Можно выделить два направления в профилактике лизиса микро­флоры заквасок бактериофагом:

• максимально возможное снижение вероятности контакта микро­флоры с фагами;
• повышение устойчивости микрофлоры заквасок к действию бакте­риофагов во время контактов с ними.

Полностью исключить контакты микрофлоры закваски с фагами на производстве невозможно, так как сыры вырабатывают из нестерильно­го сырья в контакте с нестерильной внешней средой. Однако эти кон­такты можно исключить вплоть до начала выработки сыра в сырной ванне, а потерю активности качественной до внесения в смесь закваски во время выработки сыра из-за бактериофага можно рассматривать как чрезвычайное событие, небольшие же масштабы лизиса микрофлоры закваски во время выработки сыра большого вреда не приносят. Ком­плекс мер по предотвращению контактов микрофлоры заквасок с бакте­риофагами включает следующее.

Закваски не должны содержать лизогенных культур, которые сами несут в себе фаги. Имеются методы освобождения («излечивания») ли­зогенной культуры от содержащихся в ней профагов, при этом часть «вылеченных» культур остается нечувствительной к бывшему в ней фагу. Вероятно, эти методы могут быть использованы для получе­ния пригодных для сыроделия штаммов.

С точки зрения загрязнения производства фагами со стороны за­кваски предпочтительнее использовать моновидовые одноштаммовые закваски, нечувствительные к собственным профагам. Однако при их применении нужны специальные меры защиты от загрязнения фагами из внешней среды, так как попадание в одноштаммовую закваску даже одного фага может вывести ее из строя. В течение многих лет безуко­ризненно действует система защиты закваски от заражения фагами и посторонней микрофлорой, разработанная Льюисом. В соответ­ствии с этой системой закваски готовят в герметичных сосудах, погру­женных в воду, введение посевного материала проводят через специаль­ные клапаны с дезинфицирующим раствором стерильными шприцами, что предотвращает загрязнение закваски фагами во время ее внесения в заквасочник. С помощью этой системы один и тот же штамм лактокок­ков можно использовать в качестве закваски годами. Применение гер­метичных заквасочников и асептическое внесение инокулята предлагает­ся и другими учеными в качестве главного условия защиты заквасок от бактериофага.

В многоштаммовых заквасках особенно опасны мультилизогенные штаммы, выделяющие во внешнюю среду несколько типов фагов. Фаги, высвобождаемые лизогенными культурами, это внутренние враги мик­рофлоры заквасок. Их нелегко выявить, поэтому при подборе микро­флоры закваски, нужно проверять штаммы на лизогенность, используя в качестве индикаторных другие штаммы, которые используют в закваске вместе с исследуемым штаммом. При выявлении лизогенной культуры ее исключают из состава закваски. Если же лизогенность культуры не будет выявлена, то выделяемые ею профаги не будут лизировать другие штаммы, включаемые в закваску. Limsowtin et al. сообщают о непре­рывном использовании в течение 2-8 месяцев (в зависимости от завода) многоштаммовой закваски лактококков в производстве сыра Чеддер [648]. Скорее всего, она была составлена из лизогенных штаммов, не­чувствительных к умеренным фагам, выделяемым друг другом. В дру­гой работе сообщается, что одну многоштаммовую закваску использо­вали в промышленности в течение 10 лет без каких-либо помех по от­ношению к скорости кислотообразования, составлена она была из лизо­генных штаммов. Teuber & Lembke считают, что возможно, лизо­гения и система рестрикции-модификации - это два фактора, которые обусловливают способность лактококков выполнять свои функции в условиях сыроделия. Наиболее вирулентные фаги никогда не выступают в роли профага, что вызывает сомнения в важности лизоген­ных культур как источников обсеменения фагами сыродельных пред­приятий. Таким образом, мнения о возможности использования лизо­генных культур в сыроделии противоречивы.

Для предупреждения загрязнения закваски фагами из внешней сре­ды особое внимание должно быть обращено на помещения для приго­товления заквасок. Инфекция закваски фагами наиболее опасна именно на этом этапе, поскольку приготовление закваски в зависимости от спо­соба и исходного инокулята может продолжаться от 5 до 18 ч. Все воз­можные пути проникновения бактериофагов в заквасочную должны быть перекрыты: окна, двери в заквасочную должны плотно закрывать­ся, при открытии дверей в помещение заквасочной воздух должен не входить, а выходить из него, что обеспечивается подачей в заквасочную по автономной системе вентиляции стерильного воздуха.

Доступ в заквасочную должен разрешаться только оператору и че­рез тамбур, в котором хранится спецодежда, включая обувь, предназна­ченные для работы только в заквасочной. Оператору заквасочной нельзя посещать помещения, в которых вырабатывается сыр и перерабатывает­ся сыворотка. Необходимо дистанционное управление подачей закваски в сыродельный цех и заполнения заквасочников молоком.

Направления воздушных потоков на предприятиях должны преду­предить заражение бактериофагами заквасок и молока после пастериза­ции. Через заквасочную не должны проходить сквозные молоко- проводы, воздухопроводы, канализация, особенно из помещений, в ко­торых вырабатывают сыр, перерабатывают сыворотку или обрабатывают сырое молоко.

Заквасочная, включая тамбур, должна быть оснащена бактерицид­ными лампами, расположенными так, чтобы оставалось минимальное количество затененных мест. Облучение УФ заквасочных обязательно перед пастеризацией и охлаждением молока для приготовления произ­водственной закваски. Затененные места после УФ облучения должны хлорироваться. Целесообразно применять для приготовления производ­ственных заквасок герметичные заквасочники с поддержанием неболь­шого избыточного давления внутри него путем непрерывной подачи стерильного воздуха или азота и устройствами для асептического вне­сения посевного материала. Существуют специальные фильтры типа «Ultrapolymembrane РР-РР 30/3» для воздуха, подаваемого в заквасоч- ник, которые пропускают не более одного вириона из 10⁸, и другие фильтры. Немецкая фирма Wolbern разработала обо­рудование для приготовления и распределения производственных за­квасок в асептических условиях.

Необходимо использовать автономные системы для мойки и де­зинфекции оборудования заквасочных помещений; пол заквасочных должен быть сухим, без трещин и выбоин.

Активизацию бактериальных концентратов, приготовление переса­дочных заквасок следует проводить в специальном боксе, лучше в сте­рильном молоке и герметичных емкостях. Свести возможные контакты микрофлоры закваски с фагами можно до минимума при внесении бак­териальных концентратов в смесь для выработки сыра непосредственно или после кратковременной активизации в небольших объемах стериль­ного молока или специальных сред, т. е. без размножения микрофлоры сухих заквасок на заводе до внесения их в сыродельную ванну (гл. 5). Бактериальные концентраты, вырабатываемые Угличской биофабрикой, пригодны для непосредственного внесения в сырную ванну, но, к сожа­лению, они пока стоят слишком дорого, а дозы их внесения непосредст­венно в смесь для выработки сыра резко возрастают по сравнению с до­зами, необходимыми для приготовления производственной закваски. Метод непосредственного внесения в смесь можно использовать в экс­тренных случаях при потере активности основной закваски, в нормаль­ных условиях следует готовить производственные закваски беспереса­дочным способом с предварительной активизацией бакконцентратов.

Для снижения загрязнения завода бактериофагами помещения, в которых хранится и обрабатывается сырое молоко, перерабатывается сыворотка, должны быть изолированы от помещений, в которых выра­батывают сыр. Желательно, чтобы цвет спецодежды у работников сырье­вой и сыродельных зон был различен, перемещение работников из зоны в зону должно быть запрещено или максимально ограничено. Сепари­рование сыворотки следует проводить в герметичных сепараторах. Все сливы должны поступать в канализацию по закрытым системам.

Размножающиеся во время выработки сыров бактериофаги не должны заражать последующие выработки, поэтому оборудование и инвентарь после каждой выработки должны быть продезинфицированы, в частности, сыродельные ванны пропарены в течение 5 мин. В против­ном случае бактериофаги от предыдущей выработки, оставшиеся на поверхности оборудования и инвентаря, попадут в смесь для следую­щей выработки, и опасность снижения активности микрофлоры заква­ски в последующих выработках резко возрастает. Так, в сырах второй выработки, выработанных без санитарной обработки ванны после пер­вой, количество бактериофагов возросло в 371 раз, а стафилококков - на порядок по сравнению с их содержанием в сырах первой выработки. На поверхности сырных ванн, не продезинфицированных сразу после выработки, ЛФ обнаруживали в 100% случаев, на поверхностях, пропаренных сразу после выработки ванн - в 20% случаев. За­грязнение дезинфицирующих средств белками резко снижает эффек­тивность их действия на бактериофаги.

Периодически следует дезинфицировать воздух, так как фаг с ка­пельками сыворотки распространяется по воздуху [1269]. В воздухе в зоне приготовления закваски обнаружено 10² м~³, рядом с сепаратором для обработки сыворотки - 10⁸ м~³ фагов. Для уничтожения фагов в воздухе используют 1% раствор хлорной извести (17 мг активного хло­ра на м³) или 0,05% раствор хлорамина (7,5 мг/м³ активного хлора).

Для уничтожения фагов при обработке оборудования и молокопроводов содержание активного хлора в дезинфицирующем растворе должно быть не ниже 100 мг/кг, для обработки деревянных поверхностей - не ме­нее 450 мг/кг; температура растворов - не ниже 60° С.

Наиболее часто снижение активности заквасок наблюдается в кон­це смены во время последних выработок сыра. Правда, по­вышенное содержание фагов нередко наблюдается в сырах первой вы­работки, что обусловлено репликацией фагов ночью на поверхностях молокопроводов и оборудования и смыванием их первыми порциями молока. Дезинфекцию следует проводить не только после, но и до рабо­ты. Важно держать в исправном и сухом состоянии полы, стены, памя­туя о том, что репродукция бактериофагов происходит в размножаю­щихся бактериальных клетках, а размножение лактобактерий происхо­дит только во влажных условиях, в местах, где скапливаются остатки молока и других молочных продуктов.

Высокий уровень гигиены - необходимое, но недостаточное усло­вие в профилактике снижения активности заквасок из-за действия фага, что обусловлено возможностью попадания на завод терморезистентных фагов с сырым молоком и лизогенными культурами. Поэтому парад- дельно с мероприятиями по повышению гигиены должны осуществ­ляться и мероприятия по второму направлению - обеспечению нор­мальной работы закваски в присутствии бактериофагов.

Определенный эффект дает использование в составе заквасок не­скольких видов бактерий, в частности, в качестве газообразующей микро­флоры - диацетильного стрептококка и лейконостоков, или в качестве кислотообразователей - лактококков и термофильного стрептококка.

Вероятно, нечувствительных к бактериофагам штаммов лактокок­ков в природе нет. Однако при проверке чувствительности к фагам штаммов лактококков значительное количество их не лизировалось ни одним коллекционным фагом. У Henning et al. 31 из 100 штаммов были нечувствительны ни к одному из 60 фагов, у Chopin et al. 83 из 291 штамма - к 132 фагам, у Erickson 32 из 74 - к 25 фагам, у До­кукина около 77% штаммов - к 88 фагам. Скорее всего, это след­ствие неполноты использованных коллекций бактериофагов, но в лю­бом случае можно утверждать, что фаги, способные лизировать эти штаммы, встречаются редко.

Штаммы, для которых в коллекциях есть фаги, способные их лизи­ровать, различались по фаготипу (типу и количеству способных их ли­зировать фагов) (табл. 4.2). Для проверки влияния фаготипа на качество сыра Докукиным были составлены три закваски, в каждую из них вклю­чили 3-4 штамма молочного, 2-3 штамма диацетильного и 1-2 штамма сливочного лактококков. В закваску А включили только штаммы, для которых в коллекции не было вирулентных фагов, в закваску Б включены штаммы, лизируемые не более чем 5% коллекционных фагов (все штаммы имели разные фаготипы), и в закваску В - штаммы, кото­рые лизировались более чем 25% фагов. С опытными заквасками вырабатывали Костромской сыр в экспериментальных и заводских ус­ловиях. В экспериментальных условиях с благополучной фаговой си­туацией различий в микробиологических и технологических процессах, качестве сыров, выработанных с заквасками А, Б и В, не было, что сви­детельствует о правильности подбора микрофлоры опытных заквасок по другим, чем отношение к фагу, критериям. Испытание же заквасок в заводских условиях с неблагополучной фаговой ситуацией выявило яв­ные преимущества заквасок А и Б: качество сыров вариантов А и Б бы­ло выше, чем качество сыров варианта В, на 7,3 и 9,8 балла.

Обычно штаммы лактококков с высокой скоростью кислотообразования более чувствительны к бактериофагам, чем штаммы с низкой ки­слотообразующей активностью. Сочетание в закваске обоих типов штам­мов, с одной стороны, понижает ее чувствительность к бактериофагам, с другой, обеспечивает общую нормальную активность, так как энергичные кислотообразователи стимулируют рост «слабых» штаммов.

Установлено, что штаммы лакто кокков, имеющие клетки с более толстыми клеточными стенками (40-65 нм), менее чувствительны к дей­ствию бактериофагов. В клеточной стенке фагоустойчивых штам­мов лактококков выше содержание соединений, в состав которых вхо­дят белок и гексозы.

В лизатах чувствительных к фагу штаммов лактококков могут быть специфические лизины (энзимы типа лизоцима), которые растворяют другие, нечувствительные к данному фагу штаммы лактококков. Лизины, как и вирулентные фаги, лизируют бактериальные клетки, но, в отличие от фагов, их репликации в клетках не происходит. Фаговые лизины не обладают специфичностью, какая присуща фагам, под действием которых они образованы. Так, лизины, образуемые в клетках лактококков, могут атаковать не только лактококки, но и стреп­тококки группы D. Оптимальная температура для действия лизинов 37° С, оптимальный pH 6,5-6,9. Все фаги, образующие лизины, имеют ожере­лье вокруг негативных колоний и пролатные (вытянутые) головки. Об­разующие лизины фаги особенно опасны для производства, поэтому поставщики сухих заквасок и концентратов должны не включать в их состав штаммы-хозяева таких фагов. Кроме этого, даже небольшое ко­личество пенициллина в молоке повышает чувствительность лактобак­терий к фаговым лизинам, поэтому такое молоко нельзя использовать в производстве ферментированных молочных продуктов.

Все, что сказано выше, указывает на необходимость учета природ­ной резистентности штаммов лактококков к бактериофагу при подборе их штаммового состава в состав заквасок.

На заводе, вырабатывающем 10 т сыра в сутки, ежедневно «рабо­тает» огромное количество клеток лактококков (не менее 10¹⁶), каждый день на нем может появиться - 5-10⁷ спонтанных мутантов с изменен­ной чувствительностью к фагу. На заводах с большим количест­вом дефектных сыров циркулируют фаги с широким спектром литиче­ского действия и высокой вирулентностью. Ясно, что при высокой сте­пени инфицирования производства фагами всегда могут появиться му­танты, способные быстро лизировать штаммы закваски, и закваска рано или поздно потеряет активность. Чтобы этого не произошло, проводят ротацию штаммов, заключающуюся в их смене каждые 4-7 дней. Каждая закваска, приходящая на смену, должна включать штам­мы с другими фаготипами, чем предшествующая. Важно, чтобы скоро­сти размножения во время выработки сыра штаммов, включенных в состав многоштаммовой закваски, были близкими, иначе более актив­ные (доминантные) штаммы вытеснят при пересадках менее активные и фагорезистентность закваски понизится. Многоштаммовость и ротация заквасок - основные принципы действующей в России системы защиты заквасок от бактериофага. Правда, нет полной ясности о коли­честве штаммов каждого вида, которое нужно вносить в закваску. Гибшман и Белоусова считают, что нужно вносить до 10 штаммов в состав закваски. По-видимому, это число для каждого подвида лактококков нужно сократить, так как количество штаммов с достаточ­но высокой природной устойчивостью к фагу невелико, и чем чаще их используют, тем больше вероятность появления на заводах фагов, спо­собных быстро их лизировать. Лизис фагами хотя бы одного из штам­мов, входящих в закваску, увеличивает опасность появления мутантов фага, способных лизировать другие штаммы. Для производства Чеддера в закваски, составленные из известных штаммов, обычно включают два штамма с ротацией через 4-5 суток, в закваски из неизученных штам­мов раньше включали до 6 штаммов, теперь - также два штамма. Чем реже проводится ротация штаммов при условии сохранения ими активности, тем стабильнее качество сыра.

При недостаточно высоком уровне гигиены производства много­летнее использование одного и того же набора производственных штаммов приводит к появлению на заводах фагов, способных лизиро­вать все эти штаммы. Численность каждого фага будет колебаться в зависимости от того, входит ли его хозяин (хозяева) в состав закваски, используемой в данный момент, но в небольших количествах они могут постоянно присутствовать на предприятии. В этом случае продолжи­тельность использования закваски на заводе будет определяться време­нем, необходимым для размножения до опасных количеств фагов, спо­собных лизировать входящие в ее состав штаммы. Зачастую закваски начинают терять свою активность после 1-2 дней использования.

На предприятиях с высоким уровнем гигиены производства заква­ска может работать без потери активности длительное время, если она составлена из фагоустойчивых мутантов, в результате чего можно ис­ключить ротацию штаммов или заквасок или снизить ее частоту. Фагоустойчивые мутанты бывают спонтанные и индуцированные. Спон­танное появление фагорезистентных мутантов - очень важное свойство культур, обеспечивающее возможность их существования в природе при постоянном контакте с фагами. Они появляются в культуре с часто­той от 10~⁷ до 10^-10 . То же можно сказать и о мутациях фа­гов, изменяющих спектр их литического действия, что помогает фагу выжить при изменении бактериального окружения. Это свойство бакте­рий и фагов обеспечивает динамическое равновесие бактерий и их фа­гов в природе, поэтому проблемы бактериофагии при выработке сыров из сырого молока не было. Отсюда следует, что к спонтанным фаго­устойчивым мутантам лактококков рано или поздно появятся способ­ные их лизировать бактериофаги. Время, необходимое для их появле­ния, зависит от количества бактериофагов, циркулирующих на заводе: чем их больше, тем быстрее появятся мутанты фагов, способные лизи­ровать фагоустойчивые культуры. Эффективность и возможная про­должительность применения фагоустойчивых мутантов, таким образом, в огромной степени зависит от уровня гигиены производства сыра.

Спонтанные мутанты отбирают двумя способами. Первый способ заключается в выращивании «родительского» штамма в среде со смесью коллекционных фагов, выделении из культур «вторичного» роста мутан­тов, размножение которых свидетельствует об их резистентности к нахо­дящимся в среде фагам, очистке их серией перевивок в жидкой среде с посевами на твердые среды и выделении изолированных колоний, про­верке по технологическим критериям, прежде всего по скорости кислото- образования. Пригодные по технологиче­ским показателям фагоустойчивые мутанты родительского штамма лак­тококка используют в составе заквасок. Их можно поддерживать на заво­де в чистой культуре или в виде смеси штаммов, добавляя при пересевах в молоко каждый раз фильтраты сыворотки, получаемой на заводах, где они применяются, осуществляя таким образом непрерывный отбор фагоустойчивых мутантов. Пересевы фагоустойчивых мутантов или за­квасок проводят в молоке с фильтратом сыворотки и в качестве контроля - в молоке. Если кислотность в опыте при пересеве стала несколько ниже, чем в контроле, но при последующем пересеве различия в нарастании кислотности в опыте и контроле исчезли, то такой штамм (или закваска) может использоваться в производстве; если различия велики и не исчеза­ют при новых пересевах, то штамм или закваску выбраковывают.

При подборе многоштаммовых заквасок нужно проверять взаимо­отношения между штаммами, так как если устойчивость к фагам у му­тантов появилась в результате их перехода в лизогенное состояние, то умеренные фаги, которые всегда есть в лизогенных культурах, могут лизировать другие штаммы, включаемые в закваски.

Из 21 родительского штамма лакто кокков этим методом было ото­брано 211 фагоустойчивых вариантов, из которых 28 были забракованы за низкую кислотообразующую активность, 53 - за нетипичную морфо­логию, 99 - за органолептические показатели свернутого ими молока (чаще всего из-за горького или нечистого вкуса). Отобранные мутанты с целью проверки стабильности приобретенной устойчивости к фагу хра­нили в обезжиренном молоке с перевивками через каждые 15 дней. Изменение устойчивости фагорезистентных вариантов, получен­ных из штаммов молочного и диацетильного (с высокой энергией кисло- тообразования) лакто кокков, показано на рис. 4.6. Все варианты диацетильного лактококка с низкой скоростью кислотообразования по­теряли устойчивость к фагам через 7 месяцев хранения. Скорее всего, они были недостаточно хорошо очищены от клеток родительских штам­мов, обладающих высокой скоростью кислотообразования в молоке, ко­торые и вытеснили фагоустойчивые дочерние клетки с низкой скоростью кислотообразования. Для предотвращения этого следует провести куль­тивирование родительских штаммов в присутствии смеси фагов не один раз, как было сделано в работе, а повторить его несколько раз (ирланд­ские ученые применили 7-кратное культивирование штаммов в присут­ствии фагов при получении фагоустойчивых мутантов).

Все культуры молочного и половина культур диацетильного лакто­кокка с высокими скоростями кислотообразования сохранили приобре­тенную устойчивость к бактериофагу в течение 7 месяцев хранения, а по две культуры этих подвидов сохранили ее в течение 17 месяцев хранения.

В зарубежных работах при отборе фагорезистентных мутантов проверяют их протеолитическую активность, поскольку потеря способ­ности адсорбировать фаг часто сопровождается потерей казеинолитиче­ской активности. Однако протеиназонегативные мутанты обладают и низкой кислотообразующей активностью, поэтому достаточно провести пробу только на кислотообразующую активность.

Вторым методом отбора спонтанных фагорезистентых мутантов является их выделение из подсырной сыворотки после инкубации ее в течение определенного времени при оптимальной для размножения лактококков температуре  или воздействие на родительские штам­мы смесью коллекционных фагов и сыворотки, освобожденной от микробных клеток с помощью мембранных фильтров. В этом ме­тоде в качестве селекционного фактора используются коллекционные фаги и фаги, циркулирующие на сыродельных заводах, на которых от­бирается сыворотка. Именно эту идею используют, применяя сыворотку из предыдущих выработок как закваску для последующих выработок. Из 24 образцов подсырной сыворотки, отобранной на шести сыродельных заводах России, было получено 206 фагоустойчивых культур лактокок­ков, 22% которых сохранили устойчивость к фагу в течение 9-10 месяцев хранения. Полученные фагоустойчивые мутанты используются в производстве угличских заквасок.

Оба метода можно объединить, выращивая в фильтратах сыворот­ки с добавлением коллекционных бактериофагов хорошо изученные, ценные для производства штаммы лактококков.

Ирландские ученые 7-кратной обработкой родительских штаммов коллекционными фагами и сывороткой получили 35 фагорезистентных мутантов; по-видимому, все они были лизогенными, но ни один из них не был индикаторным штаммом для других. Полученные фагоустойчи­вые культуры использовали без ротации в производстве Чеддера (по 2-4 культуры) до тех пор, пока на заводе в сыворотке не появлялись фаги, способные их лизировать с достаточно высокой скоростью. «Про­винившуюся» фагоустойчивую культуру заменяли другой, предвари­тельно проверенной в пилотной установке, или из нее снова получали фа­гоустойчивые мутанты. Набор фагоустойчивых культур сохранял ак­тивность в течение сезона.

Есть рекомендации по приготовлению закваски, резистентной к циркулирующим на заводе фагам, путем ежедневного культивирования в течение 15-18 ч при 30° С нескольких штаммов лактококков в пермеа- те сыворотки, отобранной на этом же заводе, с последующей пересад­кой в обезжиренное молоко для проверки кислотообразующей активно­сти. Схема получения и использования спонтанных сыворо­точных фагорезистентных мутантов, разработанная американскими учеными, показана в табл. 4.4.

Согласно их схеме отбираются штаммы лактококков с высокой ско­ростью кислотообразования, к которым не обнаружено гомологичных фа­гов в сыворотке на том предприятии, на котором эти штаммы намечено использовать. Образцы этих штаммов хранят в лаборатории в заморожен­ном виде, перед приготовлением производственной закваски намеченные штаммы размножаются до нужных количеств и направляются в производ­ство. Каждый штамм ежедневно проверяют на отсутствие в сыворотке фагов, способных его лизировать. Процедура проверки состоит в следую­щем. Отбираются образцы сыворотки из различных ванн, смешиваются, и с помощью мембранных фильтров готовится фильтрат сборной пробы сыворотки, свободный от бактерий. Из полученного фильтрата в асептиче­ских условиях готовят 0, 1 и 2 разведения в стерильном обезжиренном молоке с индикатором бромкрезолпурпур (БКП), разлитым в пробирки по 10 мл.

После этого подготовленное молоко и молоко без добавления сыво­роточного фильтрата (контроль) инокулируют 1% проверяемого штамма и посевы выдерживают 1 ч при 37° С и 5 ч при 30° С, затем сравнивают ок­раску индикатора в пробирках с фильтратом сыворотки и контролем. Не­обходимы две температуры инкубации, так как есть фаги, репликация ко­торых не происходит при температуре ниже 37° С, у других она происхо­дит при 25-30° С. После инкубации в контроле цвет индикатора становит­ся желтым. Если в опытных пробирках цвет будет таким, как в контроле, то фагов к проверяемому штамму на заводе нет; если цвет индикатора в опытных пробирках более темный, то это означает наличие фагов к прове­ряемому штамму в фильтрате сыворотки. Скорость свертывания молока в расчет не принимается, так как в сыворотке остается достаточно высокое количество молокосвертывающих энзимов.

По наблюдениям Sandine, нет необходимости выбраковывать штамм, если отличия в окраске отмечаются только в пробирках, в кото­рые внесен неразбавленный фильтрат или его первое разведение. Если окраска индикатора в пробирке с добавлением меньших количеств фильтрата отличается от контроля, то штамм изымают из закваски. В лаборатории повторяют процедуру получения из него мутанта, устой­чивого к циркулирующим на производстве фагам.

Для получения фагоустойчивого мутанта используют 1-2 л куль­туры родительского штамма и добавляют к ней 5-10 мл фагового лиза­та, после этого культуру выдерживают до свертывания молока, на что иногда требуется несколько суток. Для отбора мутантов, обладающих достаточно высокой скоростью кислотообразования, американские уче­ные используют специальную среду - агар для дифференциации штам­мов с высокой и низкой кислотообразующей способностью (FSDA), состав которой приведен в табл. 4.5. На этой среде активные ки- слотообразователи образуют колонии 2-3 мм в диаметре, слабые кисло- тообразователи - 0,5-1,0 мм в диаметре.

Для использования в закваске пригодны штаммы, которые приоб­рели устойчивость к фагам в результате потери способности их адсор­бировать, поэтому необходимо поставить пробу на адсорбцию, а также на отсутствие посторонних привкусов в свернутом ими молоке. Лизо­генные культуры отбраковываются.

В США считают, что для включения в закваски для сыра Чеддер пригодны штаммы, способные свернуть обезжиренное молоко при 22° С и 1% инокулята не позднее чем за 16 ч [928]. Для приготовления производственной закваски они рекомендуют антифаговые среды с внутренним контролем pH.

Индуцированные фагоустойчивые мутанты получают путем обра­ботки фагочувствительной культуры мутагенными факторами (УФ, гамма- и рентгеновские лучи, нитрозометилмочевина, формальдегид и др.). Так, например, у-излучение (поглощенные дозы 350-800 Гр) инду­цировало появление фагоустойчивых мутантов, выход которых в 10—10⁵ раз превышал уровень фона спонтанных мутаций. Часть мутан­тов, полученных в результате воздействия на родительскую культуру у-лучей, была резистентна ко всем 52 фагам, использованным для отбора фагоустойчивых мутантов. Большинство мутантов сохранило устойчи­вость к фагам при ежемесячных пассажах в стерильное обезжиренное молоко и при хранении в лиофилизированном состоянии. Более 60% мутантов сохранили на уровне родительских штаммов основные техно­логические свойства: кислото-, газо- и ароматообразование, термо-, со­ле-, щелочеустойчивость, спектр ферментируемых углеводов и др. Раз­работаны методики получения фагоустойчивых мутантов с помощью УФ-облучения, нитрозометилмочевины.

Существует корреляция между плазмидными профилями и устой­чивостью к бактериофагам. Одна из многоштаммовых заквасок, в соста­ве которой были штаммы с определенными плазмидными профилями, использовалась для производства Чеддера в течение пяти лет без рота­ции. Разработана методика получения фагоустойчивых мутантов лактококков путем конъюгативного переноса ДНК; этим методом полу­чены и широко используются в промышленности фагоустойчивые вари­анты лактококков.

Из хромосомы Lc. lactis выделен и идентифицирован элемент, ста­билизирующий плазмидные гены, в том числе ответственные за фаго- устойчивость.

Для проникновения генома фага в клетки хозяина нужны ионы Са²⁺, однако это справедливо не для всех штаммов. Потребность ЛФ в Са²⁺ использована при разработке антифаговых сред для приготовления производственных заквасок, из которых ионы Са²⁺ удалены оксалатом ам­мония, 2% смеси NaH₂P0₄H₂0 : Na₂HP0₄ в отношении 3 : 2 (pH 6,5) или цитратом натрия. Основой этих сред является обезжиренное молоко или сыворотка. Антифаговые среды или ан­тифаговые добавки в молоко для приготовления заквасок вырабатывают несколько фирм, в т. ч. Miles, Dairyland Lab. и Galloway-West Со. (США), Wiesby (Германия). Несмотря на то что в этих средах ингибируется репродукция не всех ЛФ и не все лактококки хорошо рас­тут, опасность потери активности закваски при при­готовлении на антифаговых средах резко сокращается. Так, в среде, со­держащей 10% сухого обезжиренного молока, 2% фосфатного буфера, 1%  дрожжевого экстракта активность лактококков закваски была значи­тельно выше, чем в обезжиренном молоке, титр инокулированных фа- гов-гомологов микрофлоры закваски снижался с 10⁷ мл”¹ до 1 мл”¹ после трех пересадок, в то время как в обезжиренном молоке он повысился до 10⁸ мл, расход закваски снизился на 30-40%. Кроме этого, приме­нение сухих антифаговых сред, вырабатываемых централизованно при строгом микробиологическом контроле, исключает такой фактор, влияю­щий на закваску, как низкое качество молока.

В Польше получали антифаговую сыворотку путем внутримышеч­ной инъекции суспензии фагов коровам за несколько дней до и после оте­ла. Полученную сыворотку вносили в молоко для выработки сыра, что обеспечивало нормальную скорость кислотообразования в присутствии соответствующих фагов гомологичными штаммами лактококков [1047].

Некоторые технологические факторы могут влиять на размноже­ние ЛФ на сыродельных заводах. При недостаточно высокой кислото­образующей активности заквасок иногда применяют их активизацию, заключающуюся во внесении закваски в молоко, приготовленное для выработки сыра, за 1-2 ч до внесения молокосвертывающих энзимов. Увеличение пребывания закваски в молоке до свертывания повышает ее активность во время выработки, но также резко повышает опасность бактериофага. При низкой активности закваски в качестве оперативной меры можно увеличить ее дозу, а далее нужно выявить и устранить причины ее низкой активности.

Во время приготовления производственных заквасок и выработки мелких сычужных сыров лактококки подвергаются действию различных температур. Установлено, что повышение температуры с 31 до 38° С почти вдвое снижает продолжительность латентного периода при малом изменении выхода фага. В России температуру II нагревания в производстве сыров этого класса часто повышают до 41^42° С, но, к сожалению, неизвестно, как эта температура влияет на репликацию фа­гов. Однако есть исследования, показывающие, что выдержка штаммов лактококков, обладающих системой рестрикции и модификации, при температурах 40-50° С снижает рестрикцию фагов и приводит к появ­лению модифицированных фагов с высокой эффективностью реплика­ции на новых хозяевах. Это может значительно снизить эффек­тивность ротации штаммов и многоштаммовости заквасок.

Для приготовления производственной закваски молоко пастеризуют при 90-95° С с выдержкой 10-20 мин. Жесткая тепловая обработка сни­жает содержание в молоке ионов Mg²⁺, которые необходимы, как и ионы Са²⁺, для адсорбции фага. Производственную закваску на заводах гото­вят при температурах от 23 до 31° С. Чем выше температура приготов­ления закваски, тем быстрее адсорбируется фаг на клетки лакгококков.

Постоянное наблюдение за фаговой ситуацией (фаговый монито­ринг) на каждом предприятии и в целом в промышленности - необхо­димый элемент управления качеством ферментированных молочных продуктов, в т. ч. сыров. Он осуществляется на нескольких уровнях:

• ежедневный контроль активности производственной закваски (ки­слотность закваски после ее культивирования в течение определен­ного времени и при определенной температуре, установленных на за­воде; проба на активность по приросту кислотности молока с моло­косвертывающим энзимом при оптимальной для закваски температу­ре, однопроцентной посевной дозе за 3 ч; нарастание кислотности сыворотки во время выработки сыра и pH сыров после прессования);
• периодическое определение титра и спектра литической активно­сти бактериофагов в различных объектах, и прежде всего в произ­водственных заквасках и сыворотке, а также в воздухе помещений, в которых вырабатывают сыр и готовят закваску, по количеству негативных колоний на газонах индикаторных штаммов или штам­мов, входящих в ее состав закваски;
• выявление причин, вызывающих отклонения фаговой ситуации от нормы, разработка мер по их устранению с особым вниманием к мойке и дезинфекции оборудования, молокопроводов, инвентаря, соблюдению правил приготовления закваски;
• проведение мероприятий по нормализации фаговой ситуации.

При определении количества фагов в различных объектах на заводе нужно использовать в качестве тест-культур набор индикаторных штам­мов, который вырабатывается на Угличской биофабрике, и можно ис­пользовать саму закваску, принимая во внимание, что негативные коло­нии на газоне, образуемом микрофлорой закваски, появляются только при наличии в составе этой микрофлоры не менее 20-40% чувствитель­ных к данному фагу клеток, когда закваску уже нужно изымать из обращения. При определении наличия на заводе фагов к конкретным штаммам для решения вопроса о возможности использования того или иного штамма этот штамм и должен служить индикаторным.

Среды для выявления фагов должны быть хорошо забуферены, чтобы получить высокую плотность клеток индикаторных штаммов, необходимую для получения газона. При высокой плотности по­пуляции титр фага может достигать 10¹⁰. Нужно следить, чтобы буфер­ные соли не связывали ионы Са²⁺, необходимые для осуществления ли­тического цикла фага. Идеальным средством для этой цели является //-глицерофосфат.

Образцы сыворотки нужно отбирать в конце обработки зерна в по­следних выработках, когда обсемененность сыворотки фагами максимальна, или, что еще лучше, из балансового танка перед сепарированием сыворотки или из танка для хранения сыворотки после сепарирования. Следует избегать хранения сыворотки или хранить фильтраты сыворот­ки, свободные от бактерий, при температуре до 5° С, в противном слу­чае фаги или часть из них могут дезактивироваться.

Во ВНИИМС разработана процедура проведения фагового мони­торинга на сыродельных предприятиях. Основу метода выявле­ния фага составляет набор высокочувствительных к ЛФ штаммов лак­тококков (каждый чувствителен к более чем 50% коллекционных фа­гов); в совокупности штаммы, входящие в набор, чувствительны к 100% фагов, которые хранятся в коллекции ВНИИМС. Высокочувствитель­ные штаммы высевают классическим методом на двухслойный агар  для получения сплошного газона, в качестве среды используют среду для учета мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных бактерий, вырабатываемую в коммерческих масштабах. При выявлении бактериофагов посевы необходимо выдерживать при 30 и 37° С, так как не все фаги образуют негативные колонии при каждой из этих темпера­тур. Мытник с соавт. считают, что для выявления бактериофагов нужно одновременно засевать исследуемый субстрат в плотную и жид­кую среды. В качестве плотной среды они рекомендуют агар с гидролизованным молоком, жидкой - гидролизованное молоко с инди­каторами бромкрезолиурпуром или метиленовым голубым. Можно ис­пользовать СДА агар и бульон. Инокулят индикаторных штаммов сле­дует выращивать при той температуре, при которой готовят производ­ственную закваску.

В процессе разработки схемы фагового мониторинга проведено об­следование ряда сыродельных заводов, на которых наблюдались случаи потери активности производственных заквасок. Фаги, способные лизировать тест-культуры, обнаружены в 61,9% исследованных образ­цов молока в количестве до 10⁹ мл^-1. Такая высокая обсемененность части молока бактериофагами свидетельствует о его низком бактериаль­ном качестве. Фаги лактококков обнаружили в 25% пастеризованного молока и 33,3% пастеризованного молока при поступлении в сырную ванну, в 16,7% пастеризованного молока, подготовленного для приго­товления производственной закваски. Пастеризация молока для приго­товления закваски достаточна для полного уничтожения ЛФ, и их появ­ление в нем свидетельствует или о нарушении режима пастеризации, или о загрязнении молока после пастеризации во время охлаждения, когда в заквасочнике создается разрежение и воздух из заквасочной втягивается в заквасочник.

Результаты тестов сухих бактериальных концентратов и производ­ственных заквасок на присутствие ЛФ показаны в табл. 4.6. Только в одном образце сухих бакконцентратов были обнаружены бак­териофаги лактококков, и только в двух производственных заквасках из 18 проверенных они не были найдены. Следовательно, закваски были загрязнены фагами во время их приготовления на заводе. В 5,5% иссле­дованных заквасок содержание фагов превышало 10⁹ мл"¹, в 38,9% оно было ниже 10⁹, но выше 10⁷ мл"¹, еще у 38,9% оно было ниже 10⁷ мл"¹, но выше 10⁵ мл"¹. В заквасках, содержащих такое количество фага, об­наруживались гомологичные фаги не только к индикаторным штаммам лактококков, но и к штаммам, входящим в состав закваски, применяе­мой во время обследования заводов для выработки сыра. Это неудиви­тельно, так как при наличии в закваске 10⁷ мл"¹ фага в 1 мл закваски может содержаться один мутант фагов с измененным спектром литиче­ского действия. Кислотность таких заквасок к окончанию установлен­ного периода культивирования была ниже нормы. 25% выделенных на этих заводах фагов лизировали от 50 до 60% тесткультур, т. е. они обла­дали широчайшим спектром литической активности.

Эти исследования показали крайне неблагополучную фаговую си­туацию на обследованных предприятиях, обусловленную отсутствием должной защиты заквасок от бактериофага во время их приготовления.

Еще хуже положение на обследованных заводах Республики Бела­русь, где фаги найдены во всех образцах проверенных заквасок в количе­стве 10⁴-10¹⁰ мл"¹, в сыворотке в конце обработки зерна в первой выра­ботке в количестве 10^б—10⁸, в последних выработках - от 10⁴ до 10¹⁰ мл'¹. Это означает, что в сырной ванне с 10 т смеси может содержать­ся до 10¹⁷ вирионов и не менее 10⁸ мутантов с измененным спектром литического действия. Ясно, что в такой обстановке ни ротация штам­мов, ни использование фагоустойчивых культур не предотвратят быст­рую потерю активности производственных заквасок. Причины неблаго­получной фаговой ситуации на ряде заводов состоят в нарушениях пра­вил приготовления заквасок, низком уровне гигиены производства. Ме­ры исправления такой ситуации изложены в разд. 4.5. При этом чрезвы­чайно много в складывающейся на заводах фаговой ситуации зависит именно от коллектива завода. Так, фаговый мониторинг на заводах в Венгрии показал, что в подсырной сыворотке содержание фага на раз­личных от заводах варьирует от 10 до 10¹⁰ мл"¹ . В другой работе контрольные сыры вырабатывали на оборудовании, для мойки и дезин­фекции которого использовали кальцинированную соду и хлорную из­весть, в опытных выработках использовали более прогрессивные мою­ще-дезинфицирующие средства и режимы санитарной обработки обо­рудования. Контрольные сыры были оценены первым, опытные - высшим сортом.

На крупных сыродельных заводах, где опасность фаголизиса мик­рофлоры и убытки от этого особенно велики, может быть другая систе­ма использования заквасок и фагового мониторинга. Первое условие - высокий гигиенический уровень приготовления заквасок и производст­ва сыра - обязательное для предприятий любой мощности. На крупных предприятиях с хорошо поставленной микробиологической службой можно использовать для выработки сыра только мутанты лактококков, нечувствительные ко всем фагам, циркулирующим на предприятии, и не выделяющие в среду умеренных фагов, к которым чувствительны дру­гие штаммы, применяемые на данном предприятии. Фаговый монито­ринг на предприятии заключается в ежедневном исследовании сыворот­ки и закваски на наличие бактериофагов, гомологичных к применяемым на предприятии мутантам.

С фагоустойчивыми мутантами лактококков, получаемыми путем культивирования родительских штаммов в стерилизованном молоке с сывороткой, вырабатывают больше 60% сыра Чеддер в Австралии.