Физиолого-биохимические свойства маслянокислых бактерий бы­ли подробно изучены в отделе микробиологии ВНИИМС (А. Гудков, Перфильев и др.).

Кислотность. Минимальные значения pH, при которых может происходить рост маслянокислых бактерий, при прочих оптимальных условиях в зависимости от штамма и вида равны 4,2-4,7. На сре­дах с глюкозой маслянокислые бактерии наиболее энергично размножа­лись при pH 6,6-6,0, в средах с лактатом Са в присутствии ацетатов при pH 5,5-6,0. Минимальный pH, при котором Сl. tyrobutyricum сбраживал лактаты, равняется 5,0, Cl. butyricum - 5,1-5,3; остальные виды маслянокислых бактерий - 5,4-5,5. Оптимальный pH для образования и прорастания спор маслянокислых бактерий выше, чем для роста.

Нетоксигенный штамм Cl. butyricum рос при pH 4,2, токсигенный - при pH не ниже 5,2.

На развитие Сl, tyrobutyricum оказывает влияние не только pH, но и содержание не- диссоциированной молочной кислоты: в мо­дифицированной сыворотке из-под сыра Гау­да рост этого вида при 30° С был задержан на 40 сут при pH не выше 4,8 и концентрации молочной кислоты 2%, или при pH 5,1-5,2 и содержании молочной кислоты 4%.

При низких pH меняется характер ме­таболизма маслянокислых бактерий: они перестают образовывать или резко снижают объем образуемых бутирата и водорода, ог­раничиваясь образованием ацетата и С0₂. Так, в опытах с выработкой сыра Чеддер в асептической ванне Сl. tyrobutyricum начал расти в некоторых опытных сырах, имеющих pH около 5,0, без следов газообразования. В процессе роста это­го вида pH сыров повысился до 5,3 (маслянокислые бактерии при сбра­живании лактатов образуют одну молекулу бутирата из двух молекул лактата), а в опытных сырах, в которых не было признаков роста масля­нокислых бактерий он остался без изменения. При ухудшении условий для роста маслянокислых бактерий, прежде всего подавляется их газо­образующая способность. При снижении активности воды минималь­ный pH для размножения маслянокислых бактерий повышается.

Активность воды и содержание соли. Минимальные значения А_в и максимальные концентрации соли, при которых происходит рост мас­лянокислых бактерий в средах с глюкозой, показаны в табл. 6.16. Они зависят от штамма и вида маслянокислых бактерий.

Чаще всего штаммы с высокой устойчивостью к А_в встречались среди Сl, tyrobutyricum. Это очень важно для сыроделия, поскольку, в отличие от большинства возбудителей пищевых отравлений, масляно­кислые бактерии размножаются в сырах после того, как соль начала распространяться по всей массе головки сыра, что снижает А_в в глубин­ных слоях. Большинство штаммов Cl. tyrobutyricum прекращало рост в среде с 5%, штаммов другого вида - с 4% соли.

Продукты метаболизма Cl. tyrobutyricum в большой степени зави­сят от А_в среды (рис. 6.8): по мере увеличения концентрации соли сни­жается общее количество образуемых кислот, но количество масляной кислоты снижается намного быстрее, чем уксусной. Масляная кислота перестала образовываться в среде с 3,7% NaCl.

Чувствительность к соли зависит от pH, состава среды. В табл. 6.17 приведены предельные концентрации NaCl в печеночном бульоне для роста маслянокислых бактерий при 37° С в течение 4 сут. Наи­большей устойчивостью к соли они обладали при pH 6,5, при pH 5,1-5,5, характерном для твердых сыров, устойчивость к NaCl снижается. Добав­ление в печеночный бульон 1% лактата натрия несколько увеличило чувствительность к соли Cl. butyricum, а у Cl. tyrobutyricum она возросла только при pH 5,0. При выдержке в течение 14 и 60 сут максимальные концентрации соли для Cl. tyrobutyricum и Cl. butyricum при 24° С и pH равнялись соответственно 5,6 и 3,1%, при 37° С - 5,1 и 2,1%.

Температура. Влияние температуры на развитие маслянокислых бактерий в среде с глюкозой показано на рис 6.9. Оптимальные температуры для Сl, butyricum и Сl, pasteurianum лежат в интервале 26-34° С, Cl. tyrobutyricum - 26-37° С, максимальные лежат в пределах 46° С. Для сыроделия большее значение имеет нижняя граница для рос­та маслянокислых бактерий: для Сl, tyrobutyricum она равнялась около 8° С, для двух других видов - (11-12)° С.

Температура влияет на выход и скорость накопления биомассы: при 20° С Сl, tyrobutyricum достигала стационарной фазы в зависимости от штамма за 150-190 ч, а при температурах 30-37° С - за 95 ч (70-120 ч). Выход биомассы и скорость размножения маслянокислых бактерий резко снижались при температурах ниже 16° С, а для Cl. tyrobutyricum также наблюдается подобный скачок при переходе температуры через 12° С. При сбраживании лактата кальция Сl, tyrobutyricum быстрее растет при 22-24° С (А. Гудков, неопубликованные материалы). Споры Сl, tyro­butyricum отличаются невысокой термоустойчивостью: часть из них поги­бает при температурах выше 80° С. Для полного уничтожения их спор необходима выдержка при 120° С в течение 20 с, при 130° С - 4 с.

Взаимоотношения с другими бактериями. Для сыроделия осо­бенно важны взаимоотношения между маслянокислыми и молочнокис­лыми бактериями, поскольку в сырах маслянокислое брожение прохо­дит на фоне молочнокислого брожения. При совместном развитии мас­лянокислых и молочнокислых бактерий на первом этапе молочнокис­лые бактерии, снижая Eh среды, создают условия для роста масляно­кислых. Это продолжается до тех пор, пока pH в совместной культуре не снизится до уровня, при котором рост маслянокислых бактерий пол­ностью подавляется. Поскольку молочнокислые бактерии при достаточ­но большом начальном количестве и наличии в среде необходимых ко­личеств углеводов быстро смещают pH в незабуференных средах до уровня ниже предельного для роста маслянокислых бактерий, послед­ние в кисломолочных продуктах не размножаются. Иное дело в твердых сырах, pH которых из-за ограниченного содержания лактозы и высокой буферности сырной массы, хотя и приближается к нижней границе для роста маслянокислых бактерий, но не пересекает ее (исключением яв­ляются сыры с высоким уровнем молочнокислого брожения, в которых иногда он опускается ниже этой границы - до 4,9).

Попадание в сыр спор маслянокислых бактерий (даже Cl. tyrobu- tyricum) еще не означает его неизбежную порчу в результате маслянокис­лого брожения, даже если сыр будет выработан по оптимальной с точки зрения формирования органолептических показателей технологии (при выработке сыров по такой технологии создаются наиболее благоприятные условия для развития маслянокислых бактерий, поэтому ее применяют при отсутствии в молоке опасных количеств спор этих микроорганизмов). Наиболее вероятной причиной этого является наличие в сырах среди мик­рофлоры закваски или «дикой» молочнокислой микрофлоры видов или штаммов, обладающих специфическим антагонизмом по отношению к маслянокислым бактериям.

Две группы лактобактерий обладают специфическим антагониз­мом к клостридиям. Первую представляют штаммы молочного лакто­кокка, образующие антибиотик низин. Низин - полипептид, ока­зывает бактерицидное действие на маслянокислые бактерии преимуще­ственно в период после прорастания спор до начала активного размно­жения, а также на многие грамположительные бактерии, включая ста­филококки и листерии. Пока его не используют в производстве натуральных сыров, поскольку он угнетает развитие кислотообразую­щих бактерий закваски и тем самым создает условия для развития грамотрицательных бактерий, на которые не действует. Не нашли приме­нения и закваски из образующих низин лактококков, поскольку они об­ладают низкой кислотообразующей активностью и высокой чувстви­тельностью к бактериофагу.

Пока в сыроделии низин используют только в производстве плав­леных сыров. Однако ведутся работы по конструированию штаммов лактококков, продуцирующих низин и обладающих требуемой в сыро­делии скоростью развития и кислотообразования в молоке и фагорезистентностью.

Специфический антагонизм других видов молочнокислых бактерий к маслянокислым бактериям обусловлен способностью связывать рас­творенный в среде кислород с образованием определенных количеств перекиси водорода и, возможно, других радикалов кислорода, токсичных для живых клеток. По-видимому, биологическая целесообразность асси­миляции кислорода молочнокислыми бактериями заключается в сниже­нии Eh среды до требуемого для их активного роста уровня. Молочно­кислые бактерии или связывают кислород с минимальным образованием токсичных веществ, или имеют системы защиты, позволяющие им ус­пешно размножаться в присутствии в среде определенного количества перекиси водорода. Маслянокислые бактерии эффективной защиты от токсичных радикалов кислорода не имеют, что и определяет их высокую чувствительность к кислороду. Штаммы молочнокислых бактерий, обра­зующие достаточно высокие концентрации токсичных продуктов асси­миляции 0₂, ингибируют маслянокислые бактерии при совместном рос­те. Как правило, специфический антагонизм этого рода присущ видам и штаммам с невысокой кислотообразующей активностью. Наиболее часто специфические антагонистические свойства этого типа встречаются у ме- зофильных лактобацилл, в частности среди штаммов Lbc. plantarum. На рис 6.10 показано образование кислоты и Н₂0₂ штам­мами Lbc. plantarum (средние данные для нескольких штаммов).

Особенно энергично перекись образовывалась в первые сутки роста. Все штаммы Lbc. plantarum образуют Н₂0₂, но в разных количествах: к 48 ч культивирования, когда содержание перекиси в среде достигает макси­мума, 46,6% исследованных культур образовывали в среднем 2,01 мг/л (0,53-3,6) перекиси, 33,3% - около 12,3 мг/л (8,03-16,9), 13,8% - 28,6 мг/л и 6,8% - более 50 мг/л. Образование перекиси прекращается к началу стационарной фазы развития, что зависит от температуры культивирова­ния: при 11-12° С оно продолжается 12 сут. После достижения макси­мума содержание перекиси начинает снижаться.

По влиянию на органолептические показатели сыра и скорости кислотообразования в молоке Lbc. plantarum может быть только дополни­тельным компонентом заквасок для сыра, основу которых должны со­ставлять лактококки. Для того чтобы закваски, в состав которых вклю­чают штаммы Lbc. plantarum - антагонисты маслянокислых бактерий, образующие Н₂0₂, - сохраняли требуемую активность, лактококки не должны ингибироваться теми концентрациями перекиси, которые обра­зуют лактобациллы. На рис. 6.11 показана чувствительность к Н₂0₂ лак­тококков и маслянокислых бактерий. Из рисунка видно, что кон­центрация Н₂0₂, на 50% подавляющая рост маслянокислых бактерий, почти в два раза ниже ее концентрации, подавляющей на 50% рост мо­лочного и диацетильного лактококков. Чувствительность к перекиси сливочного лактококка почти такая же, как маслянокислых бактерий, поэтому его нецелесообразно вводить в закваски вместе с лактобацил­лами - антагонистами маслянокислых бактерий. Таким образом, суще­ствует диапазон концентраций перекиси водорода, которые в большой степени ингибируют рост маслянокислых бактерий, оказывая незначи­тельное действие на молочный и диацетильный лактококки.

На рис. 6.12 показан совместный рост маслянокислых бактерий и штаммов Lbc. plantarum, образующих в молоке различные количества Н₂0₂. Из рисунка видно, что все три проверенные штамма Lbc. plan­tarum оказывали ингибирующее действие на накопление биомассы мас­лянокислыми бактериями, степень ингибирования была различной - пропорционально количеству образуемой в среде штаммами лактоба­цилл Н₂0₂ . Наибольшей антагонистической активностью обладал Lbc. plantarum 28, образующий в молоке около 9 мг/л перекиси. Он был использован в заквасках, обладающих антагонистическим действием на маслянокислые бактерии. Рост Cl. tyrobutyricum в зависимости от штам­ма снижался на 50% в присутствии 2,7-8,8 мг/л Н₂0₂.

Максимальные концентрации H₂0₂, образуемые в молоке лактокок­ками, Lbc. plantarum, Lbc. acidophilus, Lbc. lactis и Lbc. bulgaricus в зави­симости от штамма равнялись соответственно 1,02-6,46; 2,04- 70,04; 13,6-54,4; 14,96 и 10,88 мг/л.

Некоторые штаммы молочного лактококка, Lbc. casei, Lbc. plan­tarum, Lbc. fermentum, Lbc. lactis, Lbc. helveticus, Lbc. bulgaricus и Lbc. aci­dophilus, термофильного стрептококка образуют бактериоцины, ингбирующие рост маслянокислых бактерий. Обычно антагонистическое действие этих веществ слишком низкое, чтобы подавить развитие клостридий в сырах с высокой температурой II нагревания.

Имеются материалы, свидетельствующие о стимулирующем дей­ствии на маслянокислые бактерии БГКП. В условиях, лимитирующих снижение pH, многие молочнокислые бактерии не по­давляют, а стимулируют рост маслянокислых бактерий. Так, из числа проверенных штаммов термофильных молочнокислых палочек в среде, содержание энергетического материала в которой было рассчитано так, чтобы конечный pH ее равнялся 5,2-5,3, рост Cl. tyrobutyricum стимули­ровали 74,95% штаммов Lbc. helveticus, 62,5% Lbc. bulgaricus, 60% Lbc. lactis; ни один из проверенных штаммов не обладал антагонизмом по отношению к этим микроорганизмам. В этих же условиях при изменении pH среды от 6,7 до 5,2 все испытанные штаммы лактококков, за исключением низинобразующих, стимулировали рост маслянокислых бактерий. Особенно сильное стимулирующее действие оказывали штаммы молочного лактококка. В совместных с лактококками культу­рах маслянокислые бактерии начинали вегетативный рост с самого на­чала культивирования. Рост маслянокислых бактерий стимулируют термофильный стрептококк и пропионовокислые бактерии.