Данные о термоустойчивости пропионовокислых бактерий противо­речивы. По результатам опытов Алексеевой с соавт., во время пастериза­ции молока при 71° С в течение 15 с погибает 99,8-99,97% клеток пропио­новокислых бактерий и в пастеризованном молоке, поступающем в сыр­ную ванну, их количество составляло от менее 1 до 250 клеток/мл. В опытах Белоусовой 10 штаммов пропионовокислых бактерий выдержи­вали нагревание при 55, 60 и 65° С в течение 60,15 и 5 мин соответственно. При этом температуры 71-72° С явились критическими: нагрева­ние при 72° С в течение 10 с они выдерживают, а в течение 20 с уже не выдерживают. Молодые клетки более чувствительны к нагреванию, тер­моустойчивость в молоке выше, чем в бульоне. Двухчасовая выдержка молока при 55° С - температуре II нагревания при выработке крупных сы­ров - сильно уменьшает содержание пропионовокислых бактерий.

Для сыроделия особый интерес представляют минимальные темпе­ратуры для роста пропионовокислых бактерий. Изучение 33 коллекцион­ных и 16 неидентифицированных свежевыделенных штаммов пропионо­вокислых бактерий показало, что при 2,8° С только 3 свежевыделенные культуры дали сомнительный рост, при 7,2° С могли расти 12 свежевыде­ленных и 16 коллекционных штаммов, при 12,8° С росли все исследован­ные культуры за исключением двух коллекционных. Большинство штаммов пропионовокислых бактерий, выделенных из Советского сыра, не росли при 8-10° С, но один штамм, отнесенный к Р. jensenii, в 100 мл лактатной среды за 5 сут при 8-10° С образовал 14 мг С0₂.

Рост пропионовокислых бактерий в сырах во время их созревания в прохладных камерах вызывает самокол, что, очевидно, связано с недос­таточной пластичностью сырной массы при низких температурах. В связи с этим в производстве крупных сыров следует использо­вать только штаммы пропионовокислых бактерий, неспособные фермен­тировать лактаты в прохладных камерах для созревания. Следует отме­тить, что Р. shermanii могут образовывать СО₂ при 7° С не только из лак­татов, но и из свободных аминокислот.

Разработан способ экспериментальной селекции чувствительных к холоду мутантов пропионовокислых бактерий, заключающийся в обра­ботке родительской культуры Nметил-N'-нитро-нитрозогуанидином (150 мг/мл в течение 30 мин при 32° С), достаточной для уничтожения 99% клеток, с последующей инкубацией в среде с 2000 мг/мл пеницил­лина G при 14° С в течение 48 ч для отбора мутантов, неспособных рас­ти при температуре 14° С и ниже. Получено девять мутантов, ко­торые росли при 37° С с такой же скоростью, с какой росли родитель­ские штаммы, но намного медленнее родительских при 14° С.

В молоке даже при оптимальных температурах пропионовокислые бактерии размножаются медленно, некоторые виды и штаммы вообще не свертывают молоко, другие свертывают его в течение 2-9 сут. Скорость образования пропионовой и уксусной кислот повышалась в 2,25-1,5 раза при внесении в молоко дрожжевого экстракта и в 1,6-4,6 раза в присутствии лактата натрия. Пептонизированное молоко, гидролизат казеина и печеночный экстракт оказали менее сильное стимулирующее действие на пропионовокислые бактерии.

На накопление биомассы пропионовокислых бактерий оказывает влияние внесение в среду бесклеточных фильтратов или культуральной жидкости молочнокислых бактерий, используемых в производстве сыров с высокими температурами II нагревания. Характер влия­ния зависит от вида и штамма молочнокислых бактерий. Так, фильтраты термофильного стрептококка и L. helveticus, но не молочного лактококка, стимулировали развитие Р. freudenreichii subsp. freudenreichii и в меньшей степени subsp. shermanii. Выдержка при 80° С в течение 20 мин сущест­венно уменьшила стимулирующее действие фильтратов. Аминокис­лоты и пептиды, образуемые молочнокислыми бактериями, в частности L helveticus, за исключением треонина и цистина, использовались про- пионовокислыми бактериями. Сычужный порошок и плазмин в от­сутствие молочнокислых бактерий не влияют на размножение; в присут­ствии молочнокислых бактерий, осуществляющих дальнейший гидролиз (до свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов) продуктов расщепления казеина сычужным порошком и плазмином, рост пропионо­вокислых бактерий стимулируется. Однако слишком высокое содер­жание свободных аминокислот в среде может ингибировать рост пропио­новокислых бактерий. Добавление в сывороточную среду аспартата сти­мулировало рост Р. freudenreichii, но понизило долю пропионовой кисло­ты. образующейся при сбраживании лактата.

Выделенные из крупных сыров штаммы L rhamnosus и L. casei отри­цательно влияли на рост пропионовокислых бактерий в сырах с высокими и средними температурами II нагревания. Это же отмечали Климовский с соавт. Другие авторы отмечают стимулирование роста про­пионовокислых бактерий штаммами L casei и их положительное влияние на образование глазков и вкус сыра. Различие в результатах этих опытов вызвано условиями их проведения, в частности способами нейтра­лизации кислоты, образуемой лактобациллами, хотя нельзя исключить и образование некоторыми штаммами лактобацилл специфических анти­биотических веществ в дополнение к органическим кислотам.

В опытах Lee et al. при совместном развитии в среде с минималь­ным содержанием глюкозы в анаэробных условиях между L. plantarum и Р. shermanii наблюдался комменсализм, несмотря на снижение pH, которое однако лимитировалось содержанием глюкозы.

Из 12 штаммов термофильных лактобацилл рост пропионовокис­лых бактерий ингибировали 2 штамма L lactis, 2 штамма L. helveticus и I штамм L acidophilus. L. helveticus и L. acidophilus ингибировали II из 17 штаммов пропионовокислых бактерий, lactis ингибировал развитие небольшого количества штаммов. Ингибирующие факторы были термостабильные и термолабильные.

С другой стороны, использование культуральной среды некоторых штаммов мезофильных и термофильных лактобацилл в производстве концентрата пропионовокислых бактерий позволило не только увели­чить выход их биомассы, но и повысило скорость развития пропионово­кислых бактерий в крупных сырах. По-видимому, влияние мо­лочнокислых бактерий на рост пропионовокислых многопланово, вклю­чает образование стимулирующих и ингибирующих факторов.

Молочнокислые бактерии, в зависимости от рода, образуют разные изомеры молочной кислоты, а пропионовокислые бактерии сбраживают изомеры молочной кислоты с неодинаковой скоростью. В среде со смесью изомеров молочной кислоты пропионовокислые бактерии прежде всего используют L(+)-лактат, что должно учитываться при подборе мик­рофлоры заквасок для производства крупных сыров. В культуральной сре­де L helveticus концентрация L(+)-лактата выше, чем D(-)-лактата.

Противоречивы данные об устойчивости пропионовокислых бак­терий к поваренной соли, что, по-видимому, обусловлено ее зависимо­стью от штамма и других показателей среды, в частности от pH [401]. Antilla (1955) сообщал, что ингибирование роста пропионовокислых бак­терий начинается при содержании в среде 3% NaCl. Рост быстрорастущих штаммов пропионовокислых бактерий в лактатной среде при pH 7,0 инги­бировали 6% соли, при pH 5,2 - уже 3%, медленно растущие штаммы, наоборот, были более солеустойчивы при pH 5,2 (Rollman & Sjostrom, 1946). Наиболее устойчив к соли Р. shermanii (предельная концен­трация 6,7%, А_в = 0,955), что, очевидно, и является причиной преобладания этого подвида в Советском сыре. В опытах Алек­сеевой и Анищенко солеустойчивость пропионовокислых бактерий, выделенных из Советского сыра, изучалась в лактатной среде с pH 7,0 при 22° С. Из 23 исследованных штаммов наибольшую устойчи­вость к соли показали два штамма Р. shermanii и Р. technicum: они росли при 5,2% соли. В среде с 6,5% соли жизнеспособные клетки после 27 сут инкубации сохранились только у 6 штаммов. Скорость накопления био­массы в среде с 4,5% NaCl была в 10 раз ниже, чем в присутствии 1,4% NaCl. Чувствительность к соли зависит от штамма.

Содержание соли в зрелых отечественных сырах с высокой темпера­турой II нагревания (Советском, Швейцарском) обычно находится на уровне 1,5-2,0%, что составляет 3,8-5,0% в водной фазе; в сырах этого класса, вырабатываемых в Швейцарии, оно в среднем равно (%): в Эм- ментальском - 0,65 (1,8 в водной фазе), в Грюйере - 1,45 (3,9), в Аппен- целлере - 1,6 (3,9). Таким образом, уровень посолки зарубежных сыров с высокими температурами II нагревания ниже, чем отечествен­ных. В то же время интенсивность развития пропионовокислых бактерий в сырах зависит от уровня их посолки (табл. 3.23). Содержание пропионовокислых бактерий неодинаково в различных слоях головки сыра: в наружном слое Советского сыра, в котором концентрация соли в водной фазе составила 4,4%, в 90-суточном возрасте содержание пропио­новокислых бактерий равнялось 32-10⁶, в центральном слое с концентра­цией соли в водной фазе 2,9% - 69-10⁶ КОЕ/г. Для сравнения укажем, что в сырах этого класса, вырабатываемых в Швейцарии, количество пропио­новокислых бактерий в период максимума равняется (1-10)-10⁸ КОЕ/г , а содержание кислот в них показано в табл. 12.5. Сыр Советский отличается от Швейцарского (Эмментальский сыр часто называют просто «Швейцарским») не только значительно более низким содержанием соли, но и меньшей массой головки (11-18 по сравнению с 60-130 кг), что ус­коряет проникновение соли во внутренние слои головки и вызывает ин­гибирование развития пропионовокислых бактерий на более ранних ста­диях созревания сыра. Однако и в Советском сыре соль довольно медлен­но проникает во внутренние слои. Так, в 90-суточных сырах концентра­ция соли в водной фазе в центральных слоях была ниже, чем в слоях, прилегающих к поверхности головки, в зависимости от продолжительно­сти посолки в 1,3-1,5 раза, а содержание пропионовокислых бактерий, наоборот, выше в 2,1-2,6 раза. Таким образом, пропионовокислые бактерии практически на всем протяжении созревания имеют возмож­ность размножаться в центральных слоях Советского сыра даже с учетом высокой степени его посолки, однако неодинаковая скорость их развития в пределах головки влечет за собой и различия в органолептических пока­зателях: степень выраженности сырного вкуса усиливается, а твердость сырного теста снижается по направлению от периферии к центру.

Большая интенсивность пропионовокислого брожения в Эмменталь- ском сыре обусловливает его более выраженный вкус и аромат, но повышает чувствительность к маслянокислому брожению, по сравнению с Советским сыром. Из крупных сыров, вырабатываемых в Швейцарии, Эмментальский обладает более выраженным специфическим для этого класса сыров вкусом и более развитым рисунком, чем Грюйер и Аппенцеллер.

Ингибирующее действие соли на пропионовокислые бактерии сни­жается при повышении pH и увеличении содержания влаги в сыре. В мо­локе с 4% NaCl пропионовокислые бактерии растут, но начинают образо­вывать С0₂ значительно позднее, чем в молоке без добавления соли.

Оптимальный pH для пропионовокислых бактерий равен 6,8-7,2, что намного выше pH крупных сыров (5,2-5,6), однако и в крупных сы­рах pH выше минимального для роста пропионовокислых бактерий. Влияние pH на развитие в Советском сыре пропионовокислых бак­терий показано в опытах, проведенных в Алтайском филиале ВНИИМС. В опыте pH сыров регулировали степенью разбавления водой сыворотки после отбора 30% ее количества. Результаты этого опыта приведены в табл. 3.24. Перед помещением в бродильную камеру pH сыров II и III вариантов были выше pH контрольного сыра, во время выработки которого сыворотку не разбавляли водой, на 0,06 и 0,13 ед. соответственно. Количество пропионовокислых бактерий за период по­сле окончания посолки и до момента выхода из бродильной камеры воз­росло в контрольных сырах в 63,6 раза, в сырах II варианта - в 200 раз и III варианта - в 236 раз. Содержание этих бактерий в период максимума в сырах I, II и III вариантов находилось в отношении 1:2:3.

Недиссоциированная молочная кислота ингибирует рост пропионо­вокислых бактерий, степень этого ингибирования зависит от штамма и ви­да пропионовокислых бактерий. При исследовании Р. jensenii Р16 и P.freu- denreichii subsp. globosum P14, выделенных соответственно из вспученно­го и нормального сыра Грана, молочная кислота значительно сильнее ингибировала штамм Р14. Основная масса пропионовокислых бак­терий погибает при пастеризации молока; уцелевших после пастеризации клеток недостаточно для обеспечения нужного уровня пропионовокисло­го брожения в сыре. Достаточным количеством пропионовокислых бак­терий в Советском сыре при нормальном технологическом процессе бу­дет наличие в нем после прессования (2-4)-10³ КОЕ/г, что обеспечивается внесением в молоко после пастеризации 1-2 мл на 5000 л молока чистой культуры пропионовокислых бактерий или 1-2 тыс. КОЕ/мл. Следует, однако, отметить, что содержание пропионовокислых бактерий в Советском сыре в большей степени зависит не от их количества, вноси­мого в молоко, а от других факторов. В опытах Климовского с соавт. ко­личество внесенных в молоко пропионовокислых бактерий для выработ­ки сыров двух вариантов отличалось в 1800 раз, а максимальное их коли­чество в сырах - только в 1,5 раза, хотя при использовании большей дозы максимум наступил намного раньше.

Приведенные выше данные о чувствительности пропионовокислых бактерий к содержанию в сырах соли и pH казалось бы свидетельствуют о том, что именно эти факторы должны играть главную роль в темпах раз­вития пропионовокислых бактерий в Советском сыре. Однако в сырах должны быть и другие факторы, лимитирующие рост пропионовокислых бактерий. Если бы, например, концентрация соли в водной фазе сыра была единственным фактором, лимитирующим их рост, пропионовокислые бактерии прекращали бы размножаться в сырах в одно и то же время неза­висимо от дозы их внесения, когда концентрация соли в центральных слоях превысит максимальную границу для их развития. В предыдущем опыте количество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий в вариан­те с высокой посевной дозой перестало увеличиваться в сыре в конце его выдержки в теплой камере (через 40 сут), когда концентрация соли в цен­тральных слоях не бывает высокой, а в варианте с низкой посевной дозой их биомасса увеличивалась до конца созревания (100 сут), когда соль более равномерно распределяется в пределах головки.

В 1-ый период созревания Советского сыра при температуре 10-12° С пропионовокислые бактерии практически не размножаются. Не размножаются они в этот период и в Эмментальском сыре, хотя темпе­ратура его созревания на первом этапе (12-14° С) несколько выше, чем в производстве Советского сыра. Ацетаты и пропионаты в Эмментальском сыре не образуются до его помещения в теплую камеру (рис. 3.10).

Климовский с соавт. отсутствие размножения пропионовокислых бактерий на первом этапе созревания объясняют низкой температурой и высокой скоростью кислотообразования микрофлорой закваски в этот период. Повышение температуры созревания сыров в бродиль­ной камере (парилке) до 22-24° С призвано прежде всего обеспечить условия для роста пропионовокислых бактерий. Этому не противоречит часто наблюдаемое размножение пропионовокислых бактерий во время созревания сыра при 10-12° С после его выхода из бродильной камеры, так как pH сыров после парилки существенно повышается (табл. 3.34), а чувствительность пропионовокислых бактерий к низким температурам уменьшается с повышением pH. Однако объяснение Климовского с соавт. причин отсутствия размножения пропионовокислых бактерий в первый период созревания в прохладной камере недостаточно.

По данным итальянских ученых, пропионовокислые бактерии, вы­деленные из вспученных в результате их жизнедеятельности крупных сыров Пармиджано Регано и Грана Падано, размножались в сыре Грана, хотя и очень медленно, при комбинации трех факторов: температуры ниже 22° С, содержания более 2% соли и pH ниже 5,5. Во время предварительного созревания сыра при 10-12° С одной из причин от­сутствия их размножения могут быть сублетальные повреждения кле­ток, полученные во время обработки зерна при температурах II нагрева­ния, для устранения которых клетке необходимо определенное время. Кроме того, в этот период в сырах достаточно интенсивно размножают­ся цитратферментирующие мезофильные лактобациллы, многие из ко­торых образуют нестойкие антибиотические вещества, которые могут ингибировать рост пропионовокислых бактерий.

Некоторое увеличение продолжительности первого периода позво­ляет пропионовокислым бактериям полнее репарировать сублетальные повреждения клеток бактерий. К тому же, эта мера увеличивает биомас­су мезофильных лактобацилл к моменту помещения сыров в теплую камеру, а следовательно, увеличивает количество энзимов в сырной массе, необходимых для созревания сыра. Увеличение количества этих энзимов в сырной массе повышает скорость созревания и сокращает его продолжительность в Советском сыре на 25%.

Кроме этого, в сырах в этот период немного повышается pH, что скорее всего обусловлено утилизацией цитратов лактобациллами. Таким образом, увеличение продолжительности первого периода созревания сыра в прохладной камере должно усилить влияние повышения темпера­туры в бродильной камере на созревание сыра примерно в два раза.

В начальный период созревания в сыре недостаточно высоко со­держание свободных аминокислот и низкомолекулярных продуктов протеолиза, стимулирующих рост пропионовокислых бактерий. Швей­царскими учеными было доказано, что внесение в молоко перед сычуж­ным свертыванием микрококков оказывает сильнейшее стимулирующее действие на пропионовокислые бактерии: в опытном Эмментальском сыре в трехмесячном возрасте содержание пропионовокислых бактерий равнялось (373-679)- 10⁶/г, в контрольном, вырабатываемом без приме­нения микрококков, - (239-356)-10⁶. О более интенсивном разви­тии пропионовокислых бактерий в опытных сырах свидетельствует и тот факт, что pH этих сыров повысился до нормального уровня на две недели раньше, чем в контрольных (в крупных сырах pH во время со­зревания сыра повышается за счет сбраживания лактатов и протеолиза).

Интенсивность развития пропионовокислых бактерий зависит от сезона года, что может быть связано с кормлением коров и изменениями состава и свойств молока на протяжении лактации. Так, повышение содержания ненасыщенных кислот в молочном жире в па­стбищный период может ингибировать пропионовокислое брожение в крупных сырах.

В сыворотке, полученной при выработке сыров швейцарского типа, установлено наличие термолабильных, ингибирующих рост пропионово­кислых бактерий веществ. Ингибирующее действие сыворотки нельзя было объяснить влиянием pH. Вполне возможно, что микрофлора закваски в период активного роста образует специфические по отноше­нию к пропионовокислым бактериям антибиотические вещества, которые разрушаются в процессе дальнейшего созревания сыров. Увеличение по­севной дозы болгарской палочки при выработке Швейцарского сыра с О до 2500 мл на 9080 л молока снизило содержание пропионовокислых бактерий в сыре при выходе из бродильной камеры в 3 раза, количество пропионовой кислоты в 1,1 раза, несмотря на увеличение продолжитель­ности созревания в бродильной камере с 21 до 28 сут, однако содержание пролина увеличилось в 1,91 раза, повысилась и степень выраженности сырного вкуса. Дальнейшее увеличение посевной дозы болгар­ской палочки уменьшило концентрацию пролина и выраженность сырно­го вкуса и вызвало пороки сыра (горький и кислый вкус).

Таким образом, в сырах мог ут действовать стимулирующие и инги­бирующие рост пропионовокислых бактерий факторы, отличные от pH и концентрации соли, совокупность которых может подавить рост пропионовокислых бактерий в первый период созревания при прохладной темпе­ратуре. Однако отсутствие размножения пропионовокислых бактерий в этот период не обязательно: в опытах А. Гудкова с соавт. пропионовокислые бактерии, хотя и медленно, но размножались на первом этапе созрева­ния в сырах одной из 9 выработок. Количество пропионовокислых бактерий в блочном Эмментальском сыре во время его созревания в пер­вой прохладной камере систематически возрастало примерно на два по­рядка. Другими особенностями микробиологических и биохимиче­ских процессов в этом сыре, вырабатываемом на Пайденском молкомбинате в Эстонии, были размножение споровых аэробных палочек, интен­сивный протеолиз в течение первых 10 сут, существенное повышение pH в период после прессования до помещения сыра в бродильную камеру (с 5,2 до 5,4). Авторы исследований этого сыра считают, что энергичный протео­лиз создал благоприятные условия для размножения пропионовокислых бактерий на первом этапе созревания блочного Эмментальского сыра.

Протеолитическая активность пропионовокислых бактерий значи­тельно меньше протеолитической активности микрофлоры закваски, тем не менее они образуют пептидазы, вызывающие освобожде­ние пролина, который участвует в формировании характерного для крупных сыров сладковатого вкуса. Недостаточный протеолиз обусловливает формирование слабовыраженного сырного вкуса и из­лишне плотной консистенции, иногда - неравномерного рисунка, из­лишний протеолиз приводит к образованию перезрелого, слишком ост­рого вкуса и крошливой консистенции. При образовании в круп­ных сырах большого количества низкомолекулярных продуктов протео­лиза и слишком интенсивного развития пропионовокислых бактерий количество образуемого СО2 увеличивается за счет декарбоксилирования, что приводит к формированию излишне развитого рисунка, обра­зованию трещин и снижению стойкости в хранении сыра.

Многие авторы считают, что излишнее развитие пропионовокис­лых бактерий может вызвать пороки в крупных сырах. Так, во вспученном сыре Сбринц с крошливой консистенцией, самоколом, повышенным pH были обнаружены пропионовокислые бак­терии в количестве 10⁸— 1 С)⁹ КОЕ/г. Кроме них, в дефектных сырах было 4,6Т0⁸ КОЕ/г Е. faecalis и 9,8-10⁸ КОЕ/г L. fermentum против 7,6-10⁶ и 3-10³ КОЕ/г в сырах без пороков. Авторы работы делают вывод о том, что энтерококки стимулировали рост пропионовокислых бакте­рий, которые вместе с L. fermentum вызвали порчу сыров.

Пропионовокислые бактерии обладают более высокой липолити­ческой активностью, чем молочнокислые бактерии, применяемые в производстве крупных сыров [1030], однако среди них имеются виды и штаммы с высокой и низкой липолитической активностью (табл. 3.1).

По мнению швейцарских ученых, излишний протеолиз в сырах, в ча­стности повышенная активность лейцинаминопептидазы, интенсифицирует развитие пропионовокислых бактерий и может привести к позднему вспучиванию сыра. Вспученные сыры Грюйер отличались от доброка­чественных более интенсивным развитием пропионовокислых бактерий, более глубоким протеолизом, более высоким содержанием воды и пониженным содержанием соли. При этом остается неясным, сами ли пропионовокислые бактерии являются виновниками порчи сыра, или их излишне активное развитие коррелирует с развитием других бактерий и даже стимулирует их рост, в результате которого происходит порча сыра. Виновниками порчи могут быть, например, маслянокислые бактерии, ус­ловия для развития которых могут создавать пропионовокислые бактерии, снижая pH сыра. Маслянокислые бактерии, в отличие от пропионовокис­лых, кроме СО₂ образуют водород, который плохо растворим в сырной массе и может вызвать вспучивание сыров на фоне высокого давления С0₂ даже при небольших концентрациях. Вспучивание сыров могут также вы­звать гетероферментативные лактобациллы, цитратсбраживающие мезо- фильные лактобациллы, в частности L plantarum.

Для предотвращения этого Швейцарский исследовательский мо­лочный институт отобрал из диких штаммов пропионовокислых бакте­рий штаммы с пониженной скоростью развития в сырах. В России подбором и производством бакпрепаратов и концентратов пропионово­кислых бактерий для сыроделия занимаются лаборатория бактериаль­ных препаратов и заквасок в Барнауле и, в меньшем объеме, Угличская экспериментальная биофабрика.

Развитие пропионовокислых бактерий в сырах с низкой температу­рой II нагревания до уровня более 107г вызовет в нем появление не­свойственного вкуса, что расценивается как порок.