2.5.1. Производство исходного сырья

Что касается этилового спирта как топлива, то почти все су­ществующие способы его производства основаны на переработ­ке мелассы, сока сахарного тростника, кукурузного крахмала или же в меньшей мере маниока. Сбраживание — это лишь одна из стадий процесса; помимо него сюда относятся выращивание растений, их уборка, перевозка на заводы, приготовление сусла, сбраживание, перегонка, обезвоживание, денатурация, изготов­ление смесей и реализация продукции. Кроме того, приходится решать вопрос об удалении или переработке жидких отходов (кубовых остатков). Понятно, что рассказать обо всем этом подробно здесь невозможно, и поэтому мы обратим внимание лишь на те стороны проблемы, которые важны в плане техниче­ской осуществимости, баланса энергии и экономики, но в то же время касаются и микробиологических аспектов работы этой си­стемы, которые могут быть улучшены биотехнологическим пу­тем. Их можно разделить на две группы. Первая связана с при­родой сырья, в котором должно содержаться нужное количест­во сбраживаемого сахара, получаемого дешевым способом и при малых энергозатратах, а вторая — с отгонкой спирта. В этом последнем случае можно уменьшить затраты (как энергетиче­ские, так и экономические), если повысить концентрацию спир­та в продукте ферментации.

При получении этилового спирта из сахар-содержащих куль­тур отжим содержащего сахар сока ведется стандартными спо­собами. Простые сахара из сахарного тростника можно полу­чить механическим отжимом сока, а в случае сахарной свек­лы— диффузионным методом. Крахмалистое сырье нужно ме­ханически измельчить до консистенции жидкого теста, а затем нагреть для разрушения крахмальных зерен. Далее можно при­менить различные варианты гидролиза, основанного на исполь­зовании разных сочетаний кислот и/или применении ферментов. Обычно для разжижения исходного продукта применяют термо­фильную (90 ⁰C) бактериальную амилазу. На следующем этапе для осахаривания при 50—60 ⁰C (т. е. гидролиза декстринов до глюкозы) используют глюкоамилазу. В пересчете на образовав­шуюся глюкозу выход составляет 51% (по массе). Однако, по­скольку около 5% сахара расходуется растущими клетками на энергетические нужды, а также на синтез других органических соединений (глицерола, уксусной кислоты, ацетальдегида и ряда других соединений, в основном высших спиртов), предельный выход составляет около 48% в пересчете на исходный сахар. Весовой выход продукта зависит также от природы сырья:

• 1 кг инвертированного   сахара  —   0,484 кг этилового спирта    = 0,61 л,
• 2 кг сахарозы                                =   0.510 кг этилового спирта    = 0,65 л,
• 3 кг крахмала                                =   0,530 кг этилового спирта    = 0,68 л.

Эти различия обусловлены тем, что в реакции гидролиза олигосахаридов и более высокомолекулярных соединений участ­вует вода.

При малотоннажном производстве степень очистки исходно­го сырья, получаемого, например, из кукурузы, может быть очень небольшой. C другой стороны, на более крупных заводах использование обычного метода мокрого помола, который при­меняется при производстве высококачественного сиропа из глю­козы, дает то преимущество, что при этом удается получить ряд ценных побочных продуктов, например кукурузное масло и глютен. Доходы от их продажи позволяют снизить реальные затраты на производство спирта. Даже при маломасштабном производстве на основе цельного зерна твердые остатки и дрож­жи имеют цену как корм для скота. В зависимости от исходного сырья содержание сахара в сбраживаемом продукте варьирует, но на практике, чтобы получить достаточно высокую концентра­цию спирта в сусле, содержание обеспечивающих брожение твердых веществ должно быть в пределах 16—25%. Это важно, поскольку потребление пара в обычных системах для перегонки при производстве 96%-ного спирта из 5%-ного сусла вдвое больше, чем из 10%-ного.

В настоящее время главные сложности, связанные с произ­водством спирта как горючего, связаны с тем, что сырье для этого процесса является одновременно и сырьем для производ­ства пищевых продуктов и кормов. Из-за этой конкуренции стоимость сырья весьма высока. В зависимости от типа сырья 60—85% конечной продажной цены получаемого сегодня спир­та составляет стоимость сырья. Отметим далее, что, за исклю­чением спиртовых заводов, перерабатывающих сахарный трост­ник, на которых волокнистая часть стеблей (багасса) использу­ется как топливо, в широко распространенных процессах полу­чения спирта тратится больше энергии, чем ее содержится в по­лучаемом продукте. Эти проблемы можно будет решить, если в качестве исходного сырья будет использоваться целлюлоза и удастся разработать новый энергетически более выгодный ме­тод выработки спирта.

Сложность использования целлюлозы заключается в том, что в природном состоянии в клеточных стенках растений она на­ходится в составе нерастворимого комплекса с гемицеллюлоза­ми и лигнином. Кроме того, за счет образования водородных связей отдельные молекулы целлюлозы определенным образом ориентируются относительно друг друга и образуют микрофиб­риллы, которые в какой-то мере подобны кристаллам, что препят­ствует действию гидролитических агентов. Даже после исчерпы­вающего гидролиза веществ растительных клеток дрожжи, кото­рые обычно используются при получении спирта, неспособны усваивать пятиуглеродные сахара, уроновые кислоты и феноль­ные соединения, образующиеся из сопутствующих целлюлозе веществ клеточных стенок растений.

Чтобы решить эту проблему, работа ведется в нескольких направлениях. При создании одних методов ставится цель по­лучить глюкозный сироп, и основное внимание уделяется гидро­лизу целлюлозы. В других случаях предпринимаются попытки разрушить ферментами возможно большую часть лигноцеллюло­зы— либо после разделения клеточных компонентов химически­ми методами, либо с помощью бактерий, способных непосредст­венно атаковать как целлюлозу, так и гемицеллюлозу. Размол — наиболее эффективный физический способ предварительной под­готовки сырья, но он дорог и энергоемок. Высказывались пред­положения, что размол в замороженном состоянии обойдется Дешевле.

Для делигнификации можно использовать химическую обра­ботку такими веществами, как едкий натр, надуксусная кислота или гипохлорит натрия. Под действием щелочи волокна набу­хают и разделяются. Гидролиз ведут либо минеральными кис­лотами, либо биологическими методами. В последнем случае используют гидролизующие целлюлозу ферменты грибов, напри­мер Trichoderma, Aspergillus либо Sporotrichum. После отделе­ния целлюлозы и гемицеллюлозы для сбраживания глюкозы в спирт можно использовать дрожжи. Если для сбраживания ис­пользуют бактерии, например Klebsiella или Aeromonas, то из пентоз можно получить бутанол. Другая возможность заключа­ется в том, что лигноцеллюлозу используют как субстрат для бактерий Clostridium thermocellum.

Типичный процесс производства глюкозы из целлюлозы включает механическую первичную обработку, размягчение па­ром или химическую делигнификацию. Для осуществления всех этих операций нужна энергия. При использовании химических методов возникают сложности, связанные с коррозией и нейтра­лизацией стоков. Процессы, основанные на использовании рас­творителей, нередко дорогостоящи: приходится регенерировать растворитель. Что касается свойств продукта, определяющих саму возможность действия на него ферментов, то к ним отно­сятся степень кристалличности, лигнификации и размер частиц.

Наиболее хорошо изучена смесь целлюлоз, образуемых Trichoderma υiride и Т. reesei. Детально исследована кинетика их действия. Получены мутантные штаммы, или разновидности (например, штамм С-30), обладающие высокой активностью. Выяснено, что смесь целлюлаз Т. reesei включает три компонен­та: э«до-фермент (фракция C_x), который атакует субстрат бес­системно, экзо- 1,4-глюканазу (фракция Ci), в результате дей­ствия которой образуется целлобиоза, и 1,4-глюкозидазу, кото­рая превращает целлобиозу в глюкозу. Обычно содержание глю­козидазы в смеси невелико и его приходится увеличивать, до­бавляя ферменты других грибов, например Aspergillus. От них несколько отличается фермент возбудителей бурой гнили: эти грибы способны образовывать H₂O₂, в результате чего процес­сы первичного разрушения идут быстрее.

При использовании таких ферментных смесей возникают сложности, связанные с тем, что и активность ферментов, и их образование ингибируются конечным продуктом катализируе­мой реакции. Так, 0,01%-ный раствор целлобиозы ингибирует активность целлюлазы на 75%. Есть надежда, что путем моди­фикации активности фермента, его регуляции и синтеза с по­мощью мутагенеза, селекции и методов рекомбинантных ДНК удастся получать более активные и стабильные ферментные пре­параты, в меньшей степени ингибируемые конечным продуктом. Было проведено изучение многих других организмов в плане возможного их использования для разрушения лигноцеллюлозы. Некоторые из них перечислены в табл. 2.9. Лигнин деградиру­ют некоторые штаммы Erwinia, а также дрожжи Trichospora fermentans; ряд грибов, относящихся к числу хорошо известных родов Mucor, Penicillium, Trichoderma и Aspergillus, образуют активную ксиланазу.

Что касается этилового спирта как топлива, то почти все су­ществующие способы его производства основаны на переработ­ке мелассы, сока сахарного тростника, кукурузного крахмала или же в меньшей мере маниока. Сбраживание — это лишь одна из стадий процесса; помимо него сюда относятся выращивание растений, их уборка, перевозка на заводы, приготовление сусла, сбраживание, перегонка, обезвоживание, денатурация, изготов­ление смесей и реализация продукции. Кроме того, приходится решать вопрос об удалении или переработке жидких отходов (кубовых остатков). Понятно, что рассказать обо всем этом подробно здесь невозможно, и поэтому мы обратим внимание лишь на те стороны проблемы, которые важны в плане техниче­ской осуществимости, баланса энергии и экономики, но в то же время касаются и микробиологических аспектов работы этой си­стемы, которые могут быть улучшены биотехнологическим пу­тем. Их можно разделить на две группы. Первая связана с при­родой сырья, в котором должно содержаться нужное количест­во сбраживаемого сахара, получаемого дешевым способом и при малых энергозатратах, а вторая — с отгонкой спирта. В этом последнем случае можно уменьшить затраты (как энергетиче­ские, так и экономические), если повысить концентрацию спир­та в продукте ферментации.

При получении этилового спирта из сахар-содержащих куль­тур отжим содержащего сахар сока ведется стандартными спо­собами. Простые сахара из сахарного тростника можно полу­чить механическим отжимом сока, а в случае сахарной свек­лы— диффузионным методом. Крахмалистое сырье нужно ме­ханически измельчить до консистенции жидкого теста, а затем нагреть для разрушения крахмальных зерен. Далее можно при­менить различные варианты гидролиза, основанного на исполь­зовании разных сочетаний кислот и/или применении ферментов. Обычно для разжижения исходного продукта применяют термо­фильную (90 ⁰C) бактериальную амилазу. На следующем этапе для осахаривания при 50—60 ⁰C (т. е. гидролиза декстринов до глюкозы) используют глюкоамилазу. В пересчете на образовав­шуюся глюкозу выход составляет 51% (по массе). Однако, по­скольку около 5% сахара расходуется растущими клетками на энергетические нужды, а также на синтез других органических соединений (глицерола, уксусной кислоты, ацетальдегида и ряда других соединений, в основном высших спиртов), предельный выход составляет около 48% в пересчете на исходный сахар. Весовой выход продукта зависит также от природы сырья:

• 1 кг инвертированного   сахара  —   0,484 кг этилового спирта    = 0,61 л,
• 2 кг сахарозы                                =   0.510 кг этилового спирта    = 0,65 л,
• 3 кг крахмала                                =   0,530 кг этилового спирта    = 0,68 л.

Эти различия обусловлены тем, что в реакции гидролиза олигосахаридов и более высокомолекулярных соединений участ­вует вода.

При малотоннажном производстве степень очистки исходно­го сырья, получаемого, например, из кукурузы, может быть очень небольшой. C другой стороны, на более крупных заводах использование обычного метода мокрого помола, который при­меняется при производстве высококачественного сиропа из глю­козы, дает то преимущество, что при этом удается получить ряд ценных побочных продуктов, например кукурузное масло и глютен. Доходы от их продажи позволяют снизить реальные затраты на производство спирта. Даже при маломасштабном производстве на основе цельного зерна твердые остатки и дрож­жи имеют цену как корм для скота. В зависимости от исходного сырья содержание сахара в сбраживаемом продукте варьирует, но на практике, чтобы получить достаточно высокую концентра­цию спирта в сусле, содержание обеспечивающих брожение твердых веществ должно быть в пределах 16—25%. Это важно, поскольку потребление пара в обычных системах для перегонки при производстве 96%-ного спирта из 5%-ного сусла вдвое больше, чем из 10%-ного.

В настоящее время главные сложности, связанные с произ­водством спирта как горючего, связаны с тем, что сырье для этого процесса является одновременно и сырьем для производ­ства пищевых продуктов и кормов. Из-за этой конкуренции стоимость сырья весьма высока. В зависимости от типа сырья 60—85% конечной продажной цены получаемого сегодня спир­та составляет стоимость сырья. Отметим далее, что, за исклю­чением спиртовых заводов, перерабатывающих сахарный трост­ник, на которых волокнистая часть стеблей (багасса) использу­ется как топливо, в широко распространенных процессах полу­чения спирта тратится больше энергии, чем ее содержится в по­лучаемом продукте. Эти проблемы можно будет решить, если в качестве исходного сырья будет использоваться целлюлоза и удастся разработать новый энергетически более выгодный ме­тод выработки спирта.

Сложность использования целлюлозы заключается в том, что в природном состоянии в клеточных стенках растений она на­ходится в составе нерастворимого комплекса с гемицеллюлоза­ми и лигнином. Кроме того, за счет образования водородных связей отдельные молекулы целлюлозы определенным образом ориентируются относительно друг друга и образуют микрофиб­риллы, которые в какой-то мере подобны кристаллам, что препят­ствует действию гидролитических агентов. Даже после исчерпы­вающего гидролиза веществ растительных клеток дрожжи, кото­рые обычно используются при получении спирта, неспособны усваивать пятиуглеродные сахара, уроновые кислоты и феноль­ные соединения, образующиеся из сопутствующих целлюлозе веществ клеточных стенок растений.

Чтобы решить эту проблему, работа ведется в нескольких направлениях. При создании одних методов ставится цель по­лучить глюкозный сироп, и основное внимание уделяется гидро­лизу целлюлозы. В других случаях предпринимаются попытки разрушить ферментами возможно большую часть лигноцеллюло­зы— либо после разделения клеточных компонентов химически­ми методами, либо с помощью бактерий, способных непосредст­венно атаковать как целлюлозу, так и гемицеллюлозу. Размол — наиболее эффективный физический способ предварительной под­готовки сырья, но он дорог и энергоемок. Высказывались пред­положения, что размол в замороженном состоянии обойдется Дешевле.

Для делигнификации можно использовать химическую обра­ботку такими веществами, как едкий натр, надуксусная кислота или гипохлорит натрия. Под действием щелочи волокна набу­хают и разделяются. Гидролиз ведут либо минеральными кис­лотами, либо биологическими методами. В последнем случае используют гидролизующие целлюлозу ферменты грибов, напри­мер Trichoderma, Aspergillus либо Sporotrichum. После отделе­ния целлюлозы и гемицеллюлозы для сбраживания глюкозы в спирт можно использовать дрожжи. Если для сбраживания ис­пользуют бактерии, например Klebsiella или Aeromonas, то из пентоз можно получить бутанол. Другая возможность заключа­ется в том, что лигноцеллюлозу используют как субстрат для бактерий Clostridium thermocellum.

Типичный процесс производства глюкозы из целлюлозы включает механическую первичную обработку, размягчение па­ром или химическую делигнификацию. Для осуществления всех этих операций нужна энергия. При использовании химических методов возникают сложности, связанные с коррозией и нейтра­лизацией стоков. Процессы, основанные на использовании рас­творителей, нередко дорогостоящи: приходится регенерировать растворитель. Что касается свойств продукта, определяющих саму возможность действия на него ферментов, то к ним отно­сятся степень кристалличности, лигнификации и размер частиц.

Наиболее хорошо изучена смесь целлюлоз, образуемых Trichoderma υiride и Т. reesei. Детально исследована кинетика их действия. Получены мутантные штаммы, или разновидности (например, штамм С-30), обладающие высокой активностью. Выяснено, что смесь целлюлаз Т. reesei включает три компонен­та: э«до-фермент (фракция C_x), который атакует субстрат бес­системно, экзо- 1,4-глюканазу (фракция Ci), в результате дей­ствия которой образуется целлобиоза, и 1,4-глюкозидазу, кото­рая превращает целлобиозу в глюкозу. Обычно содержание глю­козидазы в смеси невелико и его приходится увеличивать, до­бавляя ферменты других грибов, например Aspergillus. От них несколько отличается фермент возбудителей бурой гнили: эти грибы способны образовывать H₂O₂, в результате чего процес­сы первичного разрушения идут быстрее.

При использовании таких ферментных смесей возникают сложности, связанные с тем, что и активность ферментов, и их образование ингибируются конечным продуктом катализируе­мой реакции. Так, 0,01%-ный раствор целлобиозы ингибирует активность целлюлазы на 75%. Есть надежда, что путем моди­фикации активности фермента, его регуляции и синтеза с по­мощью мутагенеза, селекции и методов рекомбинантных ДНК удастся получать более активные и стабильные ферментные пре­параты, в меньшей степени ингибируемые конечным продуктом. Было проведено изучение многих других организмов в плане возможного их использования для разрушения лигноцеллюлозы. Некоторые из них перечислены в табл. 2.9. Лигнин деградиру­ют некоторые штаммы Erwinia, а также дрожжи Trichospora fermentans; ряд грибов, относящихся к числу хорошо известных родов Mucor, Penicillium, Trichoderma и Aspergillus, образуют активную ксиланазу.

Таблица 2.9. Микроорганизмы, изученные в плане их использования для расщепления лигноцеллюлозы

Целлюлоза и целлюлазы Trichoderma Viride Т. reesei Т. koningii Coniphora Cerebella Sporotrichum ρulυerulentum Polyporus adustus Myrothesium Verrucaria Penicillium funiculosum Fusarium solani Aspergillus wentii Coniphora thermophila Thielavia ter rest ris Phanaerochaete Chrysosporium Clostridium Ihermohydrosulfuricum Clostridium thermocellum Clostridium Ihermosaccharolyticum Thermomonospora spp.

Ксиланаза

Chaetomum trilaterale

Глюкозидаза

Aspergillus phoenicus

Лигназа

Erwinia spp.

Trichospora fermentans