Протеолиз

Одним из основных процессов, лежащих в основе созревания гриб­ных сыров, является протеолиз. Содержание растворимого при pH 4,6 азо­та составляет более 50% в сыре Рокфор (Devoyod et al., 1968) и около 65% в Данаблю. Растворимый при pH 4,6 азот содержит большое количество низкомолекулярных пептидов; в эту фракцию вхо­дит также небелковый азот (растворимый в 12% ТХУ). Небелковый азот составляет в Данаблю около 30%, свободные аминокислоты - около 10% от общего содержания азота (Ismail & Hanson, 1972). В Камамбере из сырого молока содержание растворимого азота равнялось 35% в поверхностных и 20% во внутренних слоях. В результате интенсивного дезаминирования аминокислот 7-9% общего азота в нем находилось в виде аммиака.

Чем обширнее и глубже протеолиз, тем нежнее консистенция сыра. Зрелый Камамбер имеет неоднородную консистенцию: в наружной части очень мягкую, вплоть до полужидкой, в центральной - значительно более твердую. Если в 7-суточном возрасте твердость сыра составляла от 7 до 14 г/см², то в 28-суточном она равнялась на поверхности 2, в центре - 11 г/см². Следовательно, созревание Камамбера идет с поверхности.

Протеолиз в сырах идет под действием природных протеиназ, мо­локосвертывающих энзимов и энзимов, образуемых микрофлорой сыра. При выработке сыров из пастеризованного молока определенное коли­чество плазмина сохраняет активность. Оптимальный pH для плазмина равен 8,0, поэтому активность плазмина в грибных сырах из-за более высокого pH будет выше, чем в других сычужных сырах. И действи­тельно, в конце созревания в этих сырах несколько повышается содер­жание γ казеина - продукта гидролиза β-казеина плазмином . Од­нако, протеолиз в грибных сырах из пастеризованного молока под дей­ствием природных протеиназ слишком мал, чтобы оказать заметное влияние на созревание сыров.

Химозин принимает участие в протеолизе в грибных сырах, о чем свидетельствует обнаружение в нем пептидов, характерных для действия химозина на а-казеин. Оптимальный pH для действия химозина на казеин равен 5,0. Из рис. 8.4 видно, что при созревании pH сыра Камамбер только непродолжительное время находится в зоне, благопри­ятной для действия химозина на казеин. В сырах с развитием плесени во всей массе (Данаблю, Блю д’Овернь, Голубой) pH уже в течение первых 30 сут созревания повышается до 5,5-6,0. Таким образом, протео­литическая активность химозина по мере созревания грибных сыров должна затухать. В еще большей степени это относится к свиному пеп­сину (разд. 2.4.2). В действительности, после повышения pH за пределы 7,0 степень зрелости сыра Камамбер, оцениваемая по накоплению про­дуктов протеолиза, на какое-то время перестала увеличиваться, затем снова начала возрастать (рис. 8.6). Последнее, по-видимому, вы­звано начавшимся высвобождением внутриклеточных протеиназ плесе­ней. Общий протеолиз в грибных сырах намного выше, чем в сырах типа Гауда, хотя pH в сыре Гауда более благоприятен для протеолитического действия молокосвертывающих энзимов и протеиназ мезофильных лак­тобактерий. В твердых сырах по сравнению с грибными протеолиз более активно идет в центральных слоях, накапливается небольшое количество свободных аминокислот, ограничен катаболизм аминокислот, не образует­ся аммиак. Все это говорит о том, что основную роль в протеолизе гриб­ных сыров играет специфическая для них микрофлора.

Исследования сыра, выработанного в условиях, позволяющих кон­тролировать состав микрофлоры, показали, что в сгустке, в котором микрофлора была представлена только Р. roqueforti или Р. camemberti, после 40 дней созревания содержание растворимого при pH 4,6, небел­кового и растворимого в фосфорно-вольфрамовой кислоте азота равня­лось соответственно 50, 30 и 10% общего содержания азота. Это выше, чем в сгустке, в котором протеолитическими факторами были только плазмин и химозин.

Оба вида пенициллов обладали внутриклеточными и внеклеточ­ными протеинзами, оба синтезировали металлопротеиназу и аспартат- протеиназу, одну или несколько щелочных карбоксипептидаз, некото­рые штаммы продуцировали щелочную протеиназу. По протеолитиче­ской активности штаммы Р. roqueforti сильно отличались друг от друга, вариабельность протеолитической активности штаммов Р. camemberti была невысокой.

Оптимальный pH для действия на казеин кислой протеиназы Р. roque­forti и Р. camemberti, равен 5,5; кислая протеиназа Р. roqueforti сохраня­ла активность при pH 3,5-6,0, Р. camemberti, - при pH 3,5-5,5. Оба эн­зима атаковали а- и æ-казенны. В отличие от химозина, который в сыре атакует только а-казеин, Р. caseicolum расщепляет <?е-казеин с помощью кислой протеиназы с оптимальным pH 3,5.

Внутриклеточные протеиназы пенициллов исследованы недоста­точно. Оптимальный pH для них лежит в диапазоне 5,5-6,0 или 5,5-6,5.

В асептически приготовленном сгустке, не содержащем микрофло­ры, кислая протеиназа Р. roqueforti и металлопротеиназы Р. camemberti давали те же электрофореграммы, какие получали при исследовании сыров, что доказывает ведущую роль плесневых грибов в протеолизе в этих сырах. В асептическом сгустке кислая протеиназа Р. roquefor- п вместе с нейтральной протеиназой Р. camemberti, вызывали большое увеличение содержания растворимого при pH 4,6 азота и небольшое - количества свободных аминокислот. Неочищенные гомогенизаты мо­лочного лактококка, наоборот, незначительно увеличивают содержание растворимого при pH 4,6 азота и существенно повышают содержание свободных аминокислот.

В Камамбере действие протеиназ Р. camemberti начинает прояв­ляться на 6-7 день созревания, почти сразу после начала видимого роста плесени на поверхности сыра. Их максимальная активность наблюдает­ся в сырах 15-суточного возраста, после чего она начинает медленно снижаться. Действие энзимов проявляется в поверхностных слоях, но образующиеся в результате пептиды медленно диффундируют вглубь сыра. Внутриклеточная протеиназа, по сравнению с внеклеточной, ока­зывает незначительное влияние на протеолиз. Соль снижает активность протеолитических энзимов Р. camemberti: при 4% соли степень протео­лиза снижается до 25% по сравнению с 40% в несоленом сыре.

Благодаря синтезу нескольких экзопептидаз с различными опти­мальными значениями pH (от 3 до 8) Р. roqueforti образует широкий спектр свободных аминокислот. Р. camemberti также образует большое количество свободных аминокислот, в том числе гидрофобных, что снижает горечь гидролизатов казеина в грибных сырах.

Определенная пептидазная активность характерна для лактокок­ков, причем в грибных сырах, в которых на определенных стадиях со­зревания pH близок к нейтральному значению, оптимальному для пеп­тидаз лактококков, количество свободных аминокислот, образуемых лакгококками, выше, чем в сырах с анаэробным созреванием.

Протеолитической активностью обладают дрожжи, играющие важ­ную роль в поверхностной микрофлоре грибных сыров. Оптимальный pH для их протеолитической активности равен 6,0, при pH 4 и 7 она снижалась на 50%. По интенсивности протеолиза дрожжи близки к Р. caseicolum.

Липолиз

Масштабы липолиза в грибных сырах намного больше, чем в твер­дых: в твердых сырах липолизу подвержено не более 2% триглицери­дов, в грибных - 5-20% (табл. 8.5). При этом интенсивный липолиз может не сопровождаться появлением прогорклого вкуса, что обуслов­лено нейтрализацией жирных кислот при повышении pH. В Рок­форе количество свободных кислот равно 8-10% от общего содержания жирных кислот. В Голубом сыре содержание жирных кислот в поверх­ностных слоях бывает ниже, чем в глубинных, что вызвано ингибирова­нием липолиза на поверхности высокой концентрацией соли. Од­нако, обычно степень липолиза снижается в направлении к центру го­ловки сыра. Большинство жирных кислот высвобождается в сырах в результате липолиза. Только свободные жирные кислоты с короткой цепочкой образуются в результате сбраживания углеводов или катабо­лизма аминокислот: они составляют около 5% от общего содержания свободных жирных кислот в сыре.

Основной источник липолитических энзимов в грибных сырах - Р. го- queforti и Р. camemberti', природные липазы молока обладают низкой активностью. Может быть источником липаз G. candidum, в частности, липаза этого вида ответственна за высокое содержание олеиновой ки­слоты в Камамбере.

Р. camemberti образует одну липазу с оптимальными pH 9,0 и тем­пературой 35° С. При pH 6,0 она сохраняет 50% своей активности и ос­тается достаточно активной при 0-20° С. По количеству образуе­мой липазы штаммы Р. camemberti могут различаться в 10 раз.

Р. roqueforti образует две липазы, одна из них активна в кислой, вто­рая - в щелочной среде. Максимальная активность «кислой» липазы наблюдалась при pH 6,0-6,5, активность «щелочной» липазы при pH 6,0 составляла 20% от максимальной. Штаммы этого вида сильно различают­ся по липолитической активности. Липолиз в грибных сырах - один из основных источников ароматических веществ или их предшественников.

Ферментация молочной кислоты

Для выработки сыров типа Камамбер используют только зрелое молоко с pH 6,4 (22° Т), минимальный pH сыра равен 4,6; pH зрелого сыра лежит в интервале от 6,0 (внутренние слои) до 7,0 (поверхностные слои). Изменение pH во время созревания в грибных сырах обусловлено в первый период сбраживанием лактозы лактобактериями до кислот, а на втором этапе утилизацией кислот дрожжами и плесневыми грибами. Выделяющийся при сбраживании лактозы и молочной кислоты ССЬ образует в сырной массе пустоты, облегчающие распространение пле­сени. В начальный период во внутренних слоях Камамбера содержалось в сухом веществе 3,9% L(+)-лактата, на поверхности - 2,9%, в зрелом сыре содержалось меньше 0,02% лактатов. В сырах типа Рокфор pH повышается не столь значительно (до 6,2-6,5).

Повышение pH во время созревания грибных сыров создает более благоприятные условия для действия протеолитических и липолитиче­ских энзимов, способствует развитию микрококков и бревибактерий на поверхности сыров и тем самым ускоряет формирование специфиче­ских для этих сыров органолептических показателей. Это важнейший процесс в созревании грибных сыров. В то же время в результате ней­трализации в сыре создаются условия для развития нежелательной мик­рофлоры. Этот недостаток частично компенсируется антибиотической активностью плесневых грибов.

Формирование вкуса и аромата сыров с развитием плесневых грибов по всей массе продукта

В формировании вкуса и аромата сыров с развитием плесневых грибов по всему интерьеру ключевую роль играют метилкетоны: 2-гептанон, 2-но- нанон, в первую очередь, и 2-пентанон, 2-пропанон, 2-андеканон, 2-три- деканон. Содержание метилкетонов увеличивается в сырах до 70-су­точного возраста, затем начинает снижаться. Метилкетоны обра­зуются в результате β-окисления свободных жирных кислот плесневым грибом Р. roqueforti. Оптимальный pH для окисления жирных кислот ми­целием плесени равен 5,0-7,0. Количество образуемых в сыре метилкето­нов коррелирует с количеством высвобождающихся в результате липолиза жирных кислот. Сыры с недостаточным липолизом имеют плохо вы­раженные специфические органолептические показатели. Слишком ин­тенсивная посолка тормозит развитие Р. roqueforti, снижает скорость липолиза и уменьшает концентрацию метилкетонов в сыре.

Летучая фракция сыров этого типа включает вторичные спирты (2-пентанол, 3-гептанол и 2-нонанол), образуемые при восстановлении метилкетонов Р. roqueforti. Концентрация их ниже, чем концентра­ция метилкетонов. Кроме метилкетонов и вторичных спиртов в летучей фракции «голубых» сыров присутствуют другие спирты, альдегиды, эфиры, амины, жирные кислоты, γ лактоны.

На основе результатов исследований составных элементов аромата «голубых» сыров разработан состав и организовано производство спе­циальных добавок для использования в приготовлении салатов и произ­водстве плавленых сыров, имитирующих вкус «голубых» сыров. Готовят эту добавку путем выращивания Р. roqueforti в среде с высоким содержанием липидов.

Формирование вкуса и аромата сыров с поверхностной плесенью

Состав ароматических веществ сыров типа Камамбер очень сложен и включает первичные и вторичные спирты, метилкетоны, альдегиды, эфи­ры, фенолы, лактоны, серосодержащие соединения, анизолы, амины и др. Группы этих соединений во многом совпадают с теми, которые об­наружены в «голубых» сырах, однако по составу индивидуальных компо­нентов имеются существенные отличия. В зависимости от штамма Р. саmemberti образовывал за 4 ч инкубации от 7,9 до 44,4 мкмоль метилкетонов на г мицелия. В формировании характерного для этих сыров грибного вкуса основную роль играет 1-октен-З-ол, однако избыточное содержание его приводит к образованию пороков (Adda et al., 1973).

Серосодержащие соединения ответственны за образование харак­терного чесночного привкуса. Они образуются в результате жиз­недеятельности как Р. camemberti, так и бревибактерий, в том числе В. li­nens, рост которых в какой-то степени всегда имеет место на поверхно­сти этих сыров.

Для формирования типичного для Камамбера вкуса необходимы вы­сокие концентрации 2-фенилэтанола и более низкие концентрации 2-фенилэтилацетата и 2-фенилэтилпропионата (Jolly & Kosikowski, 1975). 2-Фенилэтанол придает сыру приятный запах подобный запаху роз, максимальная концентрация его отмечается в сыре недельного возраста. Вероятнее всего фенилэтанол образуется дрожжами из фенилаланина. Важным компонентом вкуса Камамбера является аммиак, образующийся при дезаминировании аминокислот поверхностной микрофлорой.

В формировании основного вкусового фона грибных сыров важная роль принадлежит свободным жирным кислотам, которые являются предшественниками многих ароматообразующих веществ.

Формирование консистенции грибных сыров

Сформованная сырная масса, твердая и крошливая вначале, стано­вится мягкой и нежной по мере созревания грибных сыров. Эти измене­ния являются результатом протеолиза. В предыдущих разделах показано, что в сырах с поверхностным развитием плесневых грибов наиболее сильный протеолиз происходит на поверхности, а по направлению к цен­тру головки степень протеолиза снижается. Тем не менее на поверхности сыров сохраняется тонкая, но достаточно прочная корочка. Это обуслов­лено тем, что в результате использования поверхностной микрофлорой молочной кислоты в поверхностных слоях повышается pH и создается градиент pH в головке сыра. В связи с этим Са и Р мигрируют из центра к поверхности, где образуют нерастворимый при нейтральном pH фосфат кальция. В корочке зрелого Камамбера содержится около 17 и 9 г/кг Са и неорганического Р, которые и придают ей определенную жесткость.

На размягчение консистенции влияют все факторы, расщепляющие белки, в том числе молокосвертывающие энзимы и протеиназы микро­флоры закваски, активность которых растет при повышении pH. Про­теиназы плесневых грибов в сырах типа Камамбер медленно диффун­дируют в глубину сыра и не играют существенной роли в протеолизе в глубинных слоях.

Сосредоточение 80% Са и больше 55% неорганического Р в короч­ке грибных сыров  свидетельствует о полном выходе из пара- казеиновых мицелл мицеллярного фосфата кальция (гл. 2), что должно вызвать коренные изменения в структуре казеина: параказеиновые ми­целлы, в которых мицеллярный фосфат кальция играет главную свя­зующую роль, в этих условиях не могут быть стабильными, а мицеллы, характерные для кислотного сгустка, в котором нет мицеллярного фос­фата кальция, вряд ли могут образоваться при pH грибных сыров и в присутствии достаточно высоких концентраций молокосвертывающих энзимов. Интересно, что в сгустке, из которого был удален химозин, консистенция в процессе созревания не размягчалась, оставаясь упругой и крошливой. К сожалению, форма, в которой находятся белки молока в грибных сырах, пока не выявлена.

Управление созреванием

Биохимическая активность различных штаммов плесневых грибов варьирует в широких пределах. Качество «голубых» сыров, в связи с этим, в большой степени зависит от свойств используемого для их вы­работки штамма Р. roqueforti. Выбор определяется не только свойства­ми штамма, но и видом вырабатываемого сыра. Для производства сыра Блю д’Овернь нужны, например, штаммы с высокой протеолитической и низкой липолитической активностью, сыра Фурм д'Амбер - штаммы с низкими протеолитической и липолитической активностями.

Существует тесная связь между микробиологическими и техноло­гическими факторами при формировании органолептических показате­лей сыров. Важное значение имеют температура созревания, pH, активность воды, содержание кислорода, освещение.

Во время созревания нужно следить за интенсивностью развития плесени: при недостаточном развитии специфические органолептиче­ские характеристики сыров будут слабо выражены, при излишнем раз­витии появляются пороки вкуса, аромата, консистенции. Интенсивность развития плесени в сырах типа Рокфор зависит от количества проколов в головке, содержания лейконостоков в закваске, своевременности уда­ления поверхностной слизи, которая может закрывать отверстия проко­лов. Степень и продолжительность посолки влияют на развитие Р. roque­forti, микрококков и дрожжей, протеолитическую и липолитическую активность плесени.

Штаммы Р. camemberti сильно различаются по липолитической ак­тивности и способности окислять жирные кислоты, но имеют неболь­шие отличия по протеолитической активности. При выборе штамма этого вида нужно учитывать липолитическую активность, ско­рость роста, цвет, плотность, длину мицелия, от которых зависит внеш­ний вид сыров.

Интенсивность посолки сыров с поверхностной плесенью должна быть такой, чтобы подавить рост G. candidum без угнетения роста Р. са- memberti (концентрация соли в водной фазе должна быть выше 6, но ниже 10% (табл. 8.1)). Недосол, особенно в сочетании с повышенной влажностью, приводит к слишком быстрому росту G. candidum и замед­лению роста Р. camemberti и, в конечном счете, к появлению порока, называемого «жабья шкура» Недосол создает условия для роста Мисог, в результате которого изменяется внешний вид сыров; этот по­рок называют «кошачья шерсть». Для предотвращения порока исполь­зуют быстрорастущие штаммы Р. camemberti. Посолкой сыра можно ограничивать протеолиз в сыре.

Специфическим требованием к молоку в производстве сыров, со­зревающих с участием Р. camemberti, является низкое содержание псих- ротрофных бактерий, липазы которых могут усилить липолиз в сырах и вызвать появление прогорклого, нечистого вкуса.

 Для предотвращения размножения нежелательных бактерий в грибных сырах необходимо ускорить снижение pH в сыре, желательно, до 4,5-4,6, чего можно достичь использованием зрелого молока, доста­точно высоких доз закваски. При этом pH прекращается раз­множение бактерий, представляющих угрозу качеству сыра, а в процес­се созревания большая часть их клеток гибнет. Некоторые из них, в ча­стности Hafnia alvei, Listeria monocytogenes, могут в сырах размножать­ся после повышения pH (разд. 8.3.2). Для предупреждения их развития сыры следует вырабатывать только из пастеризованного моло­ка со строгим соблюдением гигиенических требований. Выработка сыра Камамбер в хороших гигиенических условиях снижает содержание ко- лиформ на его поверхности до 10²-1(Г КОЕ/г.

Хорошие результаты по предотвращению роста L. monocytogenes дает включение в состав заквасок низинообразующих штаммов лакто­кокков.