Антимикробиальные факторы молока следует разбить на две груп­пы: природные, образуемые в организме матери для защиты новорож­денных от инфекций, в особенно больших количествах в период, когда его собственные защитные системы не успели до конца сформировать­ся, и инородные, попадающие в молоко из окружающей среды через организм коровы (секреторное загрязнение) или после его выхода из вымени (постсекреторное загрязнение).

Природные антибактериальные системы молока

Идентифицированы пять основных антимикробиальных факторов молока: лизоцим, лактоферрин, лактопероксидазная система, иммуно­глобулины и связывающие витамины протеины.

Лизоцим. Лизоцим коровьего молока термоустойчив: при 100° С в течение 20 мин в кислой среде его активность снижается только на 43%. В молоке здоровых коров содержится около 0,1 мкг/мл лизоцима; в маститном молоке его концентрация повышается до 1-2 мкг/мл. В женском молоке содержится до 100 мкг/мл лизоцима.

Лактоферрин. Лактоферрин - связывающий железо протеин. В коровьем молоке содержится 0,35-0,02 мг/мл лактоферрина (в жен­ском молоке - 2—4 мг/мл), в маститном молоке и молозиве его содержа­ние возрастает в 20-30 раз. Лактоферрин, связывая железо, подавляет размножение микроорганизмов, нуждающихся в этом элементе, не пре­пятствуя его усвоению тканями молочной железы. Лактоферрин связы­вает железо только в присутствии бикарбонатов. Цитраты, наоборот, отнимают ионы железа от лактоферрина, снижая или полностью ликви­дируя его антибактериальное действие. Кроме непосредственного дей­ствия на бактерии, лактоферрин участвует в формировании специфиче­ских защитных систем организма. По-видимому, главной его функцией является защита молочной железы в сухостойный период, поскольку в молоке из-за присутствия цитратов роль его незначительна.

Лактоферрин ингибирует развитие БГКП, но не молочнокислых бактерий, которые в железе практически не нуждаются. Некоторые бак­терии, в т. ч. патогенные, синтезируют низкомолекулярные соединения - сидерофоры, связывающие железо более прочно, чем лактоферрин, и переносящие его в клетки, что снижает действие лактоферрина in vitro.

Лактопероксидазная система (ЛП-система). ЛП катализирует окисление перекисью водорода присутствующих в молоке тиоцианатов с образованием токсичных для микроорганизмов промежуточных про­дуктов. Эти продукты окисляют SH-группы, играющие важную роль в мембранах бактериальных клеток, и тем самым ингибируют рост мик­роорганизмов или уничтожают их. ЛП-система действует на многие грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы, в том чис­ле на молочнокислые бактерии. Внесение компонентов ЛП-системы в пастеризованное при высокой температуре молоко, охлажденное и инокулированное 10-10⁴ КОЕ/мл List, monocytogenes, привело к гибели кле­ток листерий через 5 сут при 5° С и 8 сут при 8° С. Бактериостатическое действие ЛП-системы на листерии продолжается в течение 6 ч при 30° С, 20 ч при 20° С и 100 ч при 8° С.

Из трех элементов системы - лактопероксид аза, тиоцианаты и пере­кись водорода - лактопероксидаза в коровьем молоке всегда имеется в достаточном количестве (от 2 до 50 мг/л в зависимости от стадии лакта­ции). Тиоцианаты присутствуют в молоке в зависимости от рационов кормления в количестве до 10-15 мг/л (обычно 2-7 мг/л) и могут быть лимитирующим активность системы фактором. Перекись водорода всегда является лимитирующим фактором. Источником ее являются сами микроорганизмы, в том числе молочнокислые бактерии, которые при нали­чии в молоке кислорода образуют определенное количество перекиси во­дорода и тем самым как бы запускают в действие всю систему.

Иммуноглобулины (Ig). В 1957 г. Wright & Tramer обнаружили так называемые агглютины, под воздействием которых клетки чувствитель­ных к ним штаммов лактококков вступают в ассоциацию с жировыми шариками и поднимаются вместе со сливками в цельном молоке или агглютинируют друг с другом и осаждаются в обезжиренном молоке. После выдержки молока до 90% клеток чувствительных штаммов оказывается в сливках или в осадке, в результате чего кислотообразую­щая активность заквасок снижается. Ингибирование кислотообразования обусловлено тем, что в сливках или в осадке из-за высокой локальной плотности клеток повышается кислотность и бактерии скоро перестают размножаться. Для осаждения бактериальных клеток в обезжиренном молоке, инокулированном 1% закваски, требуется около 3 ч. Вместе со сливками отделяются не только клетки, но и бактериальные споры.

Агглютины являются иммуноглобулинами (Ig). Иммуноглобулины попадают в молоко из крови матери или образуются самой молочной железой. Образование Ig в молочной железе индуцируют ан­тигены из кишечника коровы, бактерии, попадающие в железу через сосковый канал.

В молоке обнаружены IgA, IgGl и IgG2, IgM в концентрации (мг/мл) соответственно 0,59; 0,2; 0,1 и 0,05; в молозиве - 47,6; 2,9; 3,9 и 4,2. Активным фактором в агглютинации бактериальных клеток является IgM. Различные штаммы лактококков агглютинируются раз­ными иммуноглобулинами, что свидетельствует о специфичности по­следних. Ig действуют на клетки не только лактококков, но и других видов бактерий.

Протеины, связывающие витамины. Молоко содержит протеи­ны, способные связывать витамин В₁₂ и фолиевую кислоту. В свою очередь, представители кишечной микрофлоры способны усваи­вать в молоке только свободные витамины. Наличие в молоке таких протеинов ингибирует рост бактерий, неспособных синтезировать фо­лиевую кислоту и витамин B₁₂.

Значение природных антибактериальных факторов молока в сыроделии. Природные ингибиторные системы обусловливают бакте­рицидную фазу молока, во время которой микрофлора не только не размножается, но даже может уменьшаться в количестве. Бактерицид­ная фаза обеспечивает определенную стойкость молока после дойки. Чем продолжительнее бактерицидная фаза, тем дольше молоко будет сохранять свое бактериальное качество. Подавление развития микро­флоры сопровождается утилизацией природных ингибиторов, поэтому чем более загрязнено молоко микроорганизмами и чем выше темпера­тура его хранения, тем короче бактерицидная фаза.

Для активизации ЛП-системы как альтернативы охлаждения молока в него добавляют 10-15 мг/л тиоцианатов и эквивалентное количество пере­киси водорода (до примерно 0,25 мМ). В зависимости от сте­пени бактериальной обсемененности молока активизация ЛП-системы по­зволяет сохранить его свойства в течение 16-26 ч хранения при 15-20° С.

На рис. 7.1 показано бактерицидное действие ЛП-системы на грамотрицательные бактерии в среде, содержащей 1,5 мкг/мл ЛП, 0,15-0,30 мкг/мл SCN^- и 0,10 мкг/мл глюкозооксидазы (для образования Н₂0₂).

Египетские ученые использовали лактопероксидазную систему для обработки молока в производстве рассольного сыра Домиати. Они вносили в молоко Н₂0₂ в количестве 200-250 мг/кг или смесь SCN (14 мг/кг) и Н₂0₂ (30 мг/кг) с повторным внесением через 4 ч еще 30 мг/кг Н₂0₂, после чего вырабатывали сыр по обычной технологии. Подобная обработка увеличивала время свертывания и несколько сни­жала выход сыра. Качество сыров, вырабатываемых из такого молока, было не очень высокого, но приемлемого уровня.

Около 55% активности лактопероксидазы сохраняется в молоке после пастеризации при 72° С в течение 15 с (Hill et al., 1977). Следовательно, ЛП-система должна действовать и в пастеризованном молоке.

Stadhouders установил, что скорость кислотообразования 10 мезофильных заквасок в течение 6 ч при 30° С в пастеризованном молоке при 72° С, 15 с была на 14-90% ниже, чем в молоке, пастеризованном при 95° С в течение 30 с (при этом режиме пастеризации ЛП полностью дезактивируется и ЛП-система перестает функционировать) . До­бавление ЛП к молоку, пастеризованному при 95° С, снижало кислото­образующую активность заквасок до уровня, характерного для молока, пастеризованного при 12° С в течение 15 с. Этот опыт говорит о сохра­нении активности ЛП-системы в молоке, пастеризованном при установ­ленном в сыроделии режиме. В результате этого опыта была также ус­тановлена разная чувствительность заквасок к действию этой системы, что может быть обусловлено неодинаковой активностью NADH Н₂0₂ оксидазы у штаммов лактококков, входящих в закваски, а от ее актив­ности зависит количество образуемой микроорганизмами Н₂0₂. Одна из испытанных заквасок в присутствии ЛП не снизила, а повысила ско­рость кислотообразования. Возможно, микрофлора этой закваски вооб­ще не образовывала свободной Н₂0₂, а ЛП дезактивирует какие-то пе- рекисные продукты, имеющиеся в молоке, и тем самым стимулирует рост и кислотообразующую активность этой закваски.

Молоко оказывает комплексное влияние на активность заквасок, обусловленное взаимодействием ЛП-системы, термостабильных стиму­ляторов и термолабильных SH-соединений. SH-факторы стимулируют рост и кислотообразующую активность микрофлоры заквасок, ослабляют ингибирующее действие ЛП-системы. Поэтому могут быть закваски, нечувствительные к ЛП-системе в сыром молоке и молоке, подвергну­том низкотемпературной пастеризации, не разрушающей SH-соединения, но чувствительные к этой системе в молоке после высокотемпе­ратурной пастеризации, разрушающей SH-соединения, при внесении в него после пастеризации ЛП.

Ингибирование размножения и кислотообразования мезофильных заквасок в пастеризованном молоке ЛП-системой может произойти только в том случае, если пастеризовали незрелое молоко, так как во время созревания молока тиоцианаты - необходимый элемент этой сис­темы - окисляются.

В пастеризованном при 72° С, 15 с молоке сохраняют активность иммуноглобулины, обработка молока при 78° С, 15 с полностью их де­зактивирует. Внесение в молоко молокосвертывающих энзимов сразу после внесения закваски предотвращает агглютинацию. Следовательно, активизация закваски путем 1-2-часовой выдержки в молоке до добав­ления молокосвертывающих энзимов может привести к противополож­ным результатам при наличии в закваске штаммов молочнокислых бактерий, чувствительных к Ig молока. Агглютинация также возможна при созревании молока с закваской в производстве кисломолочных сыров без применения или с ограниченным применением молокосвертывающих энзимов. Возможность агглютинации микрофлоры закваски следует учи­тывать при проведении пробы на ее активность: в производстве сычуж­ных сыров ее целесообразно проводить в молоке с добавлением молокос­вертывающих энзимов, в производстве кисломолочных сыров - в молоке без энзимов и в высоком слое.

Лизоцим, лактоферрин и белки, связывающие витамины, вряд ли могут оказать ингибиторное действие на микрофлору мезофильных за­квасок, поскольку в нормальном коровьем молоке концентрация лизоци­ма очень низкая, а в железе, фолиевой кислоте и витамине В₁₂ лактококки не нуждаются. Положение может измениться при большом содержании маститного молока в сборном, что связано с высоким содержанием лизо­цима в маститном молоке. В связи с термоустойчивостью и высокой кон­центрацией в маститном молоке лизоцима попадание маститного молока в сборное может привести к фальшивым положительным результатам при анализе молока на наличие инородных ингибиторов бактериальными ме­тодами. 53,6% молока от маститных коров ингибировали рост Bacillus stearothermophilus - тест-культуры для определения ингибиторов в моло­ке. Лактоферрин стимулировал это ингибиторное действие. Боль­шого практического значения это не имеет, потому что сборное молоко с высоким содержанием маститного молока содержит большое количест­во соматических клеток и должно браковаться как сырье для выработки сыра. Однако проверку молока на содержание инородных ингибиторов следует делать параллельно с определением содержания соматических клеток. При положительной пробе на ингибиторы и наличии больше 500 тыс ./мл соматических клеток нельзя сделать однозначный вывод о загрязнении молока инородными для него ингибиторами.

Влияние природных антибактериальных факторов на термофильные закваски изучено недостаточно. По-видимому, Str. thermophilus не чувст­вителен в чистой культуре к ЛП-системе, так как он не образует перекиси водорода. Однако этот вид используют в составе заквасок совместно с Lbc. helveticus, Lbc. bulgaricus и Lbc. lactis, которые образуют перекись водорода и ингибируются ЛП-системой. Возможно, в составе закваски термофильный стрептококк также будет ингибироваться этой системой.

Неприродные ингибирующие соединения в молоке

Неприродные ингибирующие вещества попадают в организм лактирующей коровы, а из него в молоко, чаще всего из кормов или в ре­зультате инъекции при лекарственной терапии. После инъекции в мо­лочную железу антибиотики обнаруживаются в молоке из обработанной доли вымени в течение 214 ч, а в сборном молоке - в течение 168 ч. Они могут также образовываться микроорганизмами, размно­жающимися в молоке. В качестве примера может служить образование в молоке некоторыми штаммами Lc. lactis термоустойчивого антибио­тика низина. Ингибирующие вещества могут попадать в молоко при неудовлетворительном ополаскивании оборудования и молокопроводов после дезинфекции.

Наличие в молоке ингибиторов снижает скорость развития микро­флоры, применяемой в производстве сыров и кисломолочных продук­тов, что создает более благоприятные условия для размножения болез­нетворных и технически вредных бактерий. При этом ингибирующее действие антибиотиков - наиболее часто встречающихся в молоке пред­ставителей этой группы ингибиторов - на вредную микрофлору гораздо слабее, чем на необходимую. Причинами этого являются наличие среди «дикой» микрофлоры штаммов, обладающих устойчивостью к широко­му спектру лекарственных веществ, а также устойчивостью грамотрицательных бактерий к антибиотикам, применяемым для борьбы с возбу­дителями маститов, большинство которых являются грамположительными микроорганизмами.

Str. thermophilus и Lbc. helveticus чувствительны к содержанию в молоке 0,002-0,01 ед/мл пенициллина.

Ингибирующие вещества из молока и молочных продуктов попа­дают в организм человека и могут нанести ущерб здоровью следующи­ми путями:

иммунно-патологическим - вызвать аллергию к соответст­вующим лекарственным веществам; микробиологическим - вызвать появление в кишечнике устойчивых к лекарствам штаммов болезне­творных бактерий; фармаколого-токсикологическим. При этом следует учесть, что антибиотики, например пенициллин, адсорбируются казеи­ном, поэтому их концентрация в сырах и твороге будет выше, чем в ис­ходном молоке. Наиболее опасными являются пенициллины, способные вызывать аллергию в дозах, которые встречаются в молоке. Описан случай заболевания крапивницей при потреблении молока, содержаще­го 0,4 ед/мл пенициллина.

Загрязнение молока ингибирующими веществами искажает резуль­таты редуктазной и бродильных проб и может повлиять на результаты фосфатазной и пероксидазной проб.

ГОСТ на закупаемое молоко запрещает переработку на пищевые цели молока, загрязненного ингибирующими веществами. Медико­биологическими требованиями установлены следующие ПДК для анти­биотиков в молоке: пенициллин и тетрациклиновая группа - не более 0,01 ед/г, стрептомицин - не более 0,5 ед/г.

Наибольшую опасность для потребителей и производства пред­ставляют ингибиторы, не разрушаемые тепловой обработкой молока, к которым относятся многие антибиотики. Так, активность пенициллина после выдержки молока при 85° С в течение 5 мин снижается только на 8-17%.

Учитывая громадное значение присутствия ингибиторов в молоке для технологического процесса, оганолептических показателей и безопасности сыра, в большинстве стран при их обнаружении плата за молоко в течение двух недель снижается на значительную сумму. Существует так называе­мая «телефонная премия», которой награждаются поставщики молока, со­общающие на молокозаводы о возможном наличии в поставленной ими партии молока ингибиторов (при лечении или прививках коров).