Энзимы, образуемые микрофлорой в сыром молоке, могут участ­вовать в созревании сыра, вырабатываемого из пастеризованного моло­ка, если они сохранят часть активности после тепловой обработки. К таким энзимам относят протеазы и липазы, образуемые психротрофами (разд. 6.7). Среди психротрофов сырого молока доминируют псев­домонады. 94% выделенных из молока псевдомонад обладали протео­литической и липолитической активностями, в т. ч. 23,4% в сильно вы­раженной, 29,4% - в слабо выраженной формах. 60% псевдомо­над разжижали желатин. Сильные протеолиты и липолиты име­ются среди психротрофов других родов и видов бактерий. Так, среди психротрофных штаммов Ent. cloacae протеолитической и липолитиче­ской активностью обладали соответственно 37 и 19, Serratia marcescens- 0 и 67, Kl. oxitocae - 15 и 8% штаммов.

В сыром молоке достаточное количество термостойких липаз и протеиназ образуется при наличии более 10⁶ КОЕ/мл психротрофов. Такое молоко не следует использовать для выработки сыров с созрева­нием, однако психротрофы обладают низкой редуцирующей способно­стью и плохо выявляются редуктазной пробой, что затрудняет своевре­менное выявление молока, содержащего большое количество этих бак­терий. Содержание психротрофов в сборном молоке может воз­расти во время его резервирования на заводе, поскольку температуры резервирования молока не препятствуют их размножению.

В культуральной среде Ps. fluorescens и Ps. aeruginosa максималь­ное количество протеиназ и липаз образуется при 20 и 30° С соответст­венно. С понижением температуры общее содержание этих энзи­мов в среде уменьшается, а в пересчете на единицу сухой биомассы уве­личивается; при температуре 2° С синтез протеиназ и липаз прекращает­ся или происходит с очень низкой скоростью. При 4° С синтез протеиназ и липаз Ps. fluorescens на ед. клеточной массы был на 25% выше, чем при 10° С. Липолитическая активность псевдомонад наиболее сильно проявляется при 5° С. Оптимальный pH для синтеза протеиназ и липаз псевдомонадами лежит в интервале 6,8-7,4; в отсутствие аэрации они начинают синтезировать внеклеточные протеиназы и липазы при более низкой концентрации клеток в среде.

Большинство нейтральных и щелочных протеиназ псевдомонад от­носится к классу металлопротеиназ, нуждающихся в дивалентных ка­тионах (Со²⁺, Са²⁺); при гидролизе белков они образуют гидрофобные пептиды, обладающие горьким вкусом. Следующие оптимальные параметры были получены для действия протеолитических систем Ps. fluorescens: температура 46-48° С, pH 7,5-7,9. Со²⁺(25 ммоль) повышал их активность в 11—12 раз, Са²⁺ оказывал небольшое стимулирующее дей­ствие, Zn²⁺и Hg²⁺снижали активность на 40%. В характерных для сыров условиях они сохраняют высокую активность. Протеиназы раз­личных штаммов псевдомонад мало отличались по типу расщепляемых связей, но сильно отличались по активности.

Псевдомонады расщепляют все казенны: один штамм Ps. fluorescens за 2 сут при 5° С расщепил 60% æ-, 39% β- и 23% а₅₁-казеина. В табл. 11.2 показано действие психротрофов на фракции казеина.

При длительном культивировании начинается автолиз клеток псевдо­монад и в среду выделяются внутриклеточные протеиназы. Данных о тер­моустойчивости внутриклеточных протеолитических энзимов псевдомонад и возможности их участия в созревании сыров обнаружить не удалось.

Gobletti et al. доказали, что очищенная аминопептидаза из Ps. fluo­rescens расщепляет синтетические горькие пептиды (не все) и горькие пептиды энзиматического гидролизата молока, пастеризованного при ультравысоких температурах. Специфический профиль пептидных связей аминопетидазы, включающий аминокислоты Лей, Трп, Вал - главные компоненты горьких пептидов, доказывает ее «антигорькую» направленность. В итальянском мягком сыре Качиотта активность ами- нопептидазы сохраняется в течение 2-х мес.

Ps. fluorescens образует фосфолипазы, катализирующие гидролиз фосфолипидов - компонентов оболочки жировых шариков; в результате гидролиза разрушаются оболочки жировых шариков, и мо­лочный жир становится более чувствительным к химическому окисле­нию и действию липаз.

Уникальным свойством протеиназ и липаз психротрофов является их необычайно высокая термоустойчивость. Они не инактивируются пастеризацией молока при 77° С в течение 17 с и 140° С в течение 5 с; Д_90°С протеиназы Ps. fluorescens равнялось 110 мин. При 135° С Д-значение протеиназ психротрофов было в 10 раз выше, чем Д-значение спор В. stearothermophilus, отличающиеся особо высокой термоустой­чивостью. Однако 20-минутная выдержка при 55 и 60° С снижает активность протеиназ психротрофов на 44 и 47%. При 45° С они полно­стью инактивируются за 30 мин. Если при 45-60° С протеиназы психротрофов инактивируются, то при температуре 65° С и выше они становятся термоустойчивыми. Липаза Ps. fluorescens полно­стью или частично инактивировалась при 65° С. Инактивацию протеиназ при относительно низких температурах объясняют их автолизом, устойчивость при высоких температурах - конформационными изменениями белка.

Поскольку протеиназы и липазы психротрофов пастеризацией моло­ка не инактивируются, можно ожидать, что сыры, выработанные из моло­ка с высоким уровнем развития психротрофов, будут низкого качества. В сыре Чеддер, выработанном из молока с наличием более 10⁷ КОЕ/мл психротрофов, количество свободных жирных кислот было в 3-10 раз вы­ше, чем в сырах из молока с низким содержанием психротрофов; в 4-ме­сячных опытных сырах появился прогорклый вкус. Прогорклый вкус сыров как следствие развития псевдомонад в сыром молоке встречается чаще, чем пороки, связанные с протеиназами психротрофов, хотя в опытах используют штаммы псевдомонад с невысокой липолитической активно­стью; связано это с низким вкусовым порогом продуктов липолиза.

Голландский сыр, выработанный из молока с 10⁶ КОЕ/мл психро­трофов, в зрелом возрасте получил оценку на 1 балл ниже, чем кон­трольный сыр, а опытный сыр из молока с 510⁶ КОЕ/мл - на 3 балла ниже. Небольшая разница в оценке обусловлена коротким перио­дом созревания этого сыра (45 сут), во время которого результаты дея­тельности энзимов психротрофов не успевают проявиться в полной мере. Зрелые сыры хранили при 1 и 8° С в течение 3-х мес: после хранения при 1° С качество опытных сыров было ниже, чем контрольных, на 1-2 бал­ла, при 8° С - на 3-6 баллов.

Сыры Камамбер, выработанные из молока, хранившегося 9 дней при 5° С, имели горький и прогорклый вкус, не имели аммиачного запа­ха, содержали больше свободных жирных кислот, чем сыры, вырабо­танные из этого же молока после 2-суточного хранения при 5° С.