3.1.1.   Производство алкогольных напитков

Получение напитков путем спиртового брожения — одно из древнейших бродильных производств. Первыми из таких напит­ков были, видимо, вино и пиво. До появления работ Пастера в конце XIX в. о сути протекающих при брожении процессов и их механизмах было известно очень мало. Пастер показал, что брожение без доступа воздуха осуществляется живыми клет­ками дрожжей, при этом сахар превращается в спирт и угле­кислый газ. Тогда же было показано, что брожение осуществ­ляется под действием каких-то веществ, находящихся внутри дрожжевых клеток. Одно из главных нововведений в области микробиологии брожения было предложено Хансеном, работав­шим в исследовательском центре Карлсберг в Копенгагене с дрожжами дикого типа. При производстве пива эти дрожжи доставляли массу неудобств. Хансен выделил чистые культуры дрожжей и использовал их в пивоварении; тем самым он стал  пионером применения таких культур при производстве пива.

Рис. 3.1. Стадии гидролиза крахмала.

Алкогольные напитки получают путем сбраживания сахар­содержащего сырья, в результате которого образуются спирт и углекислый газ. Сбраживание осуществляется дрожжами рода Saccharomyces. В одних случаях используется природный сахар (например, содержащийся в винограде, из которого де­лают вино), в других сахара получают из крахмала (например, при переработке зерновых культур в пивоварении). Наличие свободных сахаров обязательно для спиртового брожения при участии Saccharomyces, так как эти виды дрожжей не могут гидролизовать полисахариды. Образование этилового спирта из  глюкозы происходит по схеме Эмбдена — Мейергофа — Парна­са, представленной на рис. 3.2.

В производстве спиртных напитков применяют штаммы Дрожжей Saccharomyces Cerevisiae или S. Carlsbergensis. Раз- _k личие между ними заключается в том, что S. Carlsbergensis мо­гут полностью сбраживать раффинозу, a S. Cerevisiae к этому не способны.

Рис. 3.2. Реакции метаболического пути Эмбдена—Мейергофа—Парнаса.

3.4.2. Пиво

Для осуществления спиртового брожения прежде всего необхо­димо, чтобы в пивоваренном сырье образовался сахар. Тради­ционным источником нужных для этого полисахаридов всегда был ячмень, но в качестве дополнительных используются и дру­гие виды углевод-содержащего сырья. И сегодня ячменный со­лод составляет основу пива. Ячменный солод и другие компо­ненты измельчают и смешивают с водой при температуре до 67 ^oC. В ходе перемешивания природные ферменты ячменного солода разрушают углеводы зерна. На заключительной стадии раствор, называемый суслом, отделяют от нерастворимых остат­ков. Добавив хмель, его кипятят в медных котлах. Для произ­водства пива с определенным содержанием алкоголя сусло по­сле кипячения доводят до нужной плотности. Удельная плот­ность сусла определяется содержанием экстрагированных саха­ров, подлежащих сбраживанию. По истечении определенного времени брожение заканчивается, дрожжи отделяют от пива и выдерживают его некоторое время для созревания. После фильтрации и других необходимых процедур пиво готово. Схе­ма производственного процесса дана на рис. 3.3.

Начатое по инициативе Хансена использование индивиду­альных штаммов дрожжей в пивоварении сегодня стало нормой: это культуры S. cereυisiae и S. Carlsbergensis. Первые представ­ляют собой дрожжи поверхностного и глубинного брожения: они применяются в производстве эля. Вторые — дрожжи глу­бинного брожения, их используют в производстве легкого пива.

Хотя генетика дрожжей развивается уже в течение многих лет, мы лишь недавно научились осуществлять селекцию дрож­жей, используемых в производстве пива. По мере углубления наших знаний о свойствах дрожжей и тех качествах, которые они придают конечному продукту, все успешнее идет работа по выведению новых штаммов пивных дрожжей. В конечном счете мы сможем создать штамм, позволяющий получить идеальный продукт. Требования к таким идеальным дрожжам будут, ес­тественно, зависеть от способа сбраживания и желаемых ка­честв пива. К числу наиболее важных свойств относятся про­дуктивность, способность формировать осадок, сбраживать мальтотриозу и т. д. Принимаются во внимание и вкусовые ка­чества получающегося пива, т. е. образование веществ, ответст­венных за их формирование. Ранее основным способом получе­ния штаммов, дающих продукт нужного качества, был их отбор из существующих пивных дрожжей. Вести отбор было выгоднее, чем заниматься гибридизацией, отчасти из-за малой способно­сти пивных дрожжей к спорообразованию и низкой жизнеспо­собности аскоспор. В каждом аске образуется от одной до че­тырех спор, но не все они освобождаются при созревании. Дрожжи из рода Sacharomyces размножаются в основном веге­тативно. При этом за счет множественного латерального почко­вания формируются сферические, эллипсоидные или реже ци­линдрические дочерние клетки. Поскольку для развития техно­логии пивоварения могут понадобиться штаммы дрожжей, от­личающиеся по свойствам от обычно используемых, придется прибегнуть к гибридизации. Основным вкладом биотехнологии в пивоваренную промышленность будет создание штаммов Дрожжей, способных давать пиво с желаемыми свойствами.

Рис. 3.3. Операции, лежащие в основе пивоварения (с любезного разрешения д-ра Анны М. Мак-Леод).

3.4.3.   Вино

Необходимое условие любого спиртового бродильного процес­са — наличие сахара в сырье. Так, в производстве вина исполь­зуется сахар виноградного сока. Почти все вино в мире делают из винограда одного вида, Vitis vinifera. Сок этого винограда — прекрасное сырье для производства вина. Он богат питательны­ми веществами, служит источником образования приятных за­паха и вкуса, содержит много сахара; его природная кислот­ность подавляет рост нежелательных микроорганизмов.

Виноделие в отличие от пивоварения до самого последнего времени было основано на использовании диких местных дрож­жей. Единственная обработка, которой подвергали виноград до отжима, — окуривание его сернистым газом, чтобы сок не тем­нел. Кроме того, сернистый газ подавляет деятельность не-вин- ных дрожжей; это позволяет винным дрожжам, которые менее чувствительны к нему, осуществлять брожение без помех. При изготовлении красного вина гребни, косточки и кожица до кон­ца брожения находятся в виноградном сусле (мусте), а белое вино делают из чистого сока. Обычно окуривание сернистым газом проводят до того, как раздавливают ягоды, но иногда его добавляют и на более поздних стадиях.

В табл. 3.5 перечислены виды дрожжей, наиболее часто встречающиеся на кожице виноградных ягод. В прошлом имен­но эти дикие дрожжи и осуществляли спиртовое брожение. Сегодня в тех районах, где виноделием начали заниматься не­давно, широко применяются дрожжевые закваски. Связано это с тем, что желаемая микрофлора может и отсутствовать, а ино­куляция стандартной культурой дрожжей позволяет получать вина с нужными свойствами. Кроме того, количество используе­мого сернистого газа ограничено законом, и это побуждает при­менять дрожжевые культуры-закваски. Виноделы не очень-то полагаются на дрожжи дикого типа, если нет уверенности, что конкуренция со стороны не-винных дрожжей не подавлена. Использование заквасок дает ряд преимуществ: сокращается лаг-период размножения дрожжей, образуется продукт с извест­ными свойствами, уменьшается вероятность появления нежела­тельного вкуса, поскольку в брожении не участвуют дикие не­винные дрожжи. В будущем использование специально создан­ных штаммов будет все более расширяться: это гарантирует необходимые вкусовые качества вин. Смешанные закваски по­зволяют получать продукцию с полным букетом, что невозмож­но при работе с индивидуальными штаммами.

Вкусовые различия между сортами винограда определяются особыми веществами. Так, в формировании вкуса мускатных сортов участвуют производные терпенов, линалоол и гераниол.

Таблица 3.5. Дрожжи, обитающие на винограде, а также в виноградном сусле и вине (Kunkee, Goswell, см. Rose, 1977)

Различные вкусовые оттенки появляются при выдержке вина; хорошо известно, что свой вклад вносит взаимодействие с древесиной и воздухом при хранении в деревянных бочках.

После завершения спиртового брожения молодое вино хра­нят в особых условиях, чтобы оно не испортилось. Если вино не предполагается подвергать яблочно-молочнокислому дображиванию, его обрабатывают сернистым газом, что подавляет окис­лительные процессы, вызывающие его потемнение. До этого из вина удаляют дрожжи, чтобы прекратить брожение.

Первосортные вина подвергают выдержке разного рода в за­висимости от типа вина, а более дешевые разливают, как пра­вило, в тот же год, когда они получены. Трудности при выра­ботке дешевых вин обычно связаны с их склонностью к вторич­ному, яблочно-молочнокислому брожению, которое развивается ко времени разлива. Если вино склонно к такому брожению, его искусственно вызывают до разлива, а если нет, то подавля­ют. При производстве первосортных красных вин такое броже­ние даже желательно. Оно составляет естественную часть про­цесса и происходит при хранении. Этот тип брожения осуществ­ляется молочнокислыми бактериями, в частности Leuconostoc, Lactobacillus и Pedicoccus. Оно не идет при низких значениях pH; создав такие условия, его можно подавить. В белых винах яблочно-молочнокислое брожение происходит реже, так как pH в них ниже. Среди новшеств в этой области упомянем исполь­зование для инициации брожения вместо бактерий иммобили­зованных ферментов.

Некоторые особые сорта вин, например сотерны, получают при участии гриба Botrytis cinerea. Его развитие на ягодах при­водит к их обезвоживанию и повышению содержания сахара, что и определяет сладкий вкус вина. Заражение должно проис­ходить только перед сбором винограда. Представляет интерес и еще один процесс, называемый углекислотной мацерацией. Красные вина, которые должны созреть к 15 ноября в год сбора винограда, получают особым способом. Виноград не давят, а помещают целиком в бродильные чаны, где держат в атмо­сфере углекислого газа. Брожение идет либо прямо в ягодах, в анаэробных условиях, либо в соке, выделяющемся в резуль­тате разрушения кожицы углекислым газом. Микробиология этого процесса пока не исследована.

В крепленых винах часть спирта получается при сбражива­нии винограда дрожжами, а часть добавляется. К числу таких вин относятся портвейн, херес и мадера (разд. 3.4.4).

Дальнейшие успехи виноделия будут определяться исполь­зованием более эффективных штаммов винных дрожжей и ком­мерческих препаратов дрожжевых заквасок. Это позволит по­лучать вина особого качества.

3.4.4.  Спирт

Производство перегнанного спирта моложе, чем неперегнанных спиртных напитков, но и его корни теряются в веках. Для по­лучения напитка, содержащего 40% (по объему) спирта, нужна перегонка. Ее и сегодня осуществляют в перегонных аппаратах, представляющих собой модификации устройства, предложенно­го в 1830 г. Коффи и носящего его имя. Различия в сортах спир­товых продуктов зависят в основном от природы сырья, а также от того, подвергался ли конечный продукт выдержке. В спирто­вом производстве используются пригодные для этой цели штам­мы Saccharomyces. Крупные спиртовые заводы всегда ведут свою собственную культуру дрожжей в специальных средах. Выбор штамма дрожжей при производстве спирта определяется их продуктивностью в особых условиях бродящего сусла. Бро­жение должно идти активно с образованием спирта в количест­ве, близком к теоретическому пределу. Хотя в качестве сырья можно использовать разнообразные продукты, некоторые сорта спирта обычно производят из вполне определенных его типов. Так, коньяк, получаемый при перегонке вина, делают из вино­града, а шотландский виски — из ячменного солода. Другие на­питки — американский виски, джин и водку, которые обычно делают из зерна (например, кукурузы), можно производить и на основе другого подходящего сырья. Ром обычно получают из мелассы сахарного тростника или свеклы. Когда сырьем слу­жит зерно (например, пшеницы или кукурузы), до сбраживания необходимо гидролизовать крахмал до сахаров. Так, виски — это продукт перегонки пива без хмеля. Первые стадии процес­са производства виски такие же, что и при приготовлении сус­ла в пивоварении. Однако если применяют кукурузу или другие зерновые, то до приготовления сусла непосредственно в бро­дильных чанах проводят обработку крахмала в зерне фермен­тами солода.

Если для производства спирта используют мелассу, такие предварительные операции не нужны, поскольку углеводы в ней содержатся в форме, пригодной для сбраживания. Тем не менее сырье все же приходится подготавливать к процессу: осветлять, подогревать и разводить водой, чтобы получить концентрацию сахара, оптимальную для брожения. После подготовки сырья добавляют культуру подходящих дрожжей и ведут сбражива­ние. В конце его, когда концентрация спирта достигнет 9—11% (по объему), отделяют дрожжи путем отстаивания. Остатки их перед перегонкой можно удалить центрифугированием. Приме­няются два способа: кубовый и непрерывной перегонки (патент Коффи). После этого продукт либо отправляют на созревание (например, виски), либо проводят завершающие операции и разливают по бутылкам (джин, водка). Для продажи спирто- продукты обычно разводят до стандартной концентрации в них спирта (40% по объему).

Остановимся на некоторых важных особенностях производ­ства отдельных разновидностей спиртопродуктов. Очень важна использовать правильный штамм дрожжей. При выработке ро­ма для производства сортов с сильным запахом обычно приме­няют штаммы дрожжей Schizosaccharomyces, а с менее интен­сивным — быстро работающие Saccharomyces. Отметим, чта процесс образования спирта ускоряется бактериями Clostridium Saccharobutyricum. Самый лучший ром получают в том случае, когда соотношение бактерий к дрожжам составляет 1 :5. Куль­туру бактерий вносят, когда концентрация этанола достигает 3,5-4,5%, а сахара — 6% (вес/объем).

Штаммы дрожжей, используемые в спиртовой промышлен­ности, должны сохранять жизнеспособность вплоть до концент­рации этанола 12—15% (по объему). Кроме того, если в каче­стве сырья используется зерно, дрожжи должны обладать спо­собностью гидролизовать низкие олигосахариды до глюкозы. Это необходимо для полного превращения крахмала в этиловый спирт и углекислый газ.

Перегонка — дорогостоящий этап процесса, так как он энер­гоемок. Использование дрожжей, выдерживающих повышенные концентрации спирта, уменьшает энергозатраты на этом этапе, поскольку для достижения одной и той же концентрации спирта надо отгонять меньше воды. Ожидается, что работа по созда­нию новых штаммов дрожжей, устойчивых к еще более высоким концентрациям спирта, будет успешной.

Пока углеводы не переведены в форму, усваиваемую дрож­жами, брожение не происходит. Добавление гидролизующих крахмал ферментов ускоряет этот процесс. Для этого обычно применяют амилазу из культуральной жидкости штаммов Bacil­lus Subtilis и амилоглюкозидазу, выделяемую из культур грибов штаммов Aspergillis niger и близких форм. Ферменты исполь­зуются и при подготовке сусла, и при спиртовом брожении (см. разд. 3.3.2, где эти вопросы рассматриваются более подробно).

• 3.4.5. Сидр

Сброженный яблочный сок известен под названием сидр. В тех­нологии производства сидра и вина есть много сходного.

Когда делают сидр, яблоки прежде всего измельчают в ка­шицу и отжимают сок. Для этого применяют как прессы, так и другие устройства, работающие на иных принципах. Способы подготовки сока перед брожением весьма разнообразны; он мо­жет использоваться как без обработки, так и после подавления в нем естественной микрофлоры и замещения ее дрожжами подходящих штаммов. Чаще всего к соку добавляют сернистый газ, чем подавляют развитие Kloeckera apiculata, неблагоприятно влияющих на вкус готового сидра. Вслед за этим можно начи­нать брожение. Оно происходит либо при участии диких дрож­жей, либо после добавления дрожжевой культуры-закваски. Требования, предъявляемые к дрожжам при производстве сид­ра, в общем те же, что и в других бродильных процессах: они должны обеспечивать полноту сбраживания, высокую его ско­рость и легко выпадать в осадок. Так как Saccharomyces растут медленно, при крупномасштабном производстве сидра нередко к обработанному сернистым газом соку добавляют те или иные чистые культуры дрожжей. Разные штаммы дрожжей образуют специфические ароматические вещества. Поэтому при производ­стве сидра точно так же, как в пивоварении, можно использо­вать разные штаммы для придания сидру специфического вку­са. Чтобы получить сидр определенного сорта, добавляемые дрожжи должны преобладать над дикими, быстрее размножать­ся и определять конечные свойства продукта. Запуск процесса доминирующей формой дрожжей — один из наиболее широко используемых способов, применяемых при крупномасштабном производстве сидра. Важно, чтобы дрожжи были способны об­разовывать полигалактуронидазу, необходимую для гидролиза деэтерифицированных пектинов до галактуроновой кислоты. В противном случае в конце брожения сидр не просветляется. Для просветления сидра нередко добавляют гидролизующие пектин ферменты, включая полигалактуронидазу; их получают из грибов (разд. 3.7.3).

Для подавления развития всех штаммов дрожжей, кроме нужных для ферментации, при производстве сидра применяют сернистый газ по той же схеме, что и в виноделии. Если не за­ботиться о чистоте аппаратуры и не применять газ, дикие дрож­жи могут размножиться и вытеснить культурные. При выборе конкретного штамма дрожжей нужно также учитывать, какие вкусовые вещества они передадут образующемуся продукту; можно получить сидр как с небольшим, так и с заметным со­держанием сивушных масел. Для придания сидру необходимых качеств нужно использовать определенный штамм дрожжей.

По завершении брожения сидр отделяют от дрожжей и осветляют. Поскольку в сидре есть яблочная кислота, то, как и в вине, в нем может начаться яблочно-молочнокислое броже­ние. Такое брожение не идет, если сидр очень кислый или его держат на холоде.

Как и в случае пивоварения, развитие производства сидра будет определяться селекцией новых штаммов дрожжей, позво­ляющих получать продукты со свойствами, отвечающими вку­сам разных потребителей.

• 3.4.6. Уксус

Хотя уксус и не принадлежит к алкогольным напиткам, мы ре­шили остановиться на его производстве в этом разделе, посколь­ку одна из двух стадий его получения включает спиртовое бро­жение.

Уксус — это продукт, содержащий не менее 4% (вес/объем) уксусной кислоты; его получают с помощью двухстадийного процесса. Вначале осуществляют спиртовое брожение, в ходе которого сахар сырья превращается в спирт при участии S. се- reυisiae. Сырьем может быть любой продукт, который сбражи­вается с образованием спирта. После завершения этого этапа дрожжам дают осесть и собирают надосадочную жидкость. Содержание спирта доводят до 10—13%, и, если в ходе броже­ния для подавления роста бактерий добавлялся сернистый газ, его перед дальнейшими операциями удаляют. На следующем этапе этиловый спирт превращается в уксусную кислоту (про­межуточным продуктом является ацетальдегид). Все процессы получения уксуса идут при участии смешанных культур Aceto- bacter∙, в некоторых случаях применяют закваски. На этой стадии основную роль играют бактерии A. Schuetzenbachii, A. curvim, A. Orleanense и близкие к ним микроорганизмы. Брожение про­исходит в аэробных условиях с потреблением больших коли­честв кислорода и выделением тепла. Ранее этот второй процесс шел медленно, но его удалось усовершенствовать и увеличить конверсию этилового спирта в уксусную кислоту. Метод глубин­ной ферментации в этом производстве применить долгое время не удавалось. Проблему удалось решить лишь после второй мировой войны: этому помогли исследования по аэрации куль­тур при производстве антибиотиков. Сегодня эта технология нашла широкое применение.