 соответственно.

Молокосвертывающие энзимы животного происхождения выделяют­ся в виде проферментов, которые превращаются в активные энзимы путем отщепления от N-терминального конца ингибитора, содержащего около 45 аминокислотных остатков. Плесневые кислые протеазы обра­зуются в активной форме. Активизацию проферментов ини­циируют водородные ионы. Активизация - процесс автокаталити- ческий, протекает при pH 2,0—4,6. На молочные заводы препараты мо­локосвертывающих энзимов поступают в активной форме и концентрированном виде.

В природе нет энзимов, катализирующих разрыв только связи Фен105-Мет₁₀₆ в æ-казеине, но молокосвертывающие энзимы должны расщеплять эту связь во много раз быстрее, чем другие связи в протеи­нах молока, так как весь æ-казеин должен быть гидролизован молокос­вертывающими энзимами во время выработки сыра, иначе не произой­дет коагуляция казеина или значительная часть казеина останется в сы­воротке. Любая другая протеолитическая активность молокосверты­вающих энзимов во время выработки сыра нежелательна, так как рас­творимые продукты протеолиза остаются в сыворотке, что снижает вы­ход сыра. По-видимому, теряется для сыра и макропептид, отделяемый от æ-казеина в результате гидролиза молокосвертывающими энзимами, но с этим нужно мириться, так как без гидролиза æ-казеина сычужный сыр выработать нельзя.

Способность быстро гидролизовать æ-казеин - общее свойство мо­локосвертывающих энзимов, применяемых в сыроделии, - называют молокосвертывающей активностью, в отличие от способности расщеп­лять другие связи в белках, получившей название общей протеолити­ческой активности. Общая протеолитическая активность молокосвер­тывающих энзимов по отношению к молокосвертывающей должна быть как можно более низкой.

Одна часть кристаллического химозина может свернуть 72 млн. час­тей молока при 35° С. Химозин гидролизует в æ-казеине связь Фен_105-МеТ₁₀₆ в 200 раз быстрее, чем другие связи. Это обусловле­но составом и последовательностью расположенных рядом с ней амино­кислот. æ-Казеины женского и свиного молока вообще не содержат этой связи, но оба гидролизуются говяжьим химозином, хотя и медлен­нее, чем æ-казеин коровьего молока. По данным Foltman с соавт., говя­жий химозин свертывает коровье молоко в два раза быстрее, чем свиное, а свиной химозин свертывает свиное молоко в шесть раз быстрее, чем коровье.

Молокосвертывающие энзимы существенно различаются по отно­шению общей протеолитической активности к молокосвертывающей. При оптимальном для каждого фермента pH и равной молокос­вертывающей активности соотношение общей протеолитической актив­ности (по гемоглобину) говяжьего химозина, говяжьего и свиного пеп­сина составило 1:3:6. На рис. 2.6 показан гидролиз казеина неко­торыми молокосвертывающими препаратами при pH 5,5, близком к pH созревающих сыров и содержимому желудка телят в молочный период. Неспецифический протеолиз (избыточный по отношению к хи­мозину) после 3-часовой инкубации составил для свиного пепсина 0,275 мг, для говяжьего - 0,10 мг, для смеси химозин + говяжий пепсин - 0,05 мг, что соответствовало 87,9; 30 и 12% к протеолизу под действием химо­зина. Химозин обладает самой низкой общей протеолитической актив­ностью по отношению к молокосвертывающей активности.

Характер протеолиза в результате совместного действия молокос­вертывающих энзимов и Lc. lactis subsp. lactis зависит от вида энзима: если содержание растворимого белка, пептидов и свободных аминокис­лот в обезжиренном молоке с сычужным порошком после роста молоч­ного лактококка принять за 100%, то оно будет равно соответственно: в молоке со свиным пепсином 41,1; 105,5; 22,8%; с куриным пепсином 45,2; 125 и 17,7%. При замене сычужного порошка пепсинами содержание растворимых белков и свободных аминокислот в результате кооперативного протеолиза уменьшилось, а содержание пептидов уве­личилось. Появление горечи в сырах связано с накоплением в них спе­цифических пептидов.

Следует отметить более высокую общую протеолитическую ак­тивность промышленных препаратов сычужного порошка по сравнению с кристаллическим химозином (рис. 2.7), что обусловлено наличием в первых не только химозина, но и пепсинов. После расщепления æ-ка­зеина и свертывания молока кристаллическим химозином содержание продуктов протеолиза практически не увеличивается, тогда как при ис­пользовании сычужного порошка их накопление идет интенсивнее до свертывания и продолжается после свертывания.

Более низкая общая протеолитическая активность химозина по сравнению с пепсинами имеет важное физиологическое значение, по­скольку новорожденные в первый период жизни не имеют собственных защитных систем и нуждаются в нативных иммуноглобулинах молозива для защиты от инфекций.

Гидролиз других, чем Лæ-казеин, казеинов молокосвертывающими энзимами протекает во время созревания сыров. Исключением являются твердые сыры с высокими температурами II нагревания и с плавлением сырной массы, во время выработки которых молокосвертывающие эн­зимы полностью или частично разрушаются. Участие молокосверты­вающих энзимов в протеолизе во время созревания сыра необходимо для формирования органолептических показателей созревающих сыров, но количественные и/или качественные отклонения от нормального хо­да протеолиза вызывают пороки вкуса и консистенции. Под нормаль­ным протеолизом в сыроделии понимают протеолиз под действием хи­мозина при характерных для сыра условиях.

Более высокая общая протеолитическая активность молокосверты­вающих энзимов по сравнению с химозином, как правило, оказывает отрицательное влияние на качество сыров, особенно с длительными сроками созревания. Например, потери молочного жира с сывороткой были выше, а плотность сгустка и качество сыра Чеддер ниже при ис­пользовании для свертывания молока пепсина вместо химозина. Однако сыры, вырабатываемые с кристаллическим химозином, имеют менее выраженный вкус и медленнее созревают, по сравнению с сыра­ми, вырабатываемыми из этого же молока и по этой же технологии, но с сычужным порошком. Следовательно, общая протеолитическая актив­ность молокосвертывающих энзимов в определенной степени необхо­дима для получения сыров высокого качества.

Химозин в растворе атакует α- и β- казенны, хотя они не имеют свя­зи Фен-Мет. Первичный участок расщепления β-казеина лежит на участке связей 189-193. Образующийся в результате разрыва связи фраг­мент 1-189 называют β-1 казеином. Далее в результате разрыва связи 166-167 или 164—165 образуется β-II казеин, разрыв связи 139-140 дает β-III казеин. Пептиды образуются именно в этой последовательности, что может быть обусловлено различной скоростью атаки указанных связей или изменениями конформации β-казеина в процессе гидролиза. В сырах химозин и пепсин не атакуют β-казеин, что может быть связано с низкой активностью воды или иммобилизованным состоянием β-казеина.

Атака химозином α-казеинов направлена на связи, включающие фенилаланин или лейцин. Первичная атака на а-казеин направлена на связи Фен₂₄-Фен₂₅ или Фен₂₄-Вал₂₅ с образованием пептида a_srI- казеина. Дальнейший протеолиз может идти в растворе и сыре с последователь­ным образованием пептидов II, III, IV и так до XX. Под действием хи­мозина и свиного пепсина из α-казеина образуется a_sl-I пептид, но этот пептид далее расщепляется только химозином.

Гидролиз а- и β-казеинов идет с гораздо более низкой скоростью, чем æ-казеина, но благодаря длительности созревания и участия протео­литических энзимов микрофлоры закваски к концу созревания α_s1-казеин и часть β-казеина бывают расщеплены. Пептиды, получающиеся в результате гидролиза казеинов молокосвертывающими энзимами, более доступны, чем исходный казеин, для протеолитических энзимов молоч­нокислой микрофлоры, которые играют главную роль в созревании твердых сыров. Участие в созревании, т. е. в формировании характер­ных для сыров органолептических показателей, — вторая функция моло­косвертывающих энзимов в сыроделии.

Из молокосвертывающих энзимов по общей протеолитической ак­тивности ближе всего к химозину стоит говяжий пепсин, свиной пепсин обладает более высокой общей протеолитической активностью; наиме­нее пригоден для сыроделия куриный пепсин. Однако по другим данным, белый рассольный сыр, выработанный с цыплячьим пепсином или его смесью с реннетом, ничем не отличались от контрольных, вы­работанных только с реннетом, кроме более высокого содержания сухих веществ и общего азота.

Плесневые протеазы по общей протеолитической активности отли­чаются от химозина и говяжьего пепсина, что отрицательно влияет на консистенцию сыров, вырабатываемых с их участием, оставляя ее прием­лемой для потребителя. Сравнение протеолитической активности фромазы и сычужного порошка показано на рис. 2.8 (по материалам фирмы «Гист-Брокадес»), Количественные различия в протеолитической ак­тивности, оцениваемой по отношению небелкового азота к общему со­держанию азота казеина, между реннетом и фромазой незначительны. Однако даже такие различия могут сказаться на выходе сыра и эконо­мичности применения фромазы; кроме того, они могут отличаться по спектру образуемых продуктов гидролиза.

Большинство авторов оценивают молокосвертывающие энзимы по продолжительности свертывания молока и технологическим свойствам сгустка, т. е. по наиболее важным для сыроделия показателям. Однако сы­чужное свертывание молока состоит из двух фаз, а молокосвертывающие энзимы принимают участие только в первой фазе. Зависимости между про­цессами в этих фазах и условиями среды далеко неодинаковы. Поэтому результаты опытов на молоке зависят от свойств не только молокосверты­вающих энзимов, но и молока, и характеризуют систему молоко-энзим.

Многие авторы при изучении сычужной свертываемости молока ис­пользуют промышленные препараты молокосвертывающих энзимов, яв­ляющихся смесью энзимов, количественный и качественный состав кото­рых может отличаться от партии к партии. В этом случае результаты опы­тов характеризуют не энзим, а конкретную партию его препарата.

И, наконец, физико-химические факторы влияют как на скорость катализируемой реакции, так и на стабильность самого энзима, причем характер этого влияния на каждый процесс различается для разных эн­зимов. Протеолитическая активность энзимов в сырах может сущест­венно отличаться от их активности в жидких средах. Так, сыры из мо­лока, свернутого свиным пепсином, имеют удовлетворительные харак­теристики, потому что свиной энзим почти полностью инактивируется во время выработки сыров, и его высокая общая протеолитическая ак­тивность в сырах не реализуется.

Степень участия молокосвертывающих энзимов в созревании зависит от того, сколько их остается в сыре. Количество химозина, остающегося в сыре, увеличивается при снижении pH сыворотки и сырной массы.

Оптимальный pH для общей протеолитической активности при прочих одинаковых условиях равняется для пепсинов 2, для гастриксина - примерно 3, химозина - 3-4, плесневых протеиназ - 3—4. Эти значения существенно отличаются от интервалов pH, характерных для производства сыров, что в определенной степени снижает отрицатель­ное влияние на качество сыров повышенной, по сравнению с химози­ном, общей протеолитической активности кислых протеиназ, приме­няемых в сыроделии.

Стабильность молокосвертывающих энзимов зависит от ионной силы среды, температуры, продолжительности выдержки и концентра­ции энзимов. Пепсин и химозин автолизируются при величине pH, оптимальной для их общей протеолитической активности. Плесневые протеиназы стабильны при pH до 2,5.

Общим свойством молокосвертывающих энзимов является сниже­ние общей протеолитической активности при pH среды выше опти­мального уровня. Одной из причин этого является инактивация энзимов при высоком pH. Скорость инактивации зависит от вида энзима (рис. 2.9). Так, говяжий пепсин начинает инактивироваться после 20-ми­нутной выдержки только при pH выше 6,4, а при pH 7,0 сохраняет более трети исходной активности. В то же время свиной пепсин после 20-минутной выдержки при pH 6,4 теряет свыше 50% исходной активности, а при pH 7,0 почти моментально полностью инактивируется. Для сверты­вания молока с pH 6,6 за 5 мин, требуется одинаковая масса говяжьего и свиного пепсина, а при свертывании за 20 мин, свиного пепсина требует­ся в 2,5 раза больше, чем говяжьего. Быстрая инактивация свиного пеп­сина в слабокислой среде, какой является молоко, является главным недостатком его как молокосвертывающего энзима.

Оптимальный pH для гидролиза лæ-казеина химозином равен при­мерно 6,0, однако в интервале pH от 5,6 до 6,4 разница в скорости реак­ции невелика; активность снижается при pH выше 6,5 с несколько меньшей скоростью, чем для говяжьего пепсина (рис. 2.10). В интервале pH 6,6-6,7, характерном для молока в начале выра­ботки сыра, скорость гидролиза æ-казеина химозином остается доста­точно высокой. Куриный пепсин, гастриксин, фромаза стабильны в диа­пазоне pH, характерном для выработки и созревания сыра.

Молокосвертывающие энзимы различаются по отношению к тем­пературе. Изменение молокосвертывающей активности фромазы и сы­чужного порошка в зависимости от температуры показано на рис. 2.11 (по материалам фирмы «Гист-Брокадес»), Отношение к температуре говяжьего пепсина почти такое же, как у сычужного порошка. В поряд­ке возрастания устойчивости к нагреванию молокосвертывающие энзи­мы располагаются следующим образом: свиной пепсин, говяжий пеп­син, химозин, фромаза и М. pusillus протеазы.

Устойчивость к нагреванию понижается при повышении pH. Мо­локосвертывающая активность сычужного порошка максимальна при 45° С, чистого пепсина - при 35° С.

Желудочные протеазы млекопитающих показывают различную чувствительность к мочевине: пепсин к ней устойчив, химозин нет. Эти различия используют для их идентификации.

Обработка молока для выработки сыра 0,01-0,15% перекиси водо­рода повышает активность молокосвертывающих энзимов и микрофло­ры закваски, увеличение дозы перекиси до 0,03-0,15% оказывает инги­бирующее действие.

Исследования молокосвертывающей и общей протеолитической активности показывают явное преимущество химозина перед другими молокосвертывающими энзимами. Отношение молокосвертывающей активности к общей протеолитической у химозина равно 40:9, а у го­вяжьего пепсина 4:3, что свидетельствует о высокой общей протеолити­ческой активности пепсина, а следовательно, о большей опасности по­явления пороков в сырах, выработанных с пепсином.

Продукты протеолиза β-казеина химозином и плесневыми протеи- назами неодинаковы, за исключением одного пептида, однако они по­добны, чего нельзя сказать о продуктах его расщепления протеиназой Е. parasitica. Эти различия вызывают пороки органолептических пока­зателей сыра и снижают его выход на 1-2%. Чем продолжительнее созре­вание сыра, тем больше вероятность появления посторонних привкусов и пороков в сырах, вырабатываемых с заменителями сычужного порошка. Способом предотвращения этого является использование смесей моло­косвертывающих энзимов с более высокой и более низкой протеолитиче­ской активностью по сравнению с химозином. Низкую протеолитическую активность при производстве сыра проявляет свиной пепсин, так как зна­чительная часть его после свертывания молока инактивируется.

Несмотря на одинаковый основной механизм коагуляции молока различными молокосвертывающими энзимами, структуры образуемых ими сгустков существенно различаются, и эти различия не исчезают во время созревания сыра и обусловливают специфичность консистенции сыров.

Исследование возможности использования в сыроделии вместо сычужного порошка экстракта цветов артишока Cynara carbunculus по­казало, что опытные сыры содержали меньше микроорганизмов родов Enterobacterium, Lactococcus и Lactobacillus, отличались менее актив­ным протеолизом α- и βказеинов, но в них было выше отношение водо­растворимого азота к общему. Однако главным недостатком этого энзима был горький вкус сыра.