Для сыроделия наиболее важны бактериофаги лактококков - лак- тококкофаги (ЛФ). Всего идентифицировано 11 морфологически раз­личных типов ЛФ. По Teuber, наиболее часто встречаются четы­ре типа ЛФ:

• фаги с пролатной (вытянутой) головкой (тип Р001);
• с маленькой изометрической головкой с размером ДНК от 18 до 20 МДа (тип Р008);
• с маленькой изометрической головкой, размером ДНК 22-25 МДа (тип Р335);
• с большой изометрической головкой (тип Р026).

Менее часто встречающиеся фаги характеризуются морфологическим разнообразием, касающимся воротничка, базальной пластинки, отростка.

Во ВНИИМС создана коллекция ЛФ. Изучение морфологии 165 ЛФ показало, что все фаги имеют длинные несократи­мые хвостовые отростки, т. е. относятся к группе В по Бредли. 30 фагов имеют изометрическую головку, характерную для вида 936 подгруппы В1 по Аккерману; остальные имеют головки меньшего размера и удлиненной формы, что соответствует виду С2 подгруппы В2. Эти бактериофаги, типовыми для которых являются фаги Р008 и Р001 по Тойберу, доминируют среди фагов, циркулирующих в других странах. Два фага по морфологии близки к фагу Р087 и 5 - к виду К₁. Фаги типа Р335, широко распространенные за рубежом, среди коллекционных фагов ВНИИМС не обнаружены.

По морфологическим характеристикам группу ЛФ В1 можно раз­делить на 4 подгруппы, имеющие следующие размеры диаметра капси­да и длины хвостового отростка (нм): В1-1 - 56±5 и 136±12; В1-2 - 58+4 и 150±13; В1-3 - 65±2 и 200±15; В1-3 - 70±2 и 255±15 (Перфильев, 1998). 62,2% изученных фагов принадлежали к подгруппе В1-1; 21,6% - к В 1-2; 5,7% - к В1-3 и 10,5% - к В1-4. В России более распространены фаги В2, за рубежом - В1. Специфичность генома фагов В1-3 и В1-4 подтвер­ждена методом прямой гибридизации ДНК/ДНК.

Изученные ЛФ имели различные спектры хозяев, что, наряду с ре­зультатами рестрикционного анализа, свидетельствует об отсутствии среди них повторных изолятов. Результаты изучения спектра действия с использованием в качестве тест-культур производственных штаммов НПО «Углич» показаны в табл. 4.1. Только несколько проверен­ных фагов лизировали по одному штамму лактококков, остальные фаги оказались поливалентными.

Исследования 1979 г. показали, что 30,8% фагов из коллекции ВНИИМС лизировали все 3 подвида лактококков. Проверка ли­тического спектра коллекционных фагов в 1997 г. выявила 67,2% таких фагов; 29% фагов лизировали по два подвида и только 3,8% лизировали по одному подвиду. Это свидетельствует, с одной стороны, о пра­вильности объединения лактококков в один вид, с другой стороны, о повышении чувствительности к фагу производственных штаммов лак­тококков, использованных в качестве тест-культур для определения ли­тического спектра бактериофагов. Подвиды лактококков в составе за­квасок длительное время культивируются совместно, что не исключает возможности обмена между ними и их фагами генетическим материа­лом с возникновением фагов с новыми более широкими спектрами ли­тической активности.

Особую опасность представляют фаги, способные лизировать до 50% испытанных штаммов лактококков, несмотря на их небольшое ко­личество. Выделены они на заводах, на которых была неблагополучная фаговая ситуация и, как следствие, вырабатывались сыры низкого каче­ства. Ранее украинские ученые отмечали, что фаги, обнаруживаемые на таких заводах, обладают более широким литическим спектром и повы­шенной вирулентностью, фиксируемой по скорости лизиса клеток хо­зяина, по сравнению с фагами, обнаруживаемыми на молочных фермах и молокоприемных пунктах. Отсутствие узкой специфичности у многих фагов, разнообразие и высокая изменчивость спектров их лити­ческой активности представляют громадную угрозу сыроделию. Считает­ся, что частота мутаций фагов, вызывающих изменение спектра литиче­ского действия, равняется 10^-8— 10^-9, изменение скорости лизиса бакте­риальных хозяев - 10³. Обнаружен фаг лактококков, образую­щий мутант с расширенным спектром действия с частотой 5-10^-6.

Неодинакова чувствительность к бактериофагам и у производст­венных штаммов лактококков, о чем говорят результаты исследований, представленные в табл. 4.2. Более половины проверенных штам­мов (62,8%) лизировались 0-5% испытанных фагов, 8 штаммов лизиро­вались 16-35 фагами из 65 проверенных. Протасова спустя 19 лет прове­рила чувствительность к бактериофагам 586 производственных штаммов лактококков. В ее опытах не обладали чувствительностью ни к одному коллекционному фагу 50,6% проверенных штаммов молочного, 53,8% диацетильного и 60,7% сливочного лактококков. Это значительно больше, чем в опытах Докукина с соавт., что, по-видимому, обу­словлено включением в состав производственных штаммов фагоустой­чивых мутантов, полученных в отделе микробиологии ВНИИМС. Вто­рой особенностью ее результатов является наличие среди исследованных культур штаммов, лизируемых 50 - более 70% коллекционных фагов, ко­торые не были обнаружены в опытах Докукина с соавт. Высоко­чувствительные к бактериофагам штаммы, по результатам опытов Про­тасовой, составили 4,1% среди штаммов молочного, 4,7% диацетильного и 2,8% сливочного лактококков.

У лактококков системы устойчивости к бактериофагам кодируются плазмидной и частично хромосомной ДНК. Получен­ные данные свидетельствуют о чрезвычайно высокой генетической изменчивости как хромосомных, так и плазмидных компонентов геномов лактококков.

Ясно, что включение в закваски штаммов, чувствительных к боль­шому числу фагов, приведет к быстрому их лизису на производстве, что, учитывая способность фага к спонтанным мутациям с изменением спектра литического действия, может привести к лизису и других штаммов, входящих в закваску.

В то же время, для определения чувст­вительности штаммов лактококков к бактериофагам при их селекции в состав заквасок необходимо использовать фаги с максимально широки­ми спектрами литического действия. Из этих штаммов лактококков сле­дует также формировать набор для мониторинга фагов на сырзаводах.

Литический тип взаимодействия фагов с бактериальными клетками характеризуется скоростью адсорбции фага, продолжительностью ла­тентного периода, т. е. промежутком времени между адсорбцией и ли­зисом бактериальной клетки, и урожаем (выходом) фага.

Адсорбцию фага можно определить количественно по разности между количеством вирионов, внесенных в бактериальную культуру, и количеством в ней вирионов до момента окончания литического цикла, при этом продолжительность литического цикла можно увеличить, по­низив температуру культивирования. Количество вирионов определяют по числу негативных колоний на газоне штамма-хозяина (фаги, адсор­бированные исследуемой культурой, негативные колонии перестают образовывать). Процесс адсорбции бактериофага подчиняется уравне­нию:

Константа скорости адсорбции ЛФ варьирует в интервале от 0,51 до 32,5 -10¹⁰, продолжительность латентного периода при 30° С - от 22 до 60 мин, выход частиц фага - от 34 до 328. Скорость адсорбции снижается при внесении в молоко сычужного порошка, но не чистого химозина.

Продолжительность латентного периода увеличивается при сниже­нии температуры культивирования с 37 до 22° С, что коррелирует со снижением скорости размножения лактококков. Следовательно, скорость лизиса бактериальных клеток в системах фаг-хозяин будет далеко не оди­наковой. Некоторые штаммы лизируются фагом с такой силой, что в месте его действия на газоне остается совершенно прозрачная зона. Возможно, отдельные клетки в популяции таких штаммов оказа­лись резистентными к этому фагу, но они не успевают образовывать ви­димые колонии за время выдержки. У других штаммов при действии это­го же фага в пределах прозрачной зоны вырастают точечные колонии фагорезистентных мутантов. У некоторых штаммов в зоне лизиса сохра­няются участки сплошного роста. Скорости лизиса фагом разных штам­мов могут различаться в тысячи и десятки тысяч раз.

В состав бактериальных заквасок необходимо включать штаммы лактококков не только чувствительные к минимальному количеству фа­гов, но имеющие наименьшие скорости лизиса фагами-гомологами. Од­нако даже при небольших скоростях лизиса скорость репродукции бак­териофагов выше, чем размножения его бактериального хозяина. Пусть в системе фаг-хозяин продолжительность латентного периода равняется 30 мин, выход фага - 40 вирионам, время генерации лактококка - 30 мин. В этом случае через 1,5 ч количество клеток хозяина из одной бактериаль­ной клетки может увеличиться в 8 раз, количество вирионов из одного вириона - в 64000 раз. Если фаг, способный лизировать клетки микро­флоры одноштаммовой закваски, попадет в молоко в начале приготовле­ния производственной закваски даже в таком небольшом количестве, как один вирион/мл, то этого будет достаточно для того, чтобы закваска полностью потеряла активность к концу культивирования.

Обычно минимальные, максимальные и оптимальные температуры для репликации фагов совпадают с этими температурами для хозяев, но не всегда: некоторые фаги имеют более низкую максимальную темпера­туру, чем хозяин. Выделяют три группы ЛФ, максимальные темпе­ратуры для репликации которых равны (°С): 34—36; 36-38; 38-40.

Есть фаги, не размножающиеся при 21° С. У систем хозяин- фаг, оптимальная температура репликации фага в которых равна 38° С, снижение температуры культивирования с 38 до 31 ° С не изменило вы­ход фага, но увеличило продолжительность латентного периода с 30 до 70 мин.

Инактивация фагов при нагревании идет согласно уравнению:

К_70°С •10³ для 10 из наиболее терморезистентных фагов находится в интервале 558-665, для 7 - 176-229 мин^-1. При 70° С для снижения тит­ра наиболее терморезистентных ЛФ в гидролизованном молоке на 5 порядков нужна выдержка в течение 50-63 мин, в то же время 17 наи­более термолабильных фагов при этой температуре погибали практиче­ски мгновенно. По Цаневой, наиболее термостойкие ЛФ выдер­живают нагревание до 74° С в течение 10 мин, наименее стойкие поги­бают при 62-66° С в течение этого же времени. В молоке устой­чивость к тепловой обработке ЛФ несколько повышается. Следователь­но, при обычной пастеризации молока в сыроделии (72° С, 15-25 с) бу­дет уничтожена только часть бактериофагов лактококков (при такой обработке титр терморезистентных бактериофагов в молоке снижается на 1-2 порядка). Молоко для приготовления производственных заквасок на сыродельных заводах пастеризуют при 95° С в течение 10-30 мин или стерилизуют. При 95° С за 10 мин инактивировались все имеющие­ся в коллекции ВНИИМС бактериофаги лактококков при исходном со­держании 10⁶ мл-¹. В подсырных сливках полная инактивация ЛФ наступала при 95° С за 5 мин. Повышение концентрации ионов Са и Mg увеличивает, a Na и К - снижает термоустойчивость фагов. У фагов могут появиться мутанты, отличающиеся от родительского фа­га по термоустойчивости в 1000 раз.

При изучении чувствительности ЛФ к УФ их суспензию в фосфатном буфере с начальным содержанием (1-4) -10⁶ частиц/мл облучали БУФ 30 (длина волны 2357 А), расположенной на расстоянии 40 см. Инактивация фагов в этом опыте шла по уравнению 4.2, где: Р и Р₀- титры фага после и до облучения в течение t,c,K- константа скорости инактивации.

К·10³ для изученных фагов в этом опыте изменялась от 10,8 до 55,52 с-¹, т. е. в несколько более узких пределах, чем константа термоак­тивации.

Фаги обладают достаточно высокой чувствительностью к УФ облучению: содержание даже наиболее устойчивого к УФ фага за 60 с снижалось более чем на два порядка. В промышленных условиях невоз­можно расположить источники УФ на расстоянии не более 40 см от обра­батываемых объектов, однако увеличение расстояния может компенсиро­ваться увеличением продолжительности облучения. Для проверки этого был поставлен второй опыт, в качестве источника УФ в котором была взята БУФ 60, расстояние до облучаемого объекта увеличено до 2 м, про­должительность облучения - до 60 мин. Результаты этого опыта пред­ставлены на рис 4.4. В воздушной среде инактивация фагов шла намного быстрее: они погибают в результате 25-минутного облучения при длине волны 2357 А. Однако, в опытах Протасовой бактериофа­ги не были полностью уничтожены даже после 48 ч УФ облучения.

Santer считает, что источник УФ лучей можно помещать не в заквасочной, а в камере, через которую циркулирует воздух из заквасочной, или вмонтировать в вентиляционную систему.

Перекисно-каталазная обработка оказала незначительное действие на бактериофаги: за 4 ч в бульоне с 0,3% перекиси водорода содержание бактериофагов снизилось только в 1,5-2,0 раза.

Мощным инактивирующим действием на бактериофаги обладает хлорная известь (рис. 4.5). В 1 %-ном растворе хлорной извести титр бактериофага через час уменьшается в десятки тысяч раз, через сутки - в сотни тысяч раз; в 10 %-ном ее растворе уже через 5 мин фаги нельзя обнаружить даже качественно.

Этиловый спирт начинает действовать на бактериофаги при кон­центрациях выше 50%.

Для дезактивации ЛФ рекомендуются синтетические моющие средства Вимол и Триас в концентрации 0,5-1,0% с двухминутной про­должительностью контакта их растворов с обрабатываемыми поверхно­стями при 60-70° С и десятиминутной при 40-50° С.

Шесть фагов лактококков были инактивированы за 10 мин при 20° С в водных растворах 0,6% формальдегида, 0,5% гипохлорита на­трия, 0,2% хлорамина, 3% фенола, 1% дихлорфенола и 0,5% средства на основе перуксусной кислоты. Хлорамин и гипохлорит натрия в этих концентрациях через 10 мин снижал содержание фагов на 7-8 по­рядков. 6% Н₂0₂, щелочная среда (pH 11,0), кислая среда (pH 2,0) за 1-2 ч экспозиции снижали содержание фагов только на 1-2 порядка. В присутствии молока или сыворотки скорость инактивации снижалась. 45-4500 мг/кг активного хлора не могли дезактивировать фаг в молоч­ном сгустке при 20° С за 30 мин. Эти фаги были защищены коагулиро­ванным казеином. В хлорсодержащих растворах без органических ве­ществ 300-500 мг/л активного хлора полностью уничтожали бактерио­фаги лактококков за 1-5 мин.

Противоречивы данные о влиянии цитратов на бактериофаги лак­тококков. В опытах Докукина цитраты в концентрации до 3% снизили титр фагов примерно на порядок, причем увеличение продолжительно­сти экспозиции с 5 мин до суток почти не повлияло на степень инакти­вации фагов. По данным Мытник, 0,5 и 1,0% цитратов снизили титр фагов соответственно на 1 и 3 порядка.