Психротрофы - микроорганизмы, которые при температуре 6,5° С и ниже дают рост в благоприятных для их развития средах при инкуба­ции в течение до 10 сут. Из них выделяют психрофилы, оптимальная температура для роста которых - не выше 15° С, максимальная - не выше 20° С. Психрофилы обитают в специфических экологических ни­шах, где температура не поднимается выше 20° С, например, в глубине морей и океанов; они не играют никакой роли в сыроделии. Собственно психротрофы имеют максимальную температуру для роста выше 20° С, оптимальную - выше 15° С.

Психротрофы широко распространены в природе: в воде, почве, сточных водах. Широкое внедрение холодильного хранения делает психротрофы одной из основных групп микрофлоры сырого молока, что, наряду с уникальными свойствами многих психротрофов, опреде­ляет их огромное значение для сыроделия.

На молочные фермы психротрофы попадают главным образом с водой. На большинстве ферм имеется оборудование для охлаждения и хранения охлажденного молока. В охлажденном молоке психротрофы размножаются без особой конкуренции со стороны других сапрофитов и при нарушениях правил гигиены распространяются по всей ферме. По Моисеевой, доля психротрофов в микрофлоре свежевыдоенного молока составила при высоком уровне гигиены на фермах - 10%, при низком - до 75%. Содержание психротрофов в молоке с фермы, где оно не охлаждалось и через 1-2 ч после дойки направлялось на молочный за­вод, равнялось в среднем 47-10³ (7-87 тыс.) КОЕ/мл или 19,6% от обще­го количества микроорганизмов. В то же время, в молоке, которое на ферме хранили при 9-10° С и дважды в сутки отправляли на завод, их количество составило 1,85-10* (от 1,6 до 2,310⁶) КОЕ/мл или 45,7% от общего количества бактерий. По неопубликованным данным Перфильева (1998), содержание психротрофов в 31 партии молока, по­ступившего в 1993-1994 гг. в экспериментальный цех ВНИИМС, составило в среднем 4,8-10⁶ (от 4-10³ до 1,2-10⁷ КОЕ/мл). При этом 65,4% об­разцов содержали менее 10³ КОЕ/мл психротрофов. Высокая обсеме- ненность некоторых партий молока психротрофами объясняется низким качеством мойки и дезинфекции оборудования для хранения и транспор­тировки охлажденного молока, адгезией клеток психротрофов к поверх­ностям из нержавеющей стали и образованием на них колоний, достаточно высокими температурами хранения молока по сравнению с применяемыми за рубежом. Так, если время генерации Pseudomonas fluorescens в молоке при 4° С равняется 10,5 ч, то при 10° С - 5,5 ч. Эти данные свидетельствуют о том, что главной причиной высокого загряз­нения молока психротрофами является размножение в недостаточно охлажденном молоке. По Кузину с соавт., 75% закупленного учебно­опытным заводом Вологодского молочного института молока содержа­ло более 10⁶ КОЕ/мл психротрофов. В молоке, поступающем на сыродельный завод ВНИИМС, содержание психротрофов достигало 80% от общего содержания бактерий. Психротрофы обладают низкой редуцирующей активностью и поэтому не полностью выявляют­ся редуктазной пробой. Вызывает удивление большое увеличение со­держания психротрофов в молоке во время транспортировки: при сред­нем увеличении содержания микроорганизмов в молоке за время транспортировки в 3,2 раза, численность психротрофов увеличилась в 21,7 раза. Возможно, это связано с увеличением содержания растворенного в молоке кислорода или с разобщением скоплений психротрофов, в результате чего количество клеток психротрофов, со­ставляющих образующую колонию единицу, уменьшается, а следова­тельно, увеличивается количество колониеобразующих единиц при постоянном содержании клеток.

Состав психротрофной микрофлоры сырого молока (% от общего числа психротрофов): Pseudomonas 37,1; Acinetobacter - 24,7; Flavo- bacterium - 13,7; Escherichia - 10,7; Micrococcus - 6,0; Enterobacter - 5,0; Aeromonas - 1,8; Klebsiella - 1,0 [1756]. Близкий состав психротрофов молока установлен венгерскими исследователями, но они нашли допол­нительно представителей родов Alcaligenes и Serratia.

Психротрофы можно разделить на такие, у которых способность расти при низких температурах является родовым или видовым призна­ком (Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium и др.), и такие, у кото­рых это свойство присуще только части штаммов, например, энтеробак­терии. До 75% психротрофов сырого молока принадлежат к Pseudomonas к Acinetobacter. В Японии установлено, что 90,2% культур психро­трофов, выделенных из сырого и пастеризованного молока, являются псевдомонадами, в Аргентине доля псевдомонад среди психротро­фов сырого молока превысила 50%. Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, составляющие основную часть психротрофов сырого молока, являются грамотрицательными палочками размером, соответст­венно (0,5—1,0)х(1,5—5,0); (0,9-1,6)х(1,5-2,5) и (0,5-1,0)х(1,0-3,0) мкм. Представители рода Acinetobacter в стационарной фазе развития приобретают сферическую форму. Флавобактерии неподвижны, ацине- тобактеры двигаются рывками, псевдомонады осуществляют плаваю­щее движение с помощью одного или нескольких жгутиков. Строгие аэробы, метаболизм дыхательный с использованием кислорода в качест­ве конечного акцептора электронов, псевдомонады могут расти в ана­эробных условиях с использованием в качестве акцептора электронов нитратов. Ацинетобактеры в питательных средах не образуют пигмен­тов, псевдомонады образуют флюоресцирующие диффундирующие и недиффундирующие пигменты, флавобактерии при росте на питатель­ных средах образуют пигменты от желтого до оранжевого цвета.

Из псевдомонад в молоке чаще всего обнаруживают Р. fluorescens, и, кроме него, Р. putida, Р. fragi, Р. aeruginosa. Они непато­генны для человека, кроме Р. aeruginosa, который является условно- патогенным или даже патогенным микроорганизмом. Р. aeruginosa (синегнойная палочка) образует диффундирующий не­флюоресцирующий пигмент сине-зеленого цвета, Р. fluorescens пигмен­ты этого типа не образует. Р. aeruginosa синтезирует экзо-, эндоэнтеро­токсины и может вызывать заболевания по типу пищевых и водных ток- сикоинфекций, но случаи таких заболеваний через сыры в литературе не описаны (сычужные сыры неблагоприятны для роста строгих аэробов). Доля желудочно-кишечных заболеваний, вызываемых синегнойной па­лочкой, в общем количестве заболеваний ЖКТ, вызванных условно- патогенными микроорганизмами, равняется 2,04%. Р. aeruginosa при хороших гигиенических условиях получения молока редко обнару­живается, однако при неудовлетворительной мойке и дезинфекции обо­рудования она обнаруживалась в 56% проб в количестве от 10 до 10⁶КОЕ/мл.

Способностью медленно расти при низких температурах обладают L monocytogenes и Y. enterocolitica, но доля этих видов в общем количе­стве психротрофов сырого молока незначительна.

Оптимальные температуры для роста Р. aeruginosa - 37° С, для ос­тальных видов - 22-26° С; Р. aeruginosa не растет при температуре 4° С и ниже, растет при 41° С; Р. putida и Р. fluorescens растут при 4° С, но не 41° С; Р. fragi не растет при температуре выше 36° С. Оптимальный pH для роста Р. aeruginosa в молоке равен 6,25-6,50; рост этого вида в средах задерживали 5% соли.

В сыроделии условия для преимущественного роста психротрофов создаются при хранении молока и сыра при 2-8° С и созревании молока при 8-12° С. Сведения о скорости развития психротрофов в молоке при этих температурах противоречивы. По одним данным, за 4 сут их коли­чество в молоке увеличилось при 2° С в 3-4 раза, при 4° С - в 6-8 раз, по другим - в 41 или в 100 раз. По данным венгерских ученых, количество психротрофов в молоке за 48 ч хранения при тем­пературах 2, 5 и 8° С возросло в 2; 3,8 и 6,6 раза соответственно.

В табл. 6.25 показано развитие психротрофов в молоке в зависимо­сти от степени его исходного загрязнения микроорганизмами, темпера­туры и продолжительности хранения. В молоке со сравнительно невысокой исходной бактериальной обсемененностью количество психротрофов увеличилось за двое суток при 4-5° С примерно в 13 раз, при 7-8° С - в 500 раз и при 10-12° С - в 800 раз. В молоке с высокой исходной бактериальной загрязненностью скорость размножения психротрофов уменьшилась в 3-7 раз. Тесной корреляции между исходным и конечным содержанием психротрофов в молоке после хранения или созревания нет.

Различия в интенсивности развития психротрофов в молоке, уста­навливаемые разными авторами, могут быть также обусловлены неоди­наковым составом психротрофной микрофлоры в изучаемых образцах сырого молока. При температурах 4-5° С и ниже в молоке активно раз­множается только Р. fluorescens, что, очевидно, и делает этот вид наи­более распространенным в сыром молоке, хранившемся при достаточно низких температурах. Чем выше исходная доля этого вида среди психротрофов, тем быстрее будет идти накопление их биомассы.

Как среда для роста психротрофов образцы молока по физико-хи­мическим свойствам могут сильно различаться. Особенно большое зна­чение имеет содержание в молоке растворенного кислорода, поскольку большинство психротрофов являются строгими аэробами.

Снижение интенсивности размножения психротрофов в молоке низкого бактериального качества можно объяснить ингибиторным дей­ствием на рост психротрофов остальной микрофлоры. Имеются много­численные данные об ингибировании роста психротрофов в молоке мо­лочнокислыми бактериями. Кузин изучал совместный рост Р. fluorescens и молочнокислых бактерий в молоке при 9-11° С. Посев­ные дозы псевдомонад (0,01-1,0)-10⁶ КОЕ/мл, молочнокислых бактерий - (0,01—10)-10⁶ КОЕ/мл. Степень антагонизма количественно он характе­ризовал антагонистическим индексом (А):

В табл. 6.26 приведены результаты его исследований. Из 112 про­веренных штаммов молочнокислых бактерий только 4 не обладали ан­тагонизмом к Р. fluorescens, что свидетельствует о том, что способность подавлять рост этого вида в молоке при 9-11° С является общим свой­ством молочнокислых бактерий, хотя выраженность антагонистических свойств неодинакова у различных родов, видов и штаммов. Наиболее сильными антагонистами из лактококков оказался подвид Lc. diacetylactis, из лейконостоков - Leuc. cremoris, среди лактобацилл - Lbc. casei. В пределах вида антагонистическая активность была наименее изменчива у Leuc. cremoris и Lbc. casei, штаммы которых по антагонистической активности разнились не более чем на 25%. Антагонистические индексы были в 1,4-9,2 раза выше при совместном росте в первые 24 часа, чем по прошествии 48 ч. Так, если после 24 ч совместного роста с Lbc. casei количество жизнеспособных клеток псевдомонад было ниже на 30,3%, то после 48 ч разница уменьшилась до 12,4%. Важно, что ан­тагонистическое действие на псевдомонады проявили даже виды и штаммы молочнокислых бактерий, которые не размножались при 9-11° С в течение 1-2 сут, в частности Lbc. casei. Американские ученые наблю­дали значительное ингибирование роста психротрофов при 5,5° С при внесении в среду 2,5Т0⁸ /мл болгарской палочки, которая не размножает­ся при этой температуре; степень ингибирования коррелировала с коли­чеством образуемой лактобациллами перекиси. Это явление мож­но объяснить или внесением с инокулятом молочнокислых бактерий специфических антибиотических веществ, адсорбированных на поверх­ности клеток, или разобщенностью процессов размножения и синтеза антибиотических веществ, подобно разобщенности кислотообразования и размножения у лактококков (гл. 3). Каким бы ни был механизм инги­бирования роста психротрофов покоящимися клетками лактобацилл, это явление позволяет использовать молочнокислые бактерии для ограничения роста психротрофов во время хранения или созревания молока без опасения нежелательных для производства сыра изменений физико-химических свойств молока. Добавление в сырое молоко иммобилизованных в частицах Са - альгинатного геля клеток L. lactis и Lbc. helveticus в количестве 2,7-10⁷ и 13-10⁷ клеток/мл, соответственно, снижало в нем содержание психротрофов после 2-суточного хранения при 7° С на 50% при снижении pH только на 0,1-0,22 ед.

Положительные результаты получены при использовании специ­альных заквасок для созревания молока с целью ингибирования роста психротрофов. Закваски с таким функциональным назначением может поставлять Угличская экспериментальная биофабрика.

Пастеризация молока при 12° С в течение 15 с снижала содержание в нем псевдомонад с 10^б клеток/мл до 10 клеток/мл; выдержка этого мо­лока после пастеризации при 7° С в течение 7 сут привела к увеличению содержания псевдомонад до 10⁴ клеток/мл. Таким образом, пас­теризация молока по принятому в сыроделии режиму не полностью уничтожает псевдомонады при достаточно высоком их исходном со­держании в молоке. В то же время, Mikawa, изучив очень большое ко­личество психротрофных бактерий, выделенных из сырого и пастеризо­ванного молока, пришел к выводу об их уничтожении во время пастери­зации молока при 63° С в течение 30 мин. Анаэробные условия в сырах препятствуют активному развитию психротрофов молока, боль­шинство которых являются строгими аэробами, но существует прямая корреляция между содержанием психротрофов в твердых сырах с низкими температурами II нагревания после прессования и количест­вом психротрофов в смеси для выработки сыра (г = 0,92).

В опытах Перфильева (неопубликованные материалы) психротрофы достаточно активно размножались во время созревания Голландского сыра. Независимо от исходного содержания в смеси их содержание в период максимума составило (2,2—2,7)-10⁸ КОЕ/r. Однако этот макси­мум наступил в сырах, выработанных при исходном содержании в сме­си единиц, тысяч и десятков тысяч КОЕ/мл психротрофов соответст­венно через 35, 26 и 15 сут созревания. Напрашивается вывод, что в сы­рах имеется ограниченное количество источников энергии, которые могут быть использованы только психротрофными клетками (в против­ном случае они были бы использованы к 15-35-суточному возрасту мезофильной микрофлорой сыра). Видовой состав психротрофов сыра Перфильевым не был исследован. По-видимому, в этом случае размно­жались штаммы факультативных анаэробов, обладающих психротроф­ными свойствами.

Несколько другие результаты получены литовскими исследовате­лями. По их данным, увеличение содержания психротрофов в сы­рах с низкой температурой II нагревания наблюдалось только на началь­ном этапе созревания, после чего оно стало снижаться. Не установлено статистически достоверной связи между содержанием психротрофов в период максимума и в конце созревания. Масштабы размножения псих­ротрофов зависели от активности молочнокислого брожения.

Различия между результатами этих исследований можно объяснить неодинаковым составом психротрофов в сырах, в частности долей в их составе энтеробактерий. Имеется сообщение, что до 25% психротрофов сыра могут быть представлены энтеробактериями.

Вред сыроделию приносят протеолитические и липолитические эн­зимы, образуемые психротрофами в молоке и сохраняющие активность после пастеризации. Во время роста в молоке протеолитически активные виды и штаммы психротрофов переводят часть белка в растворимое со­стояние, что снижает выход сыра. Для определения величины снижения выхода сыра из-за размножения психротрофов предложена формула:

Эта формула дает ориентировочную цифру, так как она не учиты­вает ряда факторов, влияющих на интенсивность роста и продуцирова­ния протеолитических энзимов психротрофами, в частности температу­ры хранения.

Протеолитические и липолитические энзимы психротрофов, со­храняющие активность после пастеризации молока, вызывают прогорк­лый, горький, салистый, фруктовый вкус и некоторые другие привкусы; выраженность этих пороков зависит от количества образовавшихся эн­зимов, температуры и продолжительности созревания сыров. Фрукто­вый вкус и запах, например, возникают в результате взаимодействия жирных кислот - продуктов гидролиза молочного жира липазами - и спиртов, образуемых лейконостоками, дрожжами и некоторыми други­ми микроорганизмами. При высоком содержании в молоке псих- ротрофы ухудшают сычужную свертываемость молока, делают сычуж­ный сгусток менее плотным, плохо отдающим сыворотку, время сы­чужного свертывания в зависимости от вида психротрофов может сни­жаться или возрастать. Выдержка молока при низких температурах вы­зывает изменения мицелл казеина, что также серьезно ухудшает его сычужную свертываемость (гл. 2). Разделить влияние психротрофов и химических изменений молока под воздействием низких температур на его сыропригодность трудно.

В молоке с высоким содержанием психротрофов скорость кислотообразования лактококками повышается, что обусловлено образованием низкомолекулярных продуктов протеолиза. Большинство исследованных штаммов психротрофов стимулировало рост List, monocytogenes.

Протеолитической и липолитической активностями обладали 94% выделенных из молока псевдомонад, в т. ч. 23,4% сильной и 29,4% сла­бой протеолитической активностью. Среди психротрофов других родов обнаружены слабые протеолиты и липолиты. Wessels et al. нашли, что из 75 психротрофных культур энтеробактерий 7 обладали протеоли­тической активностью в молоке при 7° С, 10 - при 25° С; липолитиче­ской активностью - 9 культур.

Образование внеклеточных иротеиназ и липаз псевдомонадами происходит в конце логарифмической и начале стационарной фаз роста, когда плотность их популяции превысит 10⁵ КОЕ/мл. Достаточно высокие концентрации внеклеточных протеиназ и липаз в молоке обна­руживаются при наличии 10⁶— 10⁷ КОЕ/мл псевдомонад. При дли­тельном культивировании начинается автолиз клеток псевдомонад и в среду выделяются внутриклеточные протеиназы. Очищенные амино- пептидазы из Р. fluorescens расщепляют синтетические «горькие» пеп­тиды (не все) и сохраняют активность в сыре в течение 2 мес.

В культуральных средах Р. fluorescens и Р. aeruginosa максималь­ное количество протеиназ и липаз образуется при 20 и 30° С соответст­венно. С понижением температуры содержание этих энзимов в среде уменьшается, а в пересчете на единицу сухой биомассы увеличи­вается; при температуре 2° С синтез протеиназ и липаз прекращается или происходит с очень низкой скоростью. При 4° С синтез протеиназ и липаз Р. fluorescens на ед. клеточной массы был на 25% выше, чем при 10° С. Липолитическая активность псевдомонад наиболее сильно проявляется при 5° С.

Оптимальный pH для синтеза протеиназ и липаз псевдомонадами лежит в интервале 6,8-7,4; в отсутствие аэрации они начинают синтезировать внеклеточные протеиназы и липазы при более низкой концен­трации клеток в среде.

Уникальным свойством протеиназ и липаз психротрофов является необычайно высокая термоустойчивость. Они не инактивируются пас­теризацией молока при 77° С в течение 17 с и 140° С в течение 5 с; Дсю°с протеиназы Р. fluorescens равнялось 110 мин. Д_90°с протеиназ психротрофов было в 10 раз выше, чем Д-значение спор В. stearothermophilus. Однако 20-минутная выдержка при 55 и 60° С сни­жает активность протеиназ психротрофов на 47 и 44%, увеличение про­должительности выдержки при этих температурах повышает степень инактивации. При 45° С они инактивируются за 30 мин. Если при 60°С протеиназы психротрофов инактивируются, то при температурах выше 65° С они становятся термоустойчивыми. Липаза Р. fluo­rescens полностью или частично инактивировалась при 65° С, протеина- за оставалась активной. По Law, липазы псевдомонад полностью или частично сохраняют активность после выдержки при 63° С в тече­ние 30 мин. Инактивацию протеиназ при относительно низких температурах объясняют их автолизом, устойчивость к высоким темпе­ратурам - конформационными изменениями белка. Возможно, это явление обусловлено разрушением ингибиторов протеиназ при повы­шенных температурах. Интересно, что в ультрафильтрате молока без казеина липаза Р. fluorescens инактивируется при нагревании до 60 и 65° С, а в ультрафильтрате с казеином сохраняет свою активность. Протеиназы, образуемые различными штаммами и видами псевдомо­над, могут обладать различной термоустойчивостью.

Поскольку достаточные количества протеиназ и липаз образуются психротрофами в молоке, когда их количество превысит 10⁶ КОЕ/мл, а пастеризацией молока эти энзимы не инактивируются, можно ожидать, что сыры, выработанные из молока с таким уровнем развития психро­трофов, будут низкого качества. В сыре Чеддер, выработанном из моло­ка с наличием более 10⁷ КОЕ/мл психротрофов, количество свободных жирных кислот было в 3-10 раз выше, чем в сырах из молока с низким содержанием психротрофов; в 4-месячных опытных сырах появился прогорклый вкус.

Голландский сыр из молока с 10⁶ КОЕ/мл психротрофов в зрелом возрасте получил оценку на 1 балл ниже, чем контрольный сыр, а опыт­ный сыр из молока с 510⁶ КОЕ/мл - ниже на 3 балла. Небольшая разница в оценке обусловлена коротким периодом созревания этого сы­ра (45 сут), во время которого результаты деятельности энзимов псих­ротрофов не успели проявиться в полной мере. Зрелые сыры хранили при 1 и 8° С в течение 3-х мес: после хранения при 1° С качество опытных сыров было ниже контрольных на 1-2 балла, при 8° С - на 3-6 баллов.

Сыры Камамбер, выработанные из молока, хранившегося 9 дней при 5° С, имели горький и прогорклый вкус, не имели аммиачного запа­ха, содержали больше свободных жирных кислот, чем сыры, вырабо­танные из этого же молока после 2-суточного хранения при 5° С.

Псевдомонады, добавленные в молоко после пастеризации, во вре­мя выработки и созревания твердого сыра с низкой температурой II на­гревания не размножались и быстро вымирали. Это объясняет отсутст­вие токсикоинфекций через сыры, вызываемых Р. aeruginosa. Таким образом, основной контроль психротрофов должен проводиться на ста­дии созревания и резервировании молока. Однако, психротрофные эн­теробактерии, составляющие небольшую долю психротрофной микро­флоры сырого молока, размножаются в сырах и могут образовывать протеиназы и липазы непосредственно в сыре. В сырах они вызывают те же пороки, какие вызывают соответствующие энзимы псевдомонад. В твердых сырах энтеробактерии составляют до 21% общего числа психротрофов.

Kielwein показал, что Р. fluorescens является причиной гнилостного запаха Эмментальского сыра, однако нужно отметить ненормаль­ный состав микрофлоры изученных им дефектных сыров.

Псевдомонады были ответственны за появление красно-корич­невых пятен и гнилостного запаха на поверхности сыра Моцарелла. Источником загрязнения этого сыра псевдомонадами было не молоко, а вода, применяемая в производстве. Псевдомонады могут вы­зывать пороки корки и других сыров, в т. ч. твердых сыров с высокими температурами II нагревания. Псевдомонады хорошо раз­множаются в сыре Коттедж и являются главными виновниками его микробиологической порчи.

Хорошие результаты в предотвращении порчи Домашнего сыра псевдомонадами дает применение биогарда - препарата, приготовлен­ного на основе бактериоцинов молочнокислых бактерий. В опытном сыре с 0,4% биогарда при 7,2° С микрофлора не размножа­лась в течение 30 дней, большинство контрольных сыров потеряли по­требительские качества через 21 день, когда содержание в них псевдо­монад достигло 10⁸ КОЕ/г.

Меры предотвращения снижения качества сыров в результате раз­множения в молоке психротрофов включают:

• улучшение гигиены молока, включая особенно тщательную мойку и дезинфекцию оборудования для хранения охлажденного молока, молокопроводов после каждого производственного цикла;
• хранение молока при температурах ниже 4° С, при которых синтез протеиназ и липаз психротрофами не происходит или идет с очень низкой скоростью;
• термизацию или пастеризацию молока перед хранением и созрева­нием;
• добавление в молоко, направляемое на созревание или хранение, заквасок, обладающих специфическим антагонизмом по отноше­нию к психротрофам;
• предотвращение вработки воздуха в молоко путем контроля рабо­ты насосов, исправности прокладок;
• насыщение молока, находящегося на хранении или созревании, СО₂ или азотом для создания анаэробных условий.